Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di alterare l'espressione genica nel sistema nervoso centrale embrionale del neurone. Ciò si ottiene ottenendo prima femmine gravide cronometrate e preparandole per l'intervento chirurgico. Le corna uterine vengono quindi esposte generando un'incisione addominale.

Una volta che gli embrioni sono esposti, il DNA viene iniettato nel ventricolo laterale, nel terzo ventricolo o nello spazio sottoretinico. La fase finale della procedura consiste nell'applicare una corrente elettrica all'embrione attraverso la parete uterina, orientando gli elettrodi a paletta in modo tale che il polo positivo sia posizionato sopra il sito di trasfezione preferito. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la proliferazione, la migrazione e la differenziazione dei neuroprogenitori nel kelon morente tline e nella retina attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica o dei metodi esistenti, come la degenerazione dei topi transgenici, è che è rapida, consente studi di produttività più elevati e ha un costo inferiore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo neurale, come ad esempio quali geni regolano il progenitore neurale, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare, la differenziazione neuronale e la migrazione cellulare. Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi verso una migliore comprensione dei percorsi genetici che hanno sottolineato i difetti nello sviluppo del SNC, molti dei quali provocano deterioramento cognitivo e sono disturbi comportamentali nell'uomo Oltre alla sua utilità nella comprensione dello sviluppo del sistema nervoso centrale.

Questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi di organi come il sistema nervoso periferico in via di sviluppo, il cuore e la placenta. Può anche essere applicato per studiare modelli di malattia nei topi e in altri organismi modello come pulcini e xip. In generale, l'ostacolo principale al successo per le persone che non conoscono questa tecnica è l'embrione È necessario prestare attenzione alla sopravvivenza durante la manipolazione, l'iniezione e l'estrazione degli embrioni.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando avevamo bisogno di un mezzo rapido per manipolare l'espressione genica nell'embrione, nel telencefalo e nella retina. Abbiamo sviluppato questa tecnica nel nostro laboratorio modificando la tecnica inizialmente descritta da Sal, pubblicata sulla rivista Developmental Biology nel 2001. Abbiamo anche lavorato con un laboratorio di crash per stabilire questo protocollo anche nel dilon in via di sviluppo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di iniezione ed elettroporazione sono difficili da imparare perché richiedono una manipolazione molto attenta degli embrioni e i siti di iniezione a volte possono essere molto piccoli. Esempio, lo spazio sottoretinico A dimostrare la procedura oggi sarà Rajiv, un postdoc del laboratorio Sherman per iniziare a pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Quindi, riempire le siringhe con soluzione salina e soluzione di ringer lattato e posizionarle su un termoforo per riscaldarle nell'area chirurgica.

Sterilizzare un termoforo con etanolo al 70%, quindi coprirlo con una garza sterilizzata e senza garza. Impostare il termoforo a 37 gradi Celsius. Posizionare l'animale in una piccola camera di anestesia e anestetizzarlo erogando il 5% di fluoro con ossigeno a un litro al minuto attraverso un vaporizzatore.

Assicurandosi di raccogliere l'isof di scarico del fluoro utilizzando un sistema di lavaggio. Una volta che la respirazione dell'animale è profonda e regolare, rimuovilo dalla camera. Usa i riflessi di pizzicare le dita dei piedi e sbattere le palpebre.

Per garantire un'anestesia completa. Posizionare l'animale anestetizzato sulla pancia e utilizzare un tubo respiratorio per erogare il 2,25% di ghiaccio di fluoro durante l'intervento chirurgico. Iniettare buprenorfina a una concentrazione di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo per via sottocutanea sulla nuca.

Continuare a monitorare la respirazione dell'animale e, se necessario, regolare il flusso di fluoro esofag. Quindi fissare con nastro adesivo il torace dell'animale anestetizzato e controllare nuovamente la risposta di retrazione pizzicando la zampa posteriore con una pinza smussata. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, stendere uno spesso strato di crema sull'addome assicurandosi che la parte inferiore del pelo sia completamente ricoperta.

Lasciare agire la crema per circa tre minuti e controllare a intermittenza la depilazione. Usando un tampone sterile, bagna una garza sterile con acqua sterile e pulisci i peli dall'addome. Quindi, sterilizzare il sito di incisione con clorexidina e altra acqua.

Asciugare l'addome con una garza sterile pulita. Ripetere questo passaggio con etanolo al 70% utilizzando una garza di cotone fresca sterilizzata. Preparati per l'intervento chirurgico indossando un abito chirurgico per esporre le corna uterine.

Innanzitutto, individua l'alba lineare come la linea debole sotto la pelle sulla linea mediana Usando una pinza, allontana la pelle dalla parete addominale e taglia una piccola incisione diritta dalla metà dell'addome verso il basso con le forbici per la pelle usando una pinza curva e le forbici. Ripetere il processo con il peritoneo. Afferrare il peritoneo con la pinza.

Tirare via e poi praticare un'incisione abbastanza grande da far passare l'utero. Posizionare una garza sterile con una piccola fessura verticale sull'incisione e inumidirla con soluzione fisiologica sterile calda. Quindi, fai scorrere la pinza nell'incisione e individua l'utero che tiene aperta l'incisione con la pinza.

Afferrare l'utero tra il primo e il secondo embrione visibile e tirare entrambi i lati delle corna uterine sulla garza. Conta il numero di embrioni notando eventuali riassorbimenti o embrioni con dimensioni corporee ridotte. Per preparare il numero corretto di iniezioni di DNA, bagnare le corna uterine con soluzione fisiologica e rimettere con cura un corno uterino nell'addome.

Per detestare gli aghi chirurgici, utilizzare una pipetta tirata verso l'alto con un bocchino attaccato per aspirare 10 microlitri di tre milligrammi per millilitro. Soluzione di DNA priva di endotossine contenente colorante verde metile ed espulsione del DNA in un ago chirurgico. Montare il primo ago riempito sul micromanipolatore.

Stare attaccato all'iniettore a partire dall'embrione più vicino all'ovaio. Usa una pinza circolare per girare delicatamente l'embrione all'interno della decidua in modo che sia posizionato a faccia in avanti, consentendo alle iniezioni di avvenire in un rotolo ROS in direzione cordale. Utilizzando una sorgente luminosa a fibre ottiche per identificare la linea mediana del cervello embrionale.

Si notino i grandi ventricoli laterali affiancati nelle regioni rostrali. Tenere l'embrione in posizione utilizzando una pinza curva e posizionare l'ago chirurgico riempito sopra l'utero in modo tale che l'angolo di ingresso nel cervello sia di circa 45 gradi. Con un movimento rapido e costante, gira la manopola sul micro manipolatore per inserire la punta dell'ago attraverso la parete dell'utero e nel ventricolo laterale del cervello embrionale.

Quindi, premere il poggiapiedi del micro iniettore. Per iniettare la soluzione di DNA, un'iniezione riuscita è facilmente visualizzabile diffondendo il colorante verde metile in tutti i ventricoli cerebrali embrionali. Ora che il DNA è stato iniettato, tira lentamente l'ago verso l'alto per rimuoverlo senza causare rotture.

Posizionare l'embrione iniettato sulla garza sterile e bagnarlo accuratamente con soluzione fisiologica calda. Afferrare l'utero con il polo positivo dell'elettrodo a paletta posizionato sopra il sito di trasfezione desiderato. Quindi erogare cinque impulsi elettrici quadrati da 40 a 50 volt e 50 millisecondi a una velocità di un impulso al secondo.

Coprire l'embrione iniettato ed elettro classificato con una garza protettiva umida, quindi continuare con l'iniezione dell'embrione successivo. Al termine dell'iniezione e dell'elettrostimolazione di tutti gli embrioni desiderati nel corno uterino, spingerlo con cautela nella cavità del corpo. Rimuovere il secondo corno uterino per iniziare l'iniezione e l'elettroporazione degli embrioni rimanenti.

Una volta che tutti gli embrioni sono tornati all'interno dell'utero, aggiungi due o tre millilitri di soluzione salina calda alla cavità addominale, quindi rimuovi la garza dall'addome per rivelare i lati del peritoneo. Usa un filo di seta intrecciato nero per suturare il peritoneo ancorando il filo sul peritoneo più vicino allo sterno e procedendo a cucire lontano dall'ancora. Assicurarsi che tutte le suture siano strette e che nessun organo sottostante o pelle sia cucito nel peritoneo.

Agganciare la linea di sutura rimanente e gettarla. Chiudere la pelle sopra la linea di sutura con una pinza utilizzando le graffette di chiusura della pelle. Agganciare la pelle facendo attenzione a non pinzare la linea di sutura sottostante o a tirare la pelle troppo stretta.

Una volta terminato, assicurarsi che le graffette siano strette premendo delicatamente insieme allo strumento di sutura qui, il vettore di espressione A-P-C-I-G due che guida l'espressione della GFP è stato elettroporato nella neocorteccia in via di sviluppo a E 12. Man mano che lo sviluppo neocorticale procede, i progenitori apicali si differenziano in progenitori basali secondari o in neuroni post-mitotici e continuano ad esprimere GFP. Queste cellule neurali possono quindi essere analizzate per l'espressione di marcatori tipici del sottotipo neurale mostrato in rosso.

In questa vista venale di un proencefalo di un embrione elettroporato a E 12 e sezionato a E 14, il sito elettroporoso è indicato dall'epifluorescenza verde di E 14. L'espressione di GFP è osservata nel talamo, nel pretalamo e nell'ipotalamo, indicando che i territori licici morenti sono stati trasfettati con successo. Il cruscotto segna la posizione della sezione attraverso una zona ventricolare.

Uno sguardo più attento alla zona ventricolare mostra la migrazione delle cellule GFP fuori dalla zona ventricolare e nella zona del mantello. Dove si formeranno i nuclei ipotalamici, anche la retina embrionale è prontamente elettroporata, come mostrato in questa sezione coronale, attraverso un elettroporazione E 16,5 I con PCIC a E 15,5. Qui, l'accumulo di cellule m cherry positive è specifico per lo strato esterno dei neuroblasti e non si vede nelle tre cellule gangliari retiniche B positive nello strato di cellule gangliari Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se non si verificano complicazioni impreviste.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare tecniche sterili adeguate, una mano ferma durante la manipolazione degli embrioni e avere tutto il materiale necessario pronto prima di mettere la femmina incinta sotto anestesia. Seguendo questa procedura, gli embrioni elettrotrecciati possono essere lasciati vivere fino all'età adulta, a quel punto possono essere eseguiti altri metodi come saggi comportamentali e funzionali per rispondere a ulteriori domande relative a come la manipolazione di alcuni geni nell'embrione influisce sulla funzione neuronale nell'adulto. Sin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo del SNC per esplorare la funzione genica in vivo nel topo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come introdurre il DNA estraneo nel tubo neurale embrionale. In particolare, ti mostriamo come preparare una donna incinta per l'intervento chirurgico. Esporre l'utero, iniettare il DNA ed elettrolizzare l'embrione.

Non dimenticare che lavorare con il fluoro isof può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni come un sistema di lavaggio.