Preparazione T fattore di crescita cellulare da splenociti Rat

Ciao, sono Christine Beaton. Sono un ricercatore assistente nel laboratorio di George Chen del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. Nei prossimi due giorni vi mostrerò come preparare il TCGF, che sta per fattore di crescita delle cellule T.

Quindi, per la nostra comune coltura cellulare, quando non è necessaria una conoscenza precisa della composizione delle citochine nel mezzo di coltura, utilizziamo un fattore di crescita per linfociti T, ovvero un supernatante S derivato da colture di milza di ratto Louis che contiene le citochine necessarie per favorire l'espansione dei linfociti T. Il modo in cui prepariamo il TCGF consiste nell'eutanasia di ratti Louis sani, dai quali preleviamo la milza, prepariamo una sospensione cellulare monodisperdente, eliminiamo i globuli rossi mediante lisi, quindi stimoliamo le cellule mononucleate con concanavalina A, un processo che induce i linfociti T a produrre tutte le citochine necessarie per la loro crescita. Per generare il TCGF, dobbiamo attivare le cellule.

Quindi, il metodo che utilizziamo consiste nell'aggiungere la lectina convalina, abbreviata come conA, al nostro coltura cellulare. Quando aggiungiamo la conA alla coltura cellulare, essa si lega al complesso del recettore per i linfociti T glicosilato e, legandosi a più complessi contemporaneamente, provoca quello che chiamiamo "capping". In questo modo, induce l'aggregazione, formando un ammasso di tutti i recettori sulla superficie cellulare, e ciò genera un segnale di attivazione nei linfociti T.

Dopo che le cellule si sono attivate, andranno incontro a blastizzazione. Quindi aumenteranno di dimensioni e inizieranno a secernere citochine. In origine pensavamo che il TCGF fosse principalmente l'interleuchina due, ma ora sappiamo che in realtà non è così.

Contiene inoltre interferone gamma, TNF alfa e probabilmente anche citochine in quantità molto ridotte, appena sufficienti a mantenere vive le cellule dopo 48 ore. In coltura, le cellule hanno prodotto tutte le citochine di cui abbiamo bisogno. Quindi procederemo a rimuovere le cellule e, una volta rimosse le cellule e ottenuto soltanto il sopranatante, avremo ancora del conal libero nel sopranatante. Questo rappresenterà un problema perché desideriamo utilizzare il nostro fattore di crescita delle cellule T per mantenere in crescita le linee cellulari T.

E se lasciamo la conval libera in tale ambiente, attiverà le cellule quando non vogliamo che vengano attivate. Per risolvere questo problema, aggiungeremo un eccesso di uno zucchero che si legherà a tutta la conval libera nell'ate. In questo modo sarà completamente inattivata e non si legherà ad altri recettori glicosilati sulle cellule quando aggiungeremo il TCGF alla coltura.

Iniziamo. Il primo passo per questo esperimento consiste nel prelevare le milze dai ratti subito dopo l'eutanasia. È proprio ciò che farò immediatamente utilizzando strumenti sterili.

E una volta che ho estratto le milze, le metterò in PBS integrato con antibiotici, in particolare penicillina e streptomicina. Cominciamo dunque. Spruzzo quindi il ratto con etanolo al 70% per assicurarmi di non introdurre alcuna contaminazione nella mia coltura.

E poi, utilizzando i miei strumenti, pratico un piccolo taglio nella pelle qui. Successivamente rimuovo lo strato muscolare e la milza appare proprio qui. Prendo quindi una pinzetta diversa ed estraggo delicatamente la milza senza danneggiarla.

Rimuovo il tessuto connettivo in questo modo. Ora ho una milza. Ovviamente, faccio molta attenzione a non danneggiare altre strutture all'interno della cavità addominale, poiché qualsiasi lesione all'intestino provocherebbe immediatamente la contaminazione della milza.

E poi trasferirò la milza in un tubo contenente PBS più antibiotici. Questo tubo lo mantengo sul ghiaccio. A questo punto ho isolato le milze da tre ratti.

Quindi siamo pronti a procedere e preparare una sospensione di singole cellule da quei milzi. Ora che ho i miei milzi, li ho portati in una cappa a flusso laminare per preparare una sospensione di singole cellule utilizzando filtri cellulari da 70 micron. Per ottenere la sospensione di singole cellule dai milzi, avrò bisogno di diverse cose.

Ho bisogno di strumenti sterili, una paio di pinze e un paio di forbici. Poi metto lo stantuffo di una siringa sterile da un millilitro nella piastra di Petri. Metterò le mie milze in PBS con antibiotici.

E in un'altra piastra di Petri ho posto un filtro cellulare da 70 micron in 10 millilitri di PBS più antibiotici. Il primo passo consiste quindi nell'assicurarsi che le milze siano pulite, poiché, come si può vedere qui, sono ancora presenti piccoli pezzi di tessuto connettivo che andrò a rimuovere perché ostruirebbero rapidamente il filtro cellulare. A tale scopo, taglio semplicemente la parte indesiderata e la scarto nel coperchio della piastra di Petri.

Ora i miei milzi sono per lo più puliti, quindi prenderò i milzi uno alla volta, li metterò nel colino cellulare e li taglierò in piccoli pezzi. Quindi mescolerò tutti e tre i milzi. Il passo successivo consiste nel preparare una sospensione di singole cellule. Ovviamente, poiché voglio mantenere tutto sterile, non tocco affatto il colino cellulare e uso lo stantuffo di una siringa sterile da un millilitro per spingere i pezzetti di milza attraverso il colino.

E come puoi vedere sulla parte esterna del dissociatore cellulare, sto ottenendo una sospensione di singole cellule. Quindi, la prima volta ho ancora alcuni piccoli frammenti di milza, ma preleverò comunque la sospensione di singole cellule. L'ho già trasferita in una provetta da 50 ml che ho conservato sul ghiaccio.

E ora ricaricherò il mio filtro cellulare con altri 10 ml di PBS e antibiotici. Prendo quindi altri 10 ml circa di PBS con antibiotici, non è necessario essere molto precisi, poiché stiamo semplicemente eseguendo un lavaggio. Lo aggiungo al filtro cellulare e poi applico la stessa procedura.

Torno al pistone della siringa e premo ulteriormente attraverso l'ocid. Ovviamente non riuscirete mai a far passare tutto, poiché ci sono tessuti connettivi e piccoli frammenti di grasso che non sono riuscito a rimuovere e che rimarranno nel filtro per cellule. Tuttavia, dovreste far passare la maggior parte della milza attraverso il filtro per cellule.

E poi ripeto esattamente ciò che ho fatto in precedenza. Procederò a raccogliere la mia sospensione di cellule singole e ad aggiungerla allo stesso dente. A questo punto, nel filtro del dissociatore cellulare è rimasto quasi niente e il PBS che esce è molto più limpido. Eseguirò semplicemente un ulteriore lavaggio e a questo punto dovremmo aver recuperato la maggior parte delle cellule.

Ora ho la mia sospensione di singole cellule di PLE citi e procederò a centrifugarle semplicemente per ottenere un pellet. Una centrifugazione di otto-dieci minuti sarà sufficiente. Ora abbiamo centrifugato i nostri PLE citi e abbiamo ottenuto un bel pellet.

Quindi, quello che farò è eliminare il soprannatante e poi lisare i globuli rossi. Sospenderò quindi i miociti in cloruro di ammonio. Si tratta di una soluzione di cloruro di ammonio 0,15 M e userò cinque millilitri per milza.

Quindi, poiché ho tre milze, utilizzerò 15 millilitri di cloruro di ammonio e lo farò sul ghiaccio. Per lisare gli eritrociti, pipetterò delicatamente su e giù per tre minuti. Ok, useremo questa immagine con l'esposizione più elevata qui.

Ora ho analizzato gli elettrociti per tre minuti. Riempirò il mio tubo con PBS oppure si può usare anche il mezzo. Questo serve a riportare l'osmolarità della soluzione nel range normale per le cellule.

E ora centrifugerò le cellule come ho fatto in precedenza per otto-dieci minuti, al fine di ottenere un pellet. Successivamente, le laverò due volte utilizzando lo stesso PBS con antibiotici. A questo punto abbiamo centrifugato le cellule dopo l'isolamento degli elettrociti e non preoccupatevi, non si ottiene mai un rilascio del cento per cento degli elettrociti.

Quindi la pastiglia sarà ancora rossa, ma il soprannatante sarà più limpido. Ora svuoterò il soprannatante, risospendendo la pastiglia, aggiungerò del PBS fino a 50 ml, centrifugerò e ripeterò questo passaggio un'altra volta, in modo da eseguire due lavaggi. A quel punto potrò procedere al conteggio. Ho lavato i miociti due volte, quindi li ho sospesi nel mezzo di coltura e ne ho effettuato il conteggio utilizzando il citometro.

Come previsto. Da tre milze ho ottenuto circa 600 milioni di cellule, il che è normale poiché una milza normalmente ci fornisce da 200 a 250 milioni di cellule. Quindi, quello che farò ora è seminare le mie cellule a 2 milioni per millilitro nel mio mezzo integrato con il 10% di siero fetale bovino.

E a quel mezzo aggiungerò due microgrammi per millilitro di concanavalina A per stimolare le cellule. Successivamente, metterò semplicemente le cellule nell'incubatrice per 48 ore. Le cellule sono ora state nell'incubatrice per 48 ore e, come vedrete, sono cresciute piuttosto bene.

Il mezzo è diventato arancione. Pertanto, siamo ora pronti per completare la preparazione del TCGF. Come ricorderete, ho aggiunto con carnaval alla mia sospensione cellulare per attivare le cellule.

Quindi la concanavalina A è una lectina. Si lega agli zuccheri presenti su tutti i recettori della cellula T e attiva artificialmente tutte queste cellule. Il problema che abbiamo ora è che nel surnatante cellulare è ancora presente una certa quantità di concanavalina A.

E poiché utilizzeremo una snat in altre colture di cellule T per espandere le cellule, non vogliamo che la con carnaval sia presente in quelle colture cellulari. Per eliminarla, aggiungerò un eccesso di zucchero a cui la con naval in a si lega, ovvero il metil alfa D citosio mostrato qui. Aggiungerò un eccesso di questo zucchero e lo scioglierò completamente.

Si legherà a tutta la conc. navale rimanente in a. Una volta completata questa fase, filtrerò in modo sterile i supernatanti cellulari e conserverò aliquote congelate per l'uso nelle prossime settimane o mesi. Cominciamo quindi questo ultimo passaggio. Aggiungo il supernatante di coltura cellulare in provette da 50 ml in modo da poterle centrifugare per eliminare le cellule.

Quindi riempio semplicemente tutti i tubi necessari e non lo faccio nella cappa, anche se potrei; tuttavia, poiché alla fine devo comunque filtrare la mia soluzione, dato che aggiungo lo zucchero, che non è sterile, eseguo questa operazione direttamente sul bancone. È più semplice. Ora ho versato tutte le mie cellule e il sopranatante nei miei tubi falcon da 50 ml.

Quindi li porterò alla centrifuga e li centrifugerò per circa 10 minuti. L'unico motivo per cui li centrifugo è quello di formare un pellet cellulare in modo da ottenere dei soprannatanti chiari. Le cellule sono ora state sedimentate, quindi il soprannatante è limpido ed è proprio ciò che desideravo raccogliere.

Quindi raccoglierò tutto il soprannatante in un nuovo flacone da 150 centimetri quadrati. A questo flacone aggiungerò lo zucchero. Mentre le cellule centrifugavano, ho pesato una quantità sufficiente di zucchero da aggiungere 15 milligrammi per ml di soprannatante.

Sto per lasciare completamente, lasciare che si sciolga, e dopo sterilizzerò per filtrazione il mio sopranatante. Ora aggiungerò lo zucchero a una concentrazione di 15 milligrammi per ml di sopranatante. Rimetto il tappo e, poiché non sto lavorando in condizioni sterili, non importa se entra aria nel tappo; mescolo finché tutto lo zucchero non si è sciolto.

Dovrebbe essere piuttosto rapido. Sì, tutto lo zucchero si è sciolto ora. Quindi devo solo filtrare in modo sterile il sopranatante e poi lo suddividerò in aliquote.

Di solito preparo aliquote da 10 a 15 ml che conservo a meno 20 gradi. Aliquote di questo tipo possono essere conservate per diversi mesi. È possibile anche conservare il TCGF in frigorifero, ma in tal caso lo utilizzerei entro i successivi 10-15 giorni.

Negli ultimi due giorni, ti ho mostrato come preparare il fattore di crescita delle cellule T, e questo supernatante è molto semplice da produrre ed economico da preparare. Per questo motivo lo utilizziamo spesso in laboratorio per mantenere le nostre linee cellulari T in coltura, senza dover acquistare costosi cocktail di citochine. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.