Name: Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Impara l'imaging live-cell della migrazione nucleare intercinetica nella retina di Danio rerio con microscopia multiphoton. Questo metodo consente di monitorare in tempo reale la rigenerazione retinica e il comportamento dinamico delle cellule proliferanti.

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Apprezziamo il sostegno fornito da William Archer e il meccanismo di Notre Dame Integrated Imaging. Un ringraziamento particolare sono dirette ai tecnici Freimann Life Sciences per il loro aiuto continuo e la loro cura e l&#39;allevamento del pesce zebra. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Eye Institute di NIH per DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) e il Centro per la ricerca Zebrafish, Università di Notre Dame, Notre Dame, IN.

Nota: Zebrafish sono state sollevate e mantenuto nella struttura Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e sono in conformità con la dichiarazione per l&#39;utilizzo degli animali nella ricerca visione dall&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia. 1. Soluzioni <ol><li> Preparare 70% di etanolo per sterilizzare il cofano coltura di tessuti e qualsiasi apparecchiatura / reagenti che vengono trasferiti nella cappa coltura tissutale. </li><li> Aggiungere 2 ml di 2-fenossietanolo a 1 L di acqua del sistema (1: 500 2-fenossietanolo). </li><li> Preparare 0.1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro dimensione dei pori 0,2 micron siringa per sterilizzare la soluzione in una cappa coltura tissutale sterilizzato. NOTA: NaHCO 3 viene utilizzato per diffondere efficacemente l&#39;adesivo cellula e tessuto sulla superficie coprioggetto di fluorodishes (vedistep 3.2). </li><li> Preparare 1,0 M CaCl 2 e 1.0 M MgCl 2. Sterilizzazione con una siringa da 10 ml e 0,2 micron dimensione dei pori del filtro siringa in una cappa coltura tissutale sterilizzato. </li><li> Per preparare Hank&#39;s-soluzione salina bilanciata (HBSS), aggiungere sterili CaCl 2 e sterile MgCl 2 a 1x HBSS senza Ca 2+ / Mg 2+, senza rosso fenolo ad una concentrazione finale di 1 mm ciascuno. Lavorare in un ambiente sterile. </li><li> Per preparare un terreno di coltura, mescolare il 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) senza rosso fenolo, il 25% HBSS contenente CaCl 2 e MgCl 2 (vedi sezione 1.4), il 25% siero di cavallo (HS), 10 unità / ml di penicillina, e 10 mg / mL di streptomicina. Lavorare in un ambiente sterile. NOTA: Evitare di terreno contenente rosso fenolo come autofluoresces, che ciò pregiudichi rapporto segnale rumore. 23 </li><li> Preparare 10 ml di 1% a basso punto di fusione agarosio in 1x MEM senza rosso fenolo. Melt agarosio / 1x MEM utilizzando un microWAve. Preparare piccoli volumi di agarosio (ad esempio, 10 mL) come riscaldo ripetitiva cambierà concentrazioni di ioni a causa dell&#39;evaporazione del fluido. </li><li> Prima di coltura, sterilizzare provette da 1,5 ml microcentrifuga in autoclave. </li></ol> 2. Light-danni paradigma <ol><li> Dark-adattamento <ol><li> Mettere 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish (o altro zebrafish transgenico di interesse) a 6 - 14 mesi di età in un ambiente privo di luce per 14 d. Per ulteriori dettagli vedi riferimento 2, 6, 24, 25. </li></ol></li><li> Posizionare il serbatoio contenente 2 - 3 adattata al buio zebrafish transgenico in acqua del sistema tra due lampade fluorescenti che emettono luce di 2,800 lux 2, 6, 24, 25. </li&gt; <li> Esporre zebrafish al costante luce intensa per 35 ore. Durante l&#39;esposizione alla luce, assicura che la temperatura dell&#39;acqua è mantenuta tra 31 - 33 ° C. </li></ol> 3. Preparazione per la coltura (nel giorno di isolamento della retina) <ol><li> Utilizzando il 70% di etanolo, sterilizzare il cofano coltura di tessuti e componenti / strumenti che vengono trasferiti nella cappa coltura tissutale (ad esempio, flaconi contenenti MEM e HBSS, pipette, puntali sterili, ecc.). </li><li> Preparazione di fluorodishes <ol><li> Coat uno fluorodish per ogni retina con cellulare e tessuto adesivo (vedi tabella dei materiali). </li><li> Diluire l&#39;adesivo cellula e tessuto 0.1 mM NaHCO 3 a una concentrazione finale di 70 mg / ml, aggiungere 50 microlitri di ciascun fluorodish e diffondere la soluzione attraverso il centro del fluorodish con una punta di pipetta 200 microlitri (circa 1 - diametro 1,2 centimetri ). </li><li> Incubare le fluorodishes rivestite per 1 - 3 h a temperatura ambiente, (In alternativa, incubare O / N a 4 ° C). </li><li> Rimuovere la soluzione e risciacquare 3x con 500 ml di 1x MEM per ogni lavaggio. Per evitare i fluorodishes rivestite da secchi, li mantenere in MEM fino espianti di retina sono montati. </li></ol></li><li> Preparare terreno di coltura come descritto al punto 1.6. Il terreno di coltura può essere conservato per un massimo di 1 settimana a 4 ° C. </li></ol> 4. L&#39;isolamento e la coltura di espianti retina NOTA: Il protocollo descritto sotto è per l&#39;isolamento della retina dorsale, che è la regione retinica che è prevalentemente lesionato dal paradigma luce danno descritto. Pertanto, la proliferazione danni indotti e l&#39;evento associato della migrazione nucleare interkinetic si verificano nella retina dorsale. Tuttavia, la procedura di isolamento può essere regolata per produrre regioni retina secondo le esigenze specifiche della domanda ricercatore / ricerca. <ol><li> Euthanize una luce-danneggiato transgenico zebrafish untempo ta in 1: 500 2-fenossietanolo. </li><li> Rimuovere MEM da un fluorodish con una pipetta 1000 microlitri modo che solo una sottile pellicola di fluido resti. </li><li> Trasferire il pesce zebra su un tovagliolo di carta asciutto, rimuovere l&#39;occhio con un paio di pinze curva Dumont (pinze # 5, 45 ° angolo) e trasferirlo sul fluorodish. </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, orientare l&#39;occhio con la pupilla sul coperchio slittamento della fluorodish in modo che la parte posteriore dell&#39;occhio con il nervo ottico è visibile (Figura 1D). </li><li> Con un paio di forbici McPherson-Vännäs rimuovere il nervo ottico, taglio vicino alla parte posteriore dell&#39;occhio. Inoltre, rimuovere il tessuto connettivo, allineando la parte esterna dell&#39;occhio. </li><li> Tenere l&#39;occhio tra il suo nasale e lato temporale con un paio di # 5 pinze mentre facendo un&#39;incisione gambo ottica perforando con una lama forbice attraverso la lamina cribrosa e tagliando lungo gli nasale e lati temporale dell&#39;occhio (vedere Figura 1E , li segmentatoNE). </li><li> Utilizzando due coppie di pinze # 5, uno per tenere il lato dorsale della retina e l&#39;altra coppia di separare ventrale dalla retina dorsale, tirare il tessuto. NOTA: Si consiglia di orientare la retina dorsale in modo che la lente e lo strato di cellule gangliari affacciano sul vetrino mentre la sclera è rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Rimuovere la sclera dalla retina dorsale una coppia di pinze # 5, mentre si tiene la lente che è collegato alla retina con una seconda coppia di pinze # 5 (Figura 1H, I). </li><li> Per rimuovere l&#39;obiettivo, usare le forbici McPherson-Vännäs e tagliare dietro l&#39;obiettivo senza danneggiare la retina (Figura 1I, J). Talvolta, la lente separa nel passaggio 4.7. In questo caso, rimuovere la sclera accuratamente con una pinza tenendo la retina un bordo tagliato con una seconda coppia di pinze # 5. </li><li> Rimuovere il vitreo durante la rimozione della lente senza danneggiare la retina. Appiattire la retina con lo strato di cellule gangliari di fronte al vetrinodel fluorodish (Figura 1L, M). </li><li> Circondano la retina con 10 ml di 1% agarosio punto basso punto di fusione e lasciare che il agarosio solidificare. </li><li> Guarda che l&#39;agarosio liquido non sollevare la retina come anche una lieve elevazione potrebbe influenzare la capacità di mettere a fuoco in profondità nel tessuto. Se si osserva il sollevamento, utilizzare una pipetta per rimuovere agarosio. Lasciate set agarosio residua prima di tentare di aggiungere più. </li><li> Ripetere il passaggio 4.12 parecchie volte prima di aggiungere 1% agarosio punto basso punto di fusione per coprire l&#39;intera fluorodish. Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, aggiungere 1,5 mL terreno di coltura. </li><li> Mantenere l&#39;espianto della retina in un ambiente / aria 5% di CO 2 fissata a 32 ° C per circa 12 ore per consentire la retina di recuperare dallo stress sostenute dalla procedura di isolamento. Impostare la temperatura a 32 ° C per mantenere retine alla stessa temperatura come zebrafish luce-trattati (vedi punto 2.3). </li></ol> 5. Multiphoton Microscopia Tabella dei Materiali), una lunga distanza obiettivo immersione in acqua 40X Apo (NA 1.15), uno scanner galvanometro e un camera ambientale che contiene un inserto per quattro 35 millimetri Petri. Le immagini sono state acquisite con un rivelatore non descanned (R-NDD). <ol><li> Prima di imaging, equilibrare la camera ambientale per ottenere un ambiente / aria 5% di CO 2. Assicurarsi che i piatti vuoti Petri sono inseriti nel supporto per evitare perdite di gas nella camera. </li><li> Accendere il sistema di microscopia. </li><li> Una volta che la camera ambientale è equilibrato, aggiungere rifrazione liquido indice sulla lunga distanza obiettivo immersione in acqua 40X Apo (NA 1.15). NOTA: Il liquido indice di rifrazione con proprietà ottiche simili all&#39;acqua viene utilizzato per evitare l&#39;evaporazione dell&#39;acqua durante l&#39;imaging a lungo termine. </li><li> luogo influenzaorodishes con espianti di retina nella camera. Usando la luce chiaro, posizionare il campione nel percorso ottico e portare la regione centrale della retina dorsale nel piano di messa a fuoco. </li><li> Utilizzare GFP luce epifluorescente di concentrarsi su GFAP: nGFP -positivo Müller glia nuclei (Figura 2A, C). NOTA: Se espianti non sono montati piatto o agarosio accumulato sotto l&#39;espianto, sarà difficile mettere a fuoco sul GFAP: nGFP nuclei -positive o saranno fluorescenza debolmente. <ol><li> Controllare se trasferirsi in una regione diversa all&#39;interno dello stesso espianto della retina sarà superare il problema di messa a fuoco. In caso contrario, passare a un diverso espianto della retina. </li></ol></li><li> Nel software di acquisizione delle immagini, aprire la &#39;A1 MP GUI&#39;, il &#39;TiPad&#39;, la &#39;A1 Compact GUI&#39; e le finestre &#39;ND acquisizione. Per l&#39;imaging multiphoton, assicurarsi che l&#39;opzione &#39;IR NDD&#39; viene scelto nel &#39;A1 Compact GUI&#39;. </li><li> Nel &#39;setting &#39;campo, selezionare IR-DM per la st 1 specchio dicroico e scegliere il filtro passa banda 525/50 per acquisire GFP fluorescenza. </li><li> Accendere il laser a infrarossi nella finestra denominata &#39;A1MP GUI&#39;. Ci vorrà qualche minuto per il laser per essere pronti. Impostare la lunghezza d&#39;onda di 910 nm per eccitare la fluorescenza GFP e allineare il laser facendo clic sul pulsante &#39;allineamento automatico&#39; nella finestra &#39;A1 MP GUI&#39;. </li><li> Assicurarsi che in camera e attrezzature luci sono spente o coperte prima di aprire l&#39;otturatore nel &#39;A1 MP GUI&#39; per evitare la sovraesposizione del tubo fotomoltiplicatore. Per ridurre i livelli di rumore, ospitare il microscopio in un ambiente buio. </li><li> Acquisire immagini di un campo visivo di 300 x 300 pixel, ad un ingrandimento di due, e un tempo di pixel dimora di 4,8 ms / pixel. Circa impostare la potenza del laser cambiando la &#39;area di acquisizione&#39; nel &#39;A1MP GUI&#39; e il guadagno nella finestra &#39;A1 Compact GUI&#39;. </li><li> Impostazione del z-stack <ol><li> Focus sul strato di cellule gangliari per impostare il piano focale superiore dello z-stack nel &#39;-sottofinestra z&#39;all&#39;interno della&#39; finestra di acquisizione ND &#39;. Alcuni GFAP: cellule -positive nGFP in genere si trovano nello strato di cellule gangliari, che aiuta a identificare il limite basale della retina (Figura 2A, D). </li><li> Spostare il piano focale attraverso il livello del ONL (Figura 2A, B), che è caratterizzato dalla presenza di GFAP debolmente marcato: cellule -positive nGFP che sono rotondi e ingrandita rispetto alle loro controparti nel INL (Figura 2A, C) . </li><li> Impostare questo piano del fondo del z-stack. Assicurarsi che l&#39;intero ONL verrà ripreso (Figura 2A, B). </li><li> Quando si verifica focali spostamenti aerei che richiedono una ri-regolazione durante il periodo di imaging, fare doppio clic sulla posizione centrale nella sottofinestra &#39;z&#39; per assegnarlo come la posizione di &#39;casa&#39;. Passare alla &#39;modalità simmetrica definito&#39;e fare clic su &#39;relativo&#39;. </li><li> Impostare la dimensione z-passo tra 0,7-1 micron. </li></ol></li><li> Correzione Z intensità: <ol><li> Applicare correzioni z intensità per compensare la perdita di intensità dei pixel a causa di dispersione della luce quando l&#39;imaging in strati profondi del tessuto. </li><li> Per impostare la correzione, aprire la finestra &#39;correzione di z-intensita&#39;. Per impostare la &#39;gamma z-stack&#39;, scegliere &#39;Da ND&#39;. </li><li> Istruzioni sul piano focale inferiore nella finestra &#39;z intensità di correzione&#39; (in questo caso, corrisponde allo strato di cellule gangliari) e impostare l&#39;intensità del laser ( &#39;area di acquisizione&#39; nella &#39;A1MP GUI&#39;) e il guadagno (GUI Compact A1 ). </li><li> Fare clic sulla freccia accanto ai &quot;valori z &#39;nella finestra&#39; correzione di z-intensita &#39;per confermare le impostazioni che vengono successivamente indicati alla voce« impostazioni del dispositivo&#39; nella finestra &#39;correzione di z-intensita&#39; per il piano focale prescelto. </li><li> Ripetere il processo per l&#39;una via di mezzomigliori piani di ND, aumentando la potenza del laser e guadagno. Ulteriori piani focali possono essere aggiunti, se necessario. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni laser e guadagno specifiche per esperimenti in Figure 2 - 4. </li><li> Impostare l&#39; &#39;area di acquisizione&#39; nella finestra &#39;A1 MP GUI&#39;. Evitare di selezionare un&#39;area acquisizione maggiore di 15 e un guadagno superiore 126 all&#39;inizio di imaging per aggirare photobleaching e maggiore rumorosità. NOTA: i laser e tubi fotomoltiplicatori differiscono tra i sistemi di microscopia laser, prova e impostazioni di guadagno per ottenere condizioni di imaging ottimali per il microscopio istituito evitando photobleaching. </li><li> Scegliere &#39;correzione di intensità relativa&#39; nella finestra &#39;correzione di z-intensita&#39;. </li></ol></li><li> Nella sottofinestra &#39;timeseries&#39; nella finestra &#39;ND acquisizione&#39;, impostare la durata di 8 ore e l&#39;intervallo per &#39;alcun ritardo&#39;. Quindi, assicurarsi di fare clic su &#39;Esegui z-correzione&#39; in tegli finestra secondaria &#39;z-stack&#39; nel pulsante finestra &#39;ND acquisizione&#39; per acquisire le timeseries 3-D. </li><li> Mantenere espianti retinici ad una temperatura di 27 - 29 ° C per tutta la durata di acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Per tutto il periodo di acquisizione dell&#39;immagine, se necessario, regolare il livello di potenza e di guadagno per mantenere la qualità dell&#39;immagine per analisi post-imaging. Per le regolazioni eseguire i passaggi 5.11.2 - 5.11.4. </li><li> Se i cambiamenti sul piano focale, mettere in pausa o fermare la corsa ed eseguire passo 5.11 di nuovo. NOTA: Se &#39;relativa z-correzione&#39; è stato scelto al passo 5.12.7 e 5.11.4 è stata eseguita passo non dovrebbe essere necessario regolare nuovamente livelli di potenza e di guadagno, a meno che non si è verificato vasta photobleaching. </li></ol> 6. Analisi Velocity <ol><li> Estrarre il tempo, impostando una &#39;regione di interesse&#39; sull&#39;immagine. Utilizzare lo strumento &#39;tempo di misura&#39; ed esportare i valori di tempo di un foglio di calcolo. </li><li> Ritagliare una regione che contiene uno dividing GFAP: nGFP nucleo -positivo. </li><li> Scegliere la regione ritagliata in modo che contenga almeno un nucleo che non subiscono INM per impostare un punto di riferimento per misurare le distanze successivamente che il nucleo di demarcazione migrato rispetto al basale INL. NOTA: Per scegliere un nucleo che rimane nel basale INL, aiuta a preparare una ricostruzione 3-D dei timeseries. </li><li> In alternativa, se un GFAP: si osserva nGFP cellule -positivo nel ONL tutto il periodo di acquisizione, utilizzare una linea verticale di lunghezza fissa che va dal nucleo ONL al basale INL per identificare un punto di riferimento. </li><li> Utilizzando la funzione &#39;Mostra fette vista&#39;, generare proiezioni ortogonali. Successivamente, cambiare la modalità da &#39;fetta&#39; di &#39;proiezione massima intensita&#39;. </li><li> Spegnere la vista &#39;xy&#39; della proiezione massima ortogonale. A seconda dell&#39;orientamento in cui la migrazione / nucleo dividendo è meglio visibile, unaLSO spegnere sia il &#39;xz&#39;- o la&#39; vista yz&#39;. </li><li> Clicca sull&#39;immagine rimanente con il tasto destro del mouse ed estrarre la &#39;serie yz&#39;-immagine con la&#39; &#39;XZ&#39; o la funzione Crea nuovo documento da questo punto di vista &#39;. Se necessario, ruotare l&#39;immagine. </li><li> Utilizzando la funzione di &#39;misurazione manuale&#39;, tracciare una linea orizzontale attraverso l&#39;immagine al livello inferiore del nucleo che rimane nel INL basale e non subisce INM (= punto di riferimento, la figura 4A - E, linea orizzontale rossa). </li><li> Misurare la distanza tra la linea di riferimento e il punto basale del nucleo migrazione dei timeseries con lo strumento &#39;misura linea&#39; nel software di analisi (vedi Figura 4A - E). </li><li> Una volta che l&#39;involucro nucleare si rompe, misurare la posizione basale del soma se è identificabile seguito della diffusione della GFP nella intera cella. </li><li> Utilizzando un software di foglio di calcolo, tracciare la distanza di un nuCleus migrato contro il tempo trascorso (Figura 4F). <ol><li> Per determinare la velocità di migrazione apicale (v a), grafico le distanze percorse per il periodo precedente ripartizione involucro nucleare si verifica (Figura 4G). </li><li> Selezionare la serie di dati all&#39;interno del grafico, fare clic con il mouse e inserire una curva di regressione lineare tra cui &#39;y = mx + c&#39; la funzione corrispondente. La pendenza &#39;m&#39; nella funzione rappresenta la velocità, v a (Figura 4G). </li><li> Ripetere i punti 6.11.1 e 6.11.2 per la prima fase della migrazione basale rapida per determinare la velocità di migrazione basale, v b (Figura 4H). </li></ol></li></ol>

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<li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li>
<li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+excitability%2C+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
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<li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li>
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<li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li>
<li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li>
<li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Cell%22%5BJournal%5D)">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li>
<li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li>
<li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Cell.Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli studi che indagano i meccanismi che regolano la rigenerazione dell&#39;adulto danneggiato retina zebrafish metodi utilizzati prevalentemente immunocitochimiche 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Stabilire condizioni alla cultura espianti di retina e per eseguire live-cell imaging su fenomeni, c...

A differenza di esseri umani, pesce zebra (Danio rerio) mostrano una robusta risposta la rigenerazione delle cellule alla morte dei neuroni della retina 1, 2, 3, 4. Fattore di necrosi tumorale α, una molecola di segnalazione che viene rilasciato dalla morte dei neuroni della retina induce Müller glia residente nel basale strato interno nucleare (INL) della retina, a proliferare 5 e produrre cellule progenitrici neuronali che continuano a proliferare prima differenziazione in cellule neuronali tipi morti 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa della risposta rigenerazione, i nuclei di Müller glia e le loro cellule progenitrici neuronali derivate subiscono un modello migratorio ripetitivo in fase con il ciclo cellulare (Interkinetic migrazione nucleare, INM) 6 </sup<html> &gt;, 7. Nuclei posizionato nel basale INL replicare il loro DNA prima di migrare verso lo strato esterno nucleare (ONL) in cui si dividono prima i nuclei derivanti tornano basale alla INL. Questo processo è stato descritto durante lo sviluppo neuroepiteliale utilizzando metodi istologici, mentre approcci di imaging live-cell successivamente confermato l&#39;interpretazione da Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Entrambi gli approcci di imaging istochimiche e live-cellulari sono stati utilizzati per determinare i meccanismi sottostanti INM e la sua funzione nello sviluppo neuroepiteli compreso retina 9, 11, 12, 13. Tuttavia, i meccanismi che regolano INM nell&#39;adulto rigenerazione della retina non sono stati studiati in molti dettaglixref &quot;&gt; 6, 7. live-cell imaging sarà un approccio preziosa per far progredire la nostra conoscenza delle vie di segnalazione che controllano INM nella rigenerazione della retina adulta. Fino a poco tempo, live-cell imaging del INM nella retina era limitato a uno zebrafish embrioni vivi o pulcino embrionale o topo postnatale espianti retinici 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mentre espianti di retina da animali adulti di una varietà di specie, tra cui topo, ratto e zebrafish sono stati utilizzati per la cella diversa approcci biologici 17, 18, 19, 20, esperimenti di imaging dal vivo di cellule utilizzando espianti di retina have stato limitato a brevi periodi di tempo e non sono stati eseguiti in modo continuativo per diverse ore 21, 22. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato alla cultura per adulti retine zebrafish luce danneggiato per eseguire esperimenti di imaging dal vivo di cellule monitoraggio INM utilizzando multi-fotone microscopia a 6. Approcci live-cell imaging sono vantaggiosi rispetto ai metodi di immunoistochimica nell&#39;ambito delle indagini i meccanismi che controllano INM, come le dinamiche di INM, ad esempio, le velocità potrebbero essere interessati, piuttosto che la posizione della mitosi, che non è potenzialmente essere rilevato tramite immunocitochimica. In futuro, questo metodo ha anche il potenziale di essere modificati per studiare altri processi dinamici durante la rigenerazione della retina, come la fagocitosi di morire fotorecettori da Müller glia o il comportamento della microglia.

<table><tbody><tr><td>Pinze Dumont #5</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5, angolo di 45 gradi</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Forbici McPherson-Vannas</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordish</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ-1B</td><td>tipo simile di stereomicroscopio di dissezione funzionerà</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di classe tipo A2</td><td>Labconco</td><td></td><td>tipo equivalente funzionerà</td></tr><tr><td>incubatore per colture tissutali</td><td>Thermoscientific</td><td>HEPA di classe 100</td><td>tipo equivalente funzionerà Lampade</td></tr><tr><td>fluorescenti Sylvania OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &; filtro per siringa Acrodisc a pori m</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>siringa Luer-lok da 10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>siringa Luer-lok da 60 mL</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS senza Ca2+/Mg2+, senza rosso fenolo, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM senza rosso fenolo, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato termicamente</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro a basso punto di fusione</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>etanolo, assoluto</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-fenossietanolo</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak adesivo per cellule e tessuti&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>liquido con indice di rifrazione&nbsp;</td><td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotone Nikon A1 dotato di un laser a infrarossi MaiTai</td> Il <td>sistema equivalente</td><td>Nikon</td><td></td> funzionerà</tr><tr><td>40X Apo obiettivo ad immersione in acqua a lunga distanza (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>camera ambientale dotata di inserto per petridish da 35 mm</td> Il <td>sistema equivalente</td><td>Okolab</td><td></td> funzionerà</tr> con <tr><td>il software</td> <td>di analisi NISNikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultura di adulti transgenici zebrafish retina espianti per live-cell imaging per multiphoton microscopia

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Un programma di rigenerazione endogena è avviata da Müller glia nel zebrafish adulti (Danio rerio) retina seguente danno neuronale e la morte. Le Müller glia ri-entrare nel ciclo cellulare e producono cellule progenitrici neuronali che sono oggetto di ulteriori cicli di divisioni cellulari e differenziarsi in tipi di cellule neuronali persi. Sia Müller glia e cellule progenitrici neuronali nuclei replicano il loro DNA e sottoposti mitosi in posizioni distinte della retina, cioè migrano tra il basale strato interno nucleare (INL) e lo strato esterno nucleare (ONL) rispettivamente, in un processo descritto come Interkinetic La migrazione nucleare (INM). INM è stata studiata principalmente nella retina sviluppo. Per esaminare le dinamiche di INM nell&#39;adulto rigenerante retina zebrafish in dettaglio, è necessario live-cell imaging di / cellule progenitrici neuronali fluorescenza marcata Müller glia. Qui, forniamo le condizioni per isolare e retine cultura dorsalida Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish che sono stati esposti ad una costante luce intensa per 35 ore. Mostriamo anche che queste culture della retina sono vitali per eseguire esperimenti di imaging live-cell, acquisendo continuamente immagini z-stack per tutto lo spessore della espianto della retina per un massimo di 8 ore usando la microscopia multiphoton per monitorare il comportamento migratorio di GFAP: cellule -positive nGFP . Inoltre, si descrivono i dettagli per effettuare analisi post-imaging per determinare la velocità di INM apicale e basale. Per riassumere, abbiamo stabilito le condizioni per studiare le dinamiche di INM in un modello adulto di rigenerazione neuronale. Questo farà progredire la nostra comprensione di questo processo cellulare cruciale e ci permettono di determinare i meccanismi che controllano INM.

L&#39;isolamento della retina secondo la procedura descritta nello schema di figura 1 consente coltura di una retina dorsale appiattito da adulti light-danneggiato Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish per un periodo di almeno 24 h in un CO 5% 2 / ambiente di aria. Questi espianti di retina piatto montate possono essere utilizzate per immagini piani focali a livello dei tessuti profondi. Un esempio è Müller glia / nuclei neuronali di cellule pro...

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura di isolamento è consentire l'analisi in tempo reale delle cellule vive che stanno subendo una migrazione nucleare intercinetica all'interno di colture di espianti retinici provenienti da zebrafish danneggiati. Questo metodo permette di rispondere a domande fondamentali sulla rigenerazione retinica, come ad esempio quali meccanismi guidano la migrazione nucleare intercinetica o se le cellule della glia di Muller, in quanto cellule progenitrici retiniche, presentino una regolazione simile durante tale migrazione. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di monitorare il comportamento dinamico delle cellule in proliferazione che subiscono la migrazione nucleare intercinetica durante il processo rigenerativo, consentendo così l'indagine di meccanismi specifici per ciascuna fase del ciclo cellulare.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla migrazione nucleare intercinetica, può essere applicato anche ad altre aree di ricerca retinica, come lo studio del comportamento delle microglia o la fagocitosi da parte delle cellule gliali di Müller nei confronti dei neuroni morenti. Iniziare questa procedura trasfere

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Dimostriamo un protocollo per generare embrioni di zebrafish chimerico per vivere comportamento imaging cellulare durante l'embriogenesi.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di...

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Il video dimostra un metodo per coltivare cellule gangliari retiniche primarie da embrioni di pesce zebra. Gli embrioni in fase iniziale vengono sottoposti a dissezione per isolare gli occhi, che vengono successivamente dissociati meccanicamente in una sospensione di cellule gangliari retiniche. Questa sospensione cellulare viene coltivata su vetrini coprioggetti rivestiti con proteine adesive per facilitare lo sviluppo degli assoni.

Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

Fonte: Lahne, M., et.al. Coltura di espianti retinici di zebrafish transgenico adulto per l'imaging di cellule vive mediante microscopia multifotonica. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra l'imaging su cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller in espianti retinici di pesce zebra inclusi in agarosio a seguito di danni ai fotorecettori indotti dalla luce. Il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) rilasciato dai fotorecettori danneggiati attiva le cellule gliali di Muller,...

Imaging di cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller durante la rigenerazione retinica del pesce zebra

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Formazione immagine del tessuto retinico può fornire informazioni di cella singola che non possono essere raccolti dai metodi biochimici tradizionali. Questo protocollo descrive la preparazione delle fette della retina dallo zebrafish per imaging confocale. Fluorescenti geneticamente codificati sensori o indicatore coloranti permettono la visualizzazione di numerosi processi biologici in tipi distinti delle cellule retiniche.

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Vi presentiamo un protocollo efficiente e facile da usare per la preparazione di colture cellulari primarie di embrioni di zebrafish per la transfezione e live cell imaging nonché un protocollo per preparare cellule primarie dal cervello di zebrafish adulto.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Questo protocollo descrive l'uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H2O2)biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H2O2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in generale sviluppo.

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Impara l'imaging live-cell della migrazione nucleare intercinetica nella retina di Danio rerio con microscopia multiphoton. Questo metodo consente di monitorare in tempo reale la rigenerazione retinica e il comportamento dinamico delle cellule proliferanti.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

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