Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

La trasfezione genica è un approccio vitale per gli studi di neurobiologia. La nostra tecnica di elettroporazione ci consente di trasfettare gli interneuroni del gene di interesse in una coltura organotipica di fette di ippocampo senza effetti collaterali rilevabili. Questo protocollo ha un'efficienza di trasfezione molto più elevata rispetto ad altri protocolli a cella singola, ma è ancora relativamente economico e semplice da eseguire.

Questa tecnica sarà utile per i ricercatori interessati a comprendere specifiche funzioni molecolari e fisiologiche dei neuroni, inclusi i meccanismi autonomi delle cellule e le interazioni proteiche transsinaptiche. Per preparare le colture a fette per l'elettroporazione, trasferire gli inserti di coltura di interesse in singole piastre di Petri da tre centimetri caricate con 900 microlitri di terreno di coltura e posizionare le colture in un incubatore di anidride carbonica da tavolo. Successivamente, pre-incubare gli inserti di coltura freschi con un millilitro di terreno di coltura a fette per inserto in una piastra di Petri da 3,5 centimetri per almeno 30 minuti e sterilizzare le linee del rig di elettroporazione con candeggina al 10% per cinque minuti.

Al termine della perfusione, sciacquare le linee con l'acqua ionizzata autoclavata per almeno 30 minuti prima di perfondere con filtro sterilizzato ACSF contenente 0,001 millimolari di tetrodotossina. Impostare l'impulso dell'elettroporatore su un'ampiezza di meno cinque volt, un impulso quadrato, un treno di 500 millisecondi, una frequenza di 50 hertz e un'ampiezza dell'impulso di 500 microsecondi. Riempi una pipetta di vetro con cinque microlitri di soluzione interna contenente plasmide e picchietta delicatamente e picchietta più volte la punta per rimuovere eventuali bolle intrappolate.

Utilizzare un microscopio da dissezione per verificare che la punta non sia danneggiata e fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo. Quando il puntale entra in contatto con l'ACSF, registrare la lettura della resistenza della pipetta dell'elettroporizzatore. Per isolare una coltura a fette, tagliare la membrana dell'inserto di coltura con una lama affilata e utilizzare una pinza ad angolo acuto per trasferire con cura la coltura a fette nella camera di elettroporazione.

Fissare quindi la posizione delle impostazioni cultura con un ancoraggio di sezione. Per l'elettroporazione delle cellule di interesse, applicare una pressione positiva alla pipetta per bocca e utilizzare i comandi tridimensionali della manopola per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura a fette. Osservando la coltura con il microscopio, avvicinarsi alla cellula bersaglio con la punta, mantenendo la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare.

Dopo la visualizzazione della fossetta, applicare rapidamente una leggera pressione negativa con la bocca in modo che si formi una tenuta allentata tra la punta della pipetta e la membrana plasmatica. La membrana entrerà leggermente nella pipetta. Si deve osservare un aumento di circa 2,5 volte della resistenza iniziale della pipetta, come indicato da un aumento del tono dagli altoparlanti.

Riapplicare rapidamente la pressione positiva in modo che la fossetta si riformi. Quindi completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione, come appena dimostrato, senza pause. Dopo l'ultimo impulso di pressione, mantenere la pressione negativa per un secondo.

Quando il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile dell'intonazione, utilizzare il pedale per pulsare rapidamente l'elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 micron dalla cella senza applicare pressione e riapplicare una pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura della linea di base prima di avvicinarsi alla cella successiva. Quando tutte le cellule di interesse sono state elettroporizzate, trasferire la coltura a fette in uno degli inserti di coltura freschi preparati e posizionare l'inserto a 35 gradi Celsius per un massimo di tre giorni.

In questo esperimento rappresentativo, l'EGFP è stato trasfettato in 5-20 neuroni piramidali nell'area CA1 dell'ippocampo in sette, 14 e 21 giorni in età di coltura in vitro. Gli interneuroni della parvalbumina e del glutammato vescicolare di tipo 3 possono anche essere elettroporati con successo all'interno dell'area CA1 dell'ippocampo. È interessante notare che la trasfezione non è influenzata in modo significativo dall'età di coltura della fetta in vitro e non differisce con l'efficienza di trasfezione osservata nei neuroni piramidali CA1.

I neuroni sono molto fragili. È necessario essere estremamente cauti e delicati quando ci si avvicina e si fa pressione sulle cellule e si ritrae la punta della pipetta causando gravi danni. Dopo l'elettroporazione, le cellule possono essere sottoposte a varie analisi sperimentali, tra cui l'elettrofisiologia e l'imaging.