Name: Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Impara l'elettroporazione in utero per la consegna genica nel sistema nervoso centrale embrionale. Questa tecnica consente di studiare la proliferazione e la differenziazione dei progenitori neurali con controllo spaziale e temporale.

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Gli autori desiderano ringraziare Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach per il loro lavoro iniziale per stabilire nella tecnologia di elettroporazione utero in laboratorio CS. Questo lavoro è stato finanziato da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzioni (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging squadra di Grant (00933-000) per CS e bambini Alberta Hospital Research Foundation Grant a DMK. RD è stato sostenuto da una borsa di studio CIHR Speranza Canada, RC è supportato da un Studentship FFB e LML è stato sostenuto da una borsa di formazione CIHR in Genetica e sviluppo del bambino.

1. Set-up <ol><li> Set-up dell'area chirurgica come mostrato in fig. 1A, A '. I componenti chiave del set-up includono un Eppendorf FemtoJet microinjector, micromanipolatore Narishige con porta aghi, steromicroscope Leica, sistema di illuminazione a fibre ottiche, Piazza del sistema ECM 830 Elettroporazione onda con gli elettrodi, piastra elettrica e un vaporizzatore per isoflurano anestetico. </li><li> Pulire gli attrezzi con un pulitore ad ultrasuoni BRANSONIC utilizzando Metriclean2 soluzione a bassa formazione di schiuma per sonicating strumenti chirurgici. Sterilizzare gli strumenti in autoclave. Strumenti sterilizzati sono poi tenuti in Germex. </li><li> Preparare le siringhe con caldi soluzione fisiologica sterile e sterile Ringer lattato soluzione. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Animale svolge all'interno di un piccolo (12cm x 20cm) anestetico da camera. Utilizzando un vaporizzatore, consegnare il 5% anestetico isoflurano e ossigeno a 1L/min (fig. 1 A, A '). In particolare, è importante raccogliere scarico isoflurano utilizzando un sistema di evacuazione fumi. </li><li> Rimuovere animale dalla camera quando il respiro diventa profondo e regolare. Pizzicare le dita dei piedi e test di riflessi batter d'occhio sono utilizzate per garantire l'anestesia totale. </li><li> Posizionare il mouse incinta sul dorso sopra una piastra elettrica (37 ° C). La piastra elettrica è prima sterilizzato strofinando con etanolo al 70%, e viene poi coperto con un sterilizzato, garza lintless. Utilizzare un tubo respiratore e apparecchi maschera per fornire isoflurano (2,25%) durante l'intervento chirurgico. </li><li> Iniettare buprenorfina (peso corporeo 0.1mg/kg) per via sottocutanea sotto la pelle alla nuca. </li><li> Monitor animali in tutta la chirurgia per la respirazione profonda e regolare. L'animale non deve respiro, respirare superficialmente o rapidamente. Poco profondo, la respirazione veloce può essere un segno di luce anestesia, e il flusso di isoflurano dovrebbe essere aumentato. Se l'animale comincia a boccheggiare, ridurre il flusso di isoflurano. Nel caso di un arresto respiratorio, spegnere isoflurano, e aumentare il flusso di ossigeno fino animale recupera. Riavviare isoflurano ad una concentrazione inferiore. </li></ol> 3. Preparazione degli animali per la chirurgia <ol><li> Nastro zampe anteriori di animali per il termoforo e controllare di nuovo per una risposta ritrattazione da pizzicare il piede posteriore con pinza contundente. </li><li> Usando un tampone di cotone sterile a punta, si sviluppa uno spesso strato di crema depilatoria (cioè, Nair) sul ventre. A colpi di azienda, assicurare il sottopelo è completamente rivestita. Lasciare agire per una media di tre minuti, controllando in modo intermittente con un tampone sterile pulito per la depilazione. Bagnate un tampone di garza sterile con acqua sterile e asciugare l'addome fino a quando tutte le tracce sono scomparse. Ripetere con clorexidina (cioè Stanhexidine) pelle più pulita e più acqua. Asciugare l'addome con garza pulita e sterile. </li><li> Sterilizzare sito di incisione con clorexidina (cioè Stanhexidine), seguito da più acqua sterile. Asciugare l'addome con garza pulita e sterile. Ripetere questo passaggio utilizzando etanolo al 70% e un fresco, tampone di cotone sterilizzati. </li><li> Posizionare un tampone di garza sterile sopra l'addome con una fessura nel mezzo attraverso il quale le corna uterine sarà tirato durante l'intervento. </li></ol> 4. Incisione ed esposizione di corni uterini <ol><li> Per esporre le corna uterine, in primo luogo individuare la linea alba come la linea debole sotto la pelle sulla linea mediana. Utilizzando pinze, tirare la pelle dalla parete addominale e tagliate una piccola incisione direttamente dalla metà verso il basso addome con le forbici pelle (circa 1 cm di lunghezza). </li><li> Uso di pinze e forbici curve, ripetere il processo con il peritoneo. </li><li> Luogo garza sterile con una piccola fessura verticale sopra incisione e smorzare riscaldato con soluzione salina sterile. </li><li> Far scorrere pinze in incisione e individuare l'utero. Tenere incisione aperta con una pinza e rimuovere le corna uterine. </li><li> Afferrare l'utero tra gli embrioni prima e la seconda visibile ed estrarre gli embrioni sulla garza. Rimuovere entrambi i lati delle corna uterine, ponendo sulla garza sterile e contare il numero di embrioni, notando alcun riassorbimento o "non sani" (ad esempio dimensioni del corpo più piccolo) embrioni. Bagnare le corna uterine con soluzione salina e con cura la metà di ritorno dell'utero nell'addome. </li></ol> 5. L'iniezione di DNA in ventricoli <ol><li> Aghi chirurgici sono preparati con un estrattore Sutter Flaming Micropipetta usando micropipette borosilicato con capillari (Programma: calore = 750, Pull = 30, Vel = 90, Tempo = 150). Utilizzando una lama bisturi sterile, la punta dell'ago è leggermente rasato con un angolo di 45 gradi. </li><li> Per caricare l'ago, pipette Pasteur sono tirati ad un diametro stretto sotto una fiamma. Un pezzo bocca è collegata alla pipetta carico di elaborare ~ 10 ml di 3mg/ml privo di endotossine DNA mescolato con 0,01% metil verde (nota: metil colorante verde consente iniezioni di DNA da visualizzare). L'ago viene poi riempito montato su un supporto micromanipolatore e attaccato all'iniettore FemtoJet. </li><li> Partendo con l'embrione più vicino al ovaio, circolare forcipevengono utilizzati per trasformare delicatamente l'embrione all'interno della decidua in modo che sia posizionato "faccia avanti", permettendo iniezioni a verificarsi in un rostrale alla direzione caudale. Una fonte di illuminazione a fibre ottiche per l'illuminazione è usato per aiutare a visualizzare la linea mediana del cervello embrionale, che viene affiancata dalla grande ventricoli laterali nelle regioni rostrale (Fig. 1B, B '). </li><li> L'embrione viene tenuto in posizione mediante pinze circolare. L'ago è posizionato sopra l'utero in modo che l'angolo di entrata nel cervello è di circa 45 gradi. Utilizzando il micromanipolatore, e un movimento veloce e costante, la punta dell'ago viene inserito attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale dell'embrione. Le iniezioni sono diretti verso i ventricoli laterali, terzo ventricolo o spazio sottoretinico di indirizzare la, diencefalo e telencefalo retina, rispettivamente. Si noti che le vescicole cerebrali embrionali sono aperte primi stadi embrionali tale che il DNA iniettato nei ventricoli laterali fluirà nel ventricolo 3 °. </li><li> Premere il pedale per iniettare privo di endotossine DNA (1-3 mL) con un Eppendorf FemtoJet microinjector. Un'iniezione di successo è facilmente visualizzabile attraverso la diffusione del colorante verde metile in tutto i ventricoli del cervello embrionale. L'ago viene poi lentamente rimosso da redazione il backup per evitare la rottura. </li></ol> 6. Elettroporazione <ol><li> L'embrione iniettato (ancora all'interno dell'utero) è posto sulla garza sterile sovrastante sull'addome della madre e bagnate abbondantemente con soluzione salina riscaldata. ** Si prega di notare l'aggiunta di soluzione fisiologica alla superficie della membrana è essenziale per consentire il passaggio efficiente di una corrente elettrica. </li><li> GenePaddle elettrodi vengono utilizzati per afferrare l'utero dopo l'iniezione del DNA. Cinque impulsi elettrici piazza di 40-50V e 50 ms sono consegnati al ritmo di un impulso al secondo utilizzando un sistema di elettroporazione BTX ECM8300 (Fig. 1C, C '). </li><li> Coprire l'embrione iniettato / elettroporate con protezione garza umida e continuare per l'embrione successiva. </li><li> Al termine della iniezione / elettroporazione di tutti gli embrioni desiderati, spingere con attenzione le corna uterine nuovamente dentro l'addome (Fig. 1D). </li><li> Rimuovere con attenzione l'altro corno uterino e ricominciare con l'embrione più vicino al dell'ovaio. </li></ol> 7. Sutura e pinzatura <ol><li> Una volta che tutti gli embrioni sono tornati dentro l'utero, aggiungere alla cavità addominale ~ 2-3 ml di soluzione salina calda. </li><li> Per chiudere la ferita, iniziare rimuovendo il velo sul ventre e identificare i lati del peritoneo. Iniziare la sutura del peritoneo con linea nera di seta intrecciata. Non è raccomandato l'uso di fili riassorbibili per questa procedura in quanto è generalmente più debole e può portare a sanguinamento post-operatorio e infezioni. Ancorare la linea sul peritoneo più vicina allo sterno e procedere al punto di distanza dal ancoraggio. Assicurarsi che tutte le suture sono stretti, e che non gli organi sottostanti o pelle è stata inavvertitamente cucito nel peritoneo. Agganciare la linea di sutura rimanente e scartare. </li><li> Tirare la pelle chiuso oltre la linea di sutura con una pinza. Reflex con 9 millimetri ™ pelle chiusura a punti metallici, clip la pelle sopra la ferita, facendo attenzione a non graffetta sottostante linea di sutura, o per tirare la pelle troppo stretto. Il metodo preferito è quello di tenere la pelle in alto e lontano dal corpo con una pinza, e sono disponibili in un angolo di 90 gradi con lo strumento di base. Continuare fino ferita è chiuso (circa tre punti). Una volta finito, garantire graffette sono stretti premendo delicatamente con lo strumento di sutura (Fig. 1D '). </li></ol> 8. Post-chirurgica Cura <ol><li> Per monitorare il recupero anestetico, girare femminile sullo stomaco e spegnere isoflurano. Mantenere volto dell'animale all'interno del respiratore, trasformare l'ossigeno fino al 3% per contribuire alla ripresa dall'anestesia. L'animale deve essere collocato su un blocco pulita garza sulla parte superiore della piastra elettrica per prevenire l'ipotermia. </li><li> Mentre l'animale è groggy, iniettare 2 ml di Ringer soluzione per via sottocutanea sotto la pelle del collo dell'animale. </li><li> Continuare a tenere l'animale in condizioni di flusso di ossigeno per alcuni minuti e garze riscaldamento al fine di risvegliare l'animale. Verificarsi brevi spruzzi di movimento da l'animale deve essere osservato come si ritorna a un modello di respirazione normale. Osservare per alcuni minuti fino a quando animale sembra cosciente e sveglio. </li><li> Spray addome della femmina con gentamicina spray e avvolgere l'animale in una garza sterile. </li><li> Trasferire l'animale in una gabbia sterile con biancheria da letto in autoclave e custodia di cartone. </li><li> Bottiglie d'acqua devono essere accuratamente puliti, sterilizzati e riempita con acqua sterile. A 500 ml di acqua aggiungere 2 ml di antibiotico sulfamethazine (25% azioni). </li><li> Somministrare 0,05 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina la chirurgia mattino seguente. </li><li> Monitorare da vicino la femmina per le prime 24 ore post-operatorie. Se gli animali vengono tenuti più di 24 ore, le femmine vengono spostati ster nuovogabbie ile il giorno 2. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati Neocorteccia La neocorteccia è la regione del sistema nervoso centrale che è responsabile per l'elaborazione visiva e senso-motori e più alto funzionamento cognitivo. E 'composto da neuroni di proiezione glutammatergica e interneuroni GABAergici che derivano dal telencefalo dorsale e ventrale, rispettivamente. Per affrontare i ruoli dei diversi geni nello sviluppo neocorticale, usiamo elettroporazione in utero a uno misexpress o bloccare l'espressione (ad esempio, attraverso l'uso di costrutti shRNA) di geni diversi nella dorsale o ventrale telencefalo 1,3,4. Per misexpress geni nel telencefalo embrionale, usiamo un vettore di espressione bicistronic (pCIG2), contenente un CMV βactin promotore-enhancer e un sito interno ingresso ribosoma (IRES) con capacità di proteina fluorescente verde (EGFP; in pCIG2) cassetta, permettendo transfettate cellule per essere rilevato da epifluorescenza (Fig. 2A-C). Abbiamo utilizzato questa tecnologia per introdurre i costrutti di espressione nel telencefalo da E11.5 a E15.5 (dati riportati sono a E12.5;. Fig. 2). Consentendo di sviluppare embrioni diversi giorni post-elettroporazione, siamo in grado di monitorare la differenziazione e la migrazione di GFP-etichettata progenitori. Come procede la differenziazione, 3 giorni dopo l'elettroporazione GFP + cellule si differenziano e migrano dalla zona ventricolare (VZ), zona subventricolare (SVZ) e la zona intermedia (iz) e nella piastra corticale (cp;. Fig. 2C). Se il cervello elettroporate a E12.5 vengono analizzati dopo 24 ore, siamo in grado di monitorare eventi precedenti nella maturazione progenitrici e migrazione neuronale dal co-etichettatura con i marcatori dei progenitori apicale (cioè, Pax6;. Fig. 2A), progenitori basale (cioè, Tbr2; . Fig. 2B) e postmitotic neuroni neocorticale (cioè, Tbr1;. Fig. 2C). Diencefalo L'ipotalamo è alla base ventrale del sistema nervoso centrale e funge da gateway tra il sistema endocrino e sistema nervoso autonomo. Durante lo sviluppo, i nuclei multipli che compongono l'ipotalamo maturo differenziano da una zona progenitore comune che riveste la regione più ventrale del diencefalo embrionale. Attualmente, le vie molecolari che regolano la proliferazione delle cellule progenitrici, la differenziazione neuronale e la formazione dei nuclei ipotalamici sono poco conosciuti. Abbiamo usato elettroporazione in utero ad obiettivo di espressione genica giornalista al diencefalo embrionale, iniettando il DNA nel 3 ° ventricolo di E12 embryos.We poi seguito la distribuzione di GFP nel differenziare in neuroni E14. Con questa metodologia, abbiamo mirato con successo espressione GFP al talamo, pre-talamo e ipotalamo (Fig. 3A). Analisi di sezioni coronali rivela che siamo riusciti a mirati espressione GFP alle cellule progenitrici che rivestono la zona ventricolare del 3 ° ventricolo e neuroni che migrano verso la zona di mantello per formare nuclei (Fig. 3B) Retina La retina è lo strato neurale dell'occhio, responsabile della conversione fotoni di luce in impulsi elettrici trasmessi al cervello. Si sviluppa come un outpocketing del diencefalo embrionale, e quindi, è derivato dal tubo neurale. La retina neurale si sviluppa da un compartimento progenitore apicale che si trova adiacente allo spazio sottoretinico, una cavità che separa l'occhio dal mesenchima testa. Targeting costrutti di DNA per cellule progenitrici della retina richiede pertanto che le iniezioni sono fatte in una piccola area di destinazione. Utilizzando micromanipolatori, siamo riusciti a bersaglio con successo questa piccola area in embrioni a E13.5 E15.5 (indicato è E15.5 electroporations di PCIC con la giornalista mCherry; Fig. 4).. Se elettroporate retina vengono esaminati 24 ore post-trasfezione, si osserva che la maggior parte delle cellule + mCherry si trovano nello strato esterno neuroblasti (onbl), dove si trovano progenitori divisione, e non nello strato delle cellule gangliari della retina (GCL; immagine nel riquadro), dove le cellule postmitotic localizzare. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Introduzione al elettroporazione utero set-up e metodologia. (A) I componenti chiave del set-up chirurgico includono un Eppendorf FemtoJet microinjector (1), micromanipolatore Narishige con porta aghi (2), steromicroscope Leica (3), illuminazione a fibre ottiche sistema (4), 830 ECM Onda quadra sistema di elettroporazione con elettrodi (5) e piastra elettrica (6). (A ') L'animale viene anestetizzato con un vaporizzatore per isoflurano anestetico. (B, B ') In breve, dopo l'anestesia, le corna uterine sono esposti e DNA mescolato con verde veloce è iniettato nel cervello vescicole embrionali. Un'iniezione di successo viene visualizzato tenendo traccia del digiuno colorante verde (B '). (C, C ') Dopo che il DNA è iniettato con successo, gli elettrodi pagaia sono posti ai lati dell'utero, positioning l'embrione in modo che il DNA sarà tirato verso il polo positivo nella regione del cervello di scelta. (D, D ') Una volta che tutti gli embrioni desiderati vengono iniettate, l'utero è spinto indietro nell'addome (D), il peritoneo viene suturata, e la pelle è cucito con punti metallici (D'). La femmina incinta è poi permesso di recuperare e elettroporate i cuccioli vengono raccolti presso i punti di tempo desiderato. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esempio rappresentativo di dorsale elettroporazione telencefaliche. (AC) Micrografia di una sezione coronale attraverso un telencefalo dorsale E13.5 elettroporate a E12.5 con pCIG2. Elettroporate cellule GFP + vengono analizzati per la loro espressione di marcatori di cellule progenitrici apicale (Pax6 +, rosso, A), progenitori basale (Tbr2 +, rosso, B) e neuroni postmitotic (Tbr1 +, rosso, C). cp, corticale piastra; SVZ, zona subventricolare, vz; zona ventricolare. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Esempio rappresentativo di elettroporazione diencefalo. (A) Una vista ventrale di un cervello E14 che è stato elettroporate a E12 con pCIG2. GFP epifluorescenza è visibile nel talamo, pre-talamo e ipotalamo, a dimostrazione della diffusione del pCIG2 microiniettati plasmide in tutto il 3 ° ventricolo. (B) Micrografia della sezione coronale del cervello attraverso elettroporate, dimostrando la migrazione di cellule GFP + fuori dalla zona ventricolare e nella zona del mantello, in cui nuclei ipotalamici formeranno. 3V, terzo ventricolo; T, talamo, Hy, l'ipotalamo, mz, mantello zona; Tel, telencefalo; Pret, prethalamus; vz, zona ventricolare. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Esempio rappresentativo di elettroporazione della retina. Sezione coronale attraverso un occhio E16.5 elettroporate con PCIC a E15.5 che mostra l'accumulo di cellule mCherry + neuroblasti dello strato esterno e non in Brn3b + cellule gangliari della retina nello strato delle cellule gangliari. L'inserto è un'immagine più alto ingrandimento della zona in scatola. GCL, strato delle cellule gangliari della retina, le, lente; onbl, neuroblasti strato esterno; re, retina.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In utero elettroporazione può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di processi di sviluppo. Per esempio, la trasfezione di geni reporter come GFP, mCherry o della fosfatasi alcalina può essere utilizzato per condurre esperimenti di lineage tracing e migrazione neuronale. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere transitoriamente espresso per eliminare selettivamente un allele floxed in un spazialmente e / o temporalmente modo controllato. Inoltre, shRNA o dominante costruisce negativo può esser...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Categoria </th></tr><tr><td> Forbici </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Forbici iris, curva </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicato Porta aghi </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Anello pinze, 9mm </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Occhio spogliatoio Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Tessuto pinza-Adson </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Reflex applicatore clip </td><td> Strumento di precisione mondo </td><td> 500343 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Mestolo forato, 15 mm di diametro </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Di seta nera intrecciata sutura </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Reflex pelle Chiusura in acciaio inossidabile ferita clip </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500346 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> ECM 830 Onda quadra sistema di elettroporazione </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinzetta w / Variabile Gap 2 Giornata 5 millimetri elettrodi Piastra Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinzetta w / Variabile Gap 2 Giornata 7 millimetri elettrodi Piastra Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Comando a pedale per Eppendorf FemtoJet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> BRANSONIC modello Ultrasonic Cleaner 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995 CPN-534-952-118 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipetta Puller </td><td> Sutter strumento, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipette - borosilicato con filamento OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm di lunghezza </td><td> Sutter strumento </td><td> BF100-78-10 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> 3-Axis Manipolatore Coarse </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Tenendo dispositivo magnetico per micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> M1 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Piastra di base in acciaio per micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5052 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipetta Holder </td><td> Pr mondoDECISIONE Instruments </td><td> MPH3 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipetta maniglia </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5444 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Vaporizzatore per anestetici isoflurano </td><td> Porter Strumenti Azienda </td><td> MODELLO 100-F </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Metriclean2 soluzione a bassa formazione di schiuma per sonicating strumenti chirurgici </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml in 0,2 g di blu di metilene spruzzo antibiotica dopo la sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Germex per sterilizzare gli strumenti chirurgici </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> BNP pomata oftalmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuito da Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> disponibili in commercio </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v pelle pulita </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Buprenorfina (Temgesic) analgesico </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Sulfamidici &quot;25&quot; sulphamethazine antibiotico orale </td><td> Professionale Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Ringer lattato soluzione </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Saline - sodio cloruro 0,9% </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Inalazione anestetico - isoflurano USP </td><td> Partner farmaceutica del Canada Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Verde fast FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr></tbody></table>

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

La capacità di manipolare l&#39;espressione genica è la pietra angolare della moderna embriologia giorno sperimentale, che porta alla spiegazione di molteplici vie di sviluppo. Diverse tecnologie potenti e ben consolidata transgenici sono a disposizione per manipolare i livelli di espressione genica nel topo, consentendo la generazione di entrambi perdita e guadagno di funzione dei modelli. Tuttavia, la generazione di topo transgenici è sia costoso e richiede tempo. Metodi alternativi di manipolazione genetica sono stati quindi ampiamente ricercato. In utero elettroporazione è un metodo di consegna del gene in embrioni di topo 1,2 vivere che abbiamo adattato con successo 3,4. È in gran parte sulla base del successo nel campo delle tecnologie di elettroporazione ovo che sono comunemente utilizzati in pulcino 5. In breve, il DNA è iniettato nei ventricoli aperto di sviluppo del cervello e l&#39;applicazione di una corrente elettrica provoca la formazione di pori transienti nelle membrane cellulari, permettendo l&#39;assorbimento del DNA nelle cellule. Nelle nostre mani, gli embrioni possono essere efficacemente elettroporate fin dal giorno embrionale (E) 11,5, mentre l&#39;orientamento dei giovani embrioni richiederebbe un eco-guidata protocollo microiniezione, come descritto in precedenza 6. Al contrario, E15.5 è l&#39;ultima tappa si può facilmente electroporate, a causa della insorgenza di differenziazione dell&#39;osso parietale e frontale, che ostacola microiniezione nel cervello. Al contrario, la retina è accessibile fino alla fine di embriogenesi. Gli embrioni possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento durante il periodo embrionale o postnatale precoce. L&#39;iniezione di un costrutto giornalista facilita l&#39;identificazione delle cellule transfettate. Ad oggi, l&#39;elettroporazione in utero è stata più utilizzata per l&#39;analisi dello sviluppo neocorticale 1,2,3,4. Studi più recenti hanno preso di mira la retina embrionale 7,8,9 e 10,11,12 talamo. Qui vi presentiamo una versione modificata del protocollo di elettroporazione in utero, che può essere facilmente adattato a bersaglio diversi domini del sistema nervoso embrionale. Noi dimostrare che utilizzando questa tecnica, si può avere come bersaglio l&#39;embrionale telencefalo, diencefalo e della retina. Risultati rappresentativi sono presentati, in primo luogo che mostra l&#39;uso di questa tecnica per introdurre costrutti espressione del DNA nei ventricoli laterali, che ci permette di monitorare la maturazione progenitrici, la differenziazione e la migrazione nel telencefalo embrionale. Mostriamo anche che questa tecnica può essere usata per bersaglio del DNA per i territori circostanti diencefalo il 3 ° ventricolo, consentendo le rotte migratorie di differenziarsi in neuroni dei nuclei diencefalo da monitorare. Infine, abbiamo dimostrato che l&#39;uso di micromanipolatori ci permette di introdurre con precisione i costrutti del DNA in aree bersaglio piccolo, incluso lo spazio sottoretinico, che ci permette di analizzare gli effetti della manipolazione dell&#39;espressione genica per lo sviluppo della retina.

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

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La capacità di manipolare l'espressione genica rappresenta la pietra angolare dell'embriologia sperimentale moderna, avendo permesso l'elucidazione di molteplici processi di sviluppo...

L'obiettivo generale di questa procedura è modificare l'espressione genica nei neuroni del sistema nervoso centrale embrionale. Questo risultato si ottiene innanzitutto recuperando femmine gravide a tempo controllato e preparandole per l'intervento chirurgico. I corni uterini vengono quindi esposti praticando un'incisione addominale.Dopo l'esposizione degli embrioni, il DNA viene iniettato nel ventricolo laterale, nel terzo ventricolo o nello spazio subretinico. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'applicare una corrente elettrica all'embrione attraverso la parete uterina, posizionando gli elettrodi a paletta in modo che il polo positivo sia orientato sulla sede preferita di trasfezione. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la proliferazione, la migrazione e la differenziazione dei progenitori neurali nel cervello in via di sviluppo e nella retina mediante microscopia a immunofluorescenza.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la degenerazione di topi transgenici, è che è rapida, consente studi ad alto rendimento e ha un costo inferiore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello

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Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Questo video dimostra la consegna di DNA plasmidico nelle cellule neuronali cerebellari di embrioni murini utilizzando l'elettroporazione in utero. Questo metodo è utile per comprendere la funzione in vivo dei geni nel normale sviluppo cerebrale e i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule neuronali durante la progressione tumorale.

Consegna genica basata sull'elettroporazione in utero: una tecnica per iniettare DNA plasmidico nelle cellule cerebellari embrionali di embrioni murini

Nonostante l'importanza funzionale e mediche...

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare in modo specifico diverse regioni del sistema nervoso centrale C57BL/6 tramite elettroporazione in utero. Incluso in questo protocollo ci sono istruzioni dettagliate per le trasfezioni delle regioni che si sviluppano nella corteccia, nell'ippocampo, nel talamo, nell'ipotalamo, nel nucleo del setto laterale e nello striato.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Impara l'elettroporazione in utero per la consegna genica nel sistema nervoso centrale embrionale. Questa tecnica consente di studiare la proliferazione e la differenziazione dei progenitori neurali con controllo spaziale e temporale.

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