Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura di isolamento è quello di consentire l'imaging su cellule vive delle cellule proliferanti che stanno subendo migrazione nucleare intercinetica nelle colture di espianti retinici da zebrafish danneggiato. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella rigenerazione retinica, come ad esempio quali meccanismi guidano la migrazione nucleare intercinetica o se la migrazione nucleare intercinetica di una cellula progenitrice renale sia regolata in modo simile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il comportamento dinamico delle cellule proliferanti sottoposte a migrazione nucleare intercinetica durante la rigenerazione può essere monitorato, il che consente lo studio dei meccanismi specifici dello stadio del ciclo cellulare.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla migrazione nucleare intercinetica, può essere applicato anche ad altre aree di ricerca retinica, come lo studio del comportamento microgliale o la fagocitosi gliale di Muller dei neuroni morenti. Inizia questa procedura trasferendo il pesce zebra su un tovagliolo di carta asciutto. Quindi, rimuovere uno degli occhi con un paio di pinze curve e trasferirlo su un FluoroDish.

Sotto uno stereomicroscopio, orientare l'occhio con la pupilla rivolta verso il vetrino coprioggetti del FluoroDish in modo che il nervo ottico sul retro dell'occhio sia visibile. Quindi, rimuovere il nervo ottico il più vicino possibile alla parte posteriore dell'occhio. Inoltre, rimuovere il tessuto connettivo all'esterno dell'occhio.

Tenere l'occhio tra i lati nasale e temporale con un paio di pinze mentre si esegue un'incisione sul ceppo ottico perforando la lamina cribrosa con una lama a forbice e tagliando lungo entrambi i lati nasale e temporale dell'occhio. Quindi, separa i lati dorsale e ventrale della retina. Rimuovere la sclera dalla retina dorsale con un paio di pinze tenendo la lente che è collegata alla retina con un secondo paio di pinze.

Successivamente, rimuovere il cristallino e il vitreo senza danneggiare la retina. Quindi, appiattire la retina con lo strato di cellule gangliari rivolto verso il vetrino coprioggetti del FluoroDish. Successivamente, circondare la retina con 10 microlitri di agarosio all'1% a basso punto di fusione.

Assicurati che la retina non venga sollevata dall'agarosio liquido perché anche una leggera elevazione potrebbe influire sulla capacità di messa a fuoco attraverso il tessuto. Se si osserva un sollevamento, utilizzare una pipetta per rimuovere l'agarosio. È fondamentale che l'agarosio non sollevi il tessuto dal vetrino coprioggetti, poiché ciò riduce la capacità di ottenere immagini di qualità.

Ripetere questa procedura più volte prima di aggiungere l'1% di agarosio a basso punto di fusione per coprire l'intero FluoroDish. Una volta che l'agarosio si è solidificato, aggiungere 1,5 millilitri di terreno di coltura al tessuto. Nel software di acquisizione delle immagini, aprire il pad TI GUI A1 MP, l'GUI compatta A1 e le finestre di acquisizione ND.

Per l'imaging multifotone, assicurarsi che l'opzione IRNDD sia scelta nella finestra GUI compatta A1. Quindi, nel campo di impostazione, selezionare IRDM per il primo specchio dicroico e verificare che il filtro passa banda sia impostato su 525 a 50 per acquisire la fluorescenza GFP. Quindi, accendi il laser IR nella finestra GUI A1 MP.

Ci vorranno alcuni minuti prima che il laser sia pronto. Successivamente, impostare la lunghezza d'onda a 910 nanometri per eccitare la fluorescenza GFP e allineare il laser facendo clic sul pulsante di allineamento automatico. Dopo aver posizionato la coltura retinica sul tavolino del microscopio multifotone, assicurarsi che le luci della stanza e dell'apparecchiatura siano spente prima di aprire l'otturatore per evitare la sovraesposizione del tubo fotomoltiplicatore.

Per ridurre i livelli di rumore, collocare il microscopio in un ambiente buio. Acquisizione di immagini di un campo visivo di 300 x 300 pixel con uno zoom di due, che vengono impostate nella finestra dell'area di scansione e un tempo di permanenza dei pixel di 4,8 microsecondi per pixel scelto nella finestra GUI compatta A1. Impostare approssimativamente la potenza del laser modificando l'area di acquisizione nella finestra dell'interfaccia grafica A1 MP e il guadagno nella finestra dell'interfaccia grafica compatta A1.

Ora, concentrati sullo strato di cellule gangliari e imposta il piano focale superiore dello stack z nella sottofinestra z all'interno della finestra di acquisizione ND. Spostare il piano focale attraverso il livello dello strato nucleare esterno, che è caratterizzato dalla presenza di celle GFAP e GFP positive debolmente etichettate che sono rotonde e ingrandite rispetto alle loro controparti nello strato nucleare interno. Imposta questo piano come parte inferiore della pila z.

Quindi, imposta la dimensione del passo z tra 0,7 e un micrometro. Per impostare la correzione dell'intensità z, aprire la finestra di correzione dell'intensità z e scegliere tra ND per impostare l'intervallo dello stack z. Quindi, fare clic sul piano focale inferiore nella finestra di correzione dell'intensità z e impostare l'intensità e il guadagno del laser.

Successivamente, fare clic sulla freccia accanto ai valori z nella finestra di correzione dell'intensità z per confermare le impostazioni che vengono successivamente visualizzate in Impostazioni dispositivo nella finestra di correzione dell'intensità z per il piano focale scelto. Ripetere il processo per i piani centrale e superiore, aumentando la potenza e il guadagno del laser. Impostare l'area di acquisizione nella finestra dell'interfaccia grafica A1 MP ed evitare di selezionare un'area di acquisizione maggiore di 15 e un guadagno superiore a 126 all'inizio dell'imaging per aggirare lo sbiancamento delle foto e l'aumento dei livelli di rumore.

Successivamente, scegliere la correzione dell'intensità relativa nella finestra di correzione dell'intensità z. Nella finestra secondaria della serie temporale della finestra di acquisizione ND, impostare la durata su 8 ore e l'intervallo su nessun ritardo. Quindi, fare clic su Esegui correzione z nella finestra secondaria dello stack z della finestra di acquisizione ND per acquisire serie temporali 3D.

In questa procedura, ritaglia una regione che contiene un nucleo GFAP e GFP positivo in divisione. Scegliere una regione ritagliata che contenga almeno un nucleo che non subisce INM in modo da impostare un punto di riferimento per misurare successivamente le distanze che il nucleo in divisione ha migrato in relazione all'INL basale. Aiuta a preparare una ricostruzione 3D.

Utilizzando la funzione di visualizzazione mostra sezioni, generare proiezioni ortogonali. Successivamente, modificare la modalità da fetta a proiezione di massima intensità. Quindi, disattivare la vista XY della proiezione massima ortogonale.

A seconda dell'orientamento in cui il nucleo in migrazione e in divisione è meglio visibile, disattivare anche la vista XZ o YZ. Fare clic con il tasto destro del mouse sull'immagine rimanente ed estrarre la serie di immagini XZ o YZ con la funzione Crea nuovo documento da questa funzione. Se necessario, ruotare l'immagine.

Utilizzando la funzione di misurazione manuale, tracciare una linea orizzontale attraverso l'immagine al livello inferiore del nucleo che rimane nell'INL basale e non subisce INM. Misurare la distanza tra la linea di riferimento e il punto basale del nucleo migrante per le serie temporali utilizzando lo strumento di misurazione lineare nel software di analisi. Qui è mostrata la massima proiezione YZ di una serie di immagini z stack degli espianti retinici in diversi punti temporali della registrazione time lapse acquisita dalla microscopia multifotone.

Utilizzando lo strumento linea sotto la funzione di misurazione manuale, è stata posizionata una linea orizzontale a livello della cella di riferimento indicata da una stella. Una linea di misura verticale è stata posizionata a partire dalla linea orizzontale e che si estende fino alla posizione basale del nucleo GF AP e GFP positivo in migrazione. Distanza che la cellula, F0, misurata nella figura precedente ha migrato apicalmente e che le cellule figlie che ne derivano, D1 e D2, sono migrate basalmente nella registrazione time lapse multifotone.

La linea rossa indica le misure per le quali è stata calcolata la velocità di migrazione apicale, mentre le linee nere e grigie indicano le misure utilizzate per calcolare le velocità di migrazione basale rispettivamente per D1 e D2. La distanza è stata tracciata rispetto al tempo stesso per la migrazione apicale prima della rottura dell'involucro nucleare e la fase di rapida migrazione basale per la cellula figlia D1. Una volta padroneggiato, l'isolamento delle retine da tre pesci può essere eseguito in 60-90 minuti se eseguito correttamente. Questo tempo esclude le fasi di preparazione.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare il più rapidamente possibile per garantire la vitalità dell'espianto retinico. È inoltre fondamentale montare le retine il più piatte possibile per consentire l'imaging negli strati di tessuto più profondi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e montare le retine di zebrafish, eseguire l'imaging di cellule vive per monitorare la migrazione nucleare intercinetica e determinare le velocità di migrazione.