Preparazione T fattore di crescita cellulare da splenociti Rat

Ciao, sono Christine Beaton. Sono un assistente ricercatore nel laboratorio di George Chen presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. E nei prossimi due giorni vi mostrerò come preparare il TCGF, che sta per fattore di crescita delle cellule T.

Quindi, per la nostra coltura cellulare quotidiana, quando non abbiamo bisogno di una conoscenza precisa della composizione delle citochine nel terreno di coltura, ciò che usiamo è il fattore di crescita delle cellule T, che è il surnatante S della coltura CY spl che contiene le citochine necessarie per aiutare le cellule T ad espandersi. Quindi il modo in cui prepariamo il TCGF è quando uccidiamo ratti Louis sani, prendiamo le loro milze, prepariamo la sospensione di singole cellule, ci liberiamo dei globuli rossi con loro, e poi le cellule mononucleate che stimoleremo con il carbonio in a, che indurrà le cellule T a produrre tutte le citochine necessarie per la loro crescita. Per generare il TCGF, dobbiamo attivare le celle.

Quindi il modo in cui lo facciamo è aggiungere la lectina conviale in una forma abbreviata come corona A alla nostra coltura cellulare. Quindi, quando aggiungiamo il conc in a alla nostra coltura cellulare, si legherà al complesso del recettore delle cellule T glicosilato e si legherà a diversi complessi allo stesso tempo, farà quello che chiamiamo capping. Quindi si aggrega, crea un ammasso di tutti i recettori sulla superficie della cellula e questo indurrà un segnale di attivazione nei linfociti T.

Quindi, dopo che le cellule si sono attivate, esploderanno. Quindi si ingrandiranno e poi inizieranno a secernere citochine. Quindi inizialmente pensavamo che il TCGF fosse principalmente l'interleuchina due, ma ora sappiamo che non è proprio così.

Contiene anche interferone gamma TNF alfa e probabilmente anche citochine in quantità molto piccole che sono appena necessarie per mantenere in vita le cellule dopo 48 ore In coltura, le cellule hanno prodotto tutte le citochine di cui abbiamo bisogno. Quindi rimuoveremo le cellule e quando avremo rimosso le cellule e avremo solo il surnatante, avremo ancora un po' di conal libero in a nello snat. E questo sarà un problema perché vogliamo davvero usare il nostro fattore di crescita delle cellule T per mantenere le linee di cellule T in crescita.

E se lasciamo la convele libera lì dentro, attiverà le celle quando non vogliamo che vengano attivate. Quindi, per aggirare questo problema, aggiungeremo un eccesso di zucchero che si legherà a tutte le sostanze libere in a, nell'ato. Quindi sarà completamente inattivato e non si legherà ad altri recettori glicosilati sulle cellule quando aggiungiamo il TCGF alla coltura.

Quindi iniziamo. Il primo passo per questo esperimento è quello di estrarre la milza dal ratto subito dopo l'eutanasia. Quindi questo è quello che farò subito utilizzando strumenti sterili.

E una volta che ho la milza, li metto in PBS integrati con antibiotici e come antibiotici uso la penicillina e la streptomicina. Quindi iniziamo. Quindi spruzzo il ratto con etanolo al 70% per assicurarmi di non avere un'alta contaminazione della mia coltura.

E poi, usando i miei strumenti, farò un piccolo taglio nella pelle qui. Poi rimuovo lo strato di muscolo e la milza appare proprio qui. Quindi prendo altre pinzette, tiro fuori delicatamente la milza senza danneggiarla.

Rimuovo il tessuto connettivo in questo modo. Quindi ora ho la milza. Naturalmente, sto molto attento a non danneggiare nient'altro all'interno della cavità addominale perché qualsiasi danno all'intestino porterà alla contaminazione immediata della mia milza.

E poi trasferirò la mia milza in un tubo contenente PBS più antibiotici. E questo tubo lo tengo in ghiaccio. Così ora ho raccolto la milza da tre ratti.

Quindi siamo pronti per andare a preparare una sospensione a cellula singola da quelle milze. Quindi, ora che ho le mie milze, le ho portate in un centro di coltura tissutale per preparare una sospensione di una singola cellula da esse utilizzando trainer cellulari da 70 micron. Quindi avrò bisogno di diverse cose per fare la sospensione a cellula singola dalla milza.

Ho bisogno di strumenti sterili, un paio di pinze e un paio di forbici. Poi ho lo stantuffo di una siringa sterile da un mil nella capsula di Petri. Metterò la mia milza in PBS più antibiotici.

E in un'altra capsula di Petri ho messo un colino cellulare da 70 micron in 10 millilitri di PBS più antibiotici. Quindi il primo passo è assicurarsi che la milza sia pulita perché, come potete vedere qui, ci sono ancora piccoli pezzi di tessuto congiuntivo e li rimuoverò perché ostruiranno il filtro cellulare molto velocemente. Quindi, per questo, taglio semplicemente ciò che non voglio e lo scarto nel coperchio della capsula di Petri.

Quindi ora le mie milze sono per lo più pulite, quindi prenderò le milze una per una, le metterò nel cell trainer e le taglierò in piccoli pezzi e mescolo tutte e tre le milze. Il passo successivo è quello di realizzare una sospensione a cella singola. Quindi, naturalmente, dato che voglio tutto, non tocco affatto il trainer cellulare e uso lo stantuffo di una siringa sterile da un mil per premere i miei pezzi di milza attraverso il trainer cellulare.

E come puoi vedere all'esterno del trainer cellulare, ho una sospensione a cella singola in fase di realizzazione. Quindi la prima volta ho ancora alcuni piccoli pezzi di milza, ma sto già per togliere la sospensione a cellula singola. L'ho già trasferito in un tubo da 50 mil che ho conservato sul ghiaccio.

E riempirò il mio filtro cellulare con altri 10 mil di PBS e antibiotici. Quindi prendo 10 mil in più del mio PBS con antibiotici circa, non devono essere esattamente 10 minuti, ci stiamo solo lavando. Lo metto nel colino cellulare e poi uso lo stesso procedimento.

Torno allo stantuffo della siringa e premo ancora un po' l'ocid. Quindi, naturalmente, non riuscirai mai a far passare tutto perché c'è del tessuto congiuntivo e piccoli pezzi di grasso che non sono stato in grado di rimuovere e che rimarranno nel filtro cellulare. Ma dovresti prendere la maggior parte della tua milza per il colino cellulare.

E poi ripeto esattamente quello che ho fatto prima. Raccoglierò la mia sospensione a cellula singola e la aggiungerò allo stesso dente. Ormai non c'è quasi nulla dallo schermo rimasto nello screener delle celle e il PBS che esce è molto più chiaro E ho intenzione di lavare semplicemente ancora una volta e dovremmo avere la maggior parte delle celle fuori ormai.

Quindi ora ho la mia sospensione a cellula singola di citi PLE e li farò girare semplicemente per tavolozzarli. Quindi girare per 8-10 minuti sarà sufficiente. Quindi ora abbiamo ridotto i nostri citi PLE e abbiamo una bella tavolozza.

Quindi quello che farò è sbarazzarmi del surnatante e poi andrò a leggere i globuli rossi. Quindi sospenderò i miociti e andrò nel cloruro di ammonio. Quindi è un SU, una soluzione di cloruro di ammonio molare da 15 punti e userò cinque millilitri per milza.

Quindi, dato che avevo tre milze, userò 15 millilitri di cloruro di ammonio e lo farò sul ghiaccio. Quindi, per mentire gli eritrociti, li convoglierò delicatamente su e giù per tre minuti. Ok, useremo questa ripresa con l'esposizione più alta qui.

Quindi ora ho analizzato gli elettrociti per tre minuti. Riempirò il mio tubo con PBS o potresti usare anche il medio. Questo per riportare l'osmolarità della soluzione all'intervallo normale per le cellule.

E farò girare le celle verso il basso come ho fatto in precedenza per 8-10 minuti per pellettizzarle. E poi li lavo due volte usando lo stesso PBS con antibiotici. Quindi ora estendiamo le cellule dopo aver polarizzato gli elettrociti e non preoccupatevi di non ottenere mai il cento per cento di rilasci di elettrociti.

Quindi il pallet sarà ancora rosso, ma il surnatante sarà più chiaro. E ora svuoterò il surnatante, romperò la palé, aggiungerò un po' di PBS fino a 50 mil, centrifugherò e ripeterò quel passaggio ancora una volta in modo da avere due lavaggi e poi sarò in grado di contare me stesso. Ho lavato i miociti due volte e poi li ho sospesi in terreno di coltura e li ho contati usando il citometro.

Come previsto. Da tre milze ho ottenuto circa 600 milioni di cellule, il che è previsto dato che una milza normalmente ci dà da 200 a 250 milioni di cellule. Quindi quello che farò ora è seminare le mie cellule a 2 milioni per mulino nel mio terreno che è stato integrato con il 10% di siero cal fetale.

E a quel mezzo aggiungerò due microgrammi per millimetro di conc A per stimolare le cellule. E dopo di che metterò semplicemente le cellule nell'incubatrice per 48 ore. Le cellule sono rimaste nell'incubatrice per 48 ore e, come vi mostrerò, sono cresciute abbastanza bene.

Il mezzo è diventato arancione. Quindi ora siamo pronti a finire la nostra preparazione per il TCGF. Come ricorderete, ho aggiunto il carnaval in una sospensione nella mia cella per attivare le cellule.

Quindi il concarnaval in a è la lectina. Legherà gli zuccheri su tutti i recettori della cellula T e attiverà artificialmente tutte quelle cellule. Il problema che abbiamo ora è che abbiamo ancora un po' di concarnaval in un, nel surnatante della cellula S.

E dal momento che useremo una trappola in altre colture di cellule T per espandere le cellule, non vogliamo che il concarnale sia presente in quelle colture cellulari. Quindi, per sbarazzarmene, quello che farò è aggiungere un eccesso di zucchero a cui si lega il colesterolo in a, e questo è il metil-alfa D cito mostrato qui. E aggiungerò un eccesso di questo zucchero per scioglierlo completamente.

E una volta fatto, filtrerò sterile i miei surnatanti cellulari e congelerò i liquidi Ali per l'uso nelle prossime settimane o mesi. Quindi iniziamo con quest'ultimo passaggio. Quindi sto aggiungendo il mio surnatante per colture cellulari a provette da 50 mil per poterle far girare e sbarazzarmi delle cellule.

Quindi riempio semplicemente tutte le provette necessarie e non lo faccio nella cappa di coltura, potrei, ma poiché ho bisogno di un modo per filtrare la mia soluzione alla fine perché sto aggiungendo lo zucchero, che non è sterile, lo faccio semplicemente sul banco. È più facile. Ora ho versato tutte le mie cellule e il surnatante nelle mie provette da 50 mil.

Quindi li porterò alla centrifuga e li farò girare per circa 10 minuti. E l'unico motivo per farli girare è quello di pellettare le celle in modo da avere dei surnatanti chiari. Le celle sono state ora allungate, quindi il surnatante è chiaro ed è quello che volevo raccogliere.

Quindi raccoglierò tutto il surnatante in un pallone pulito di 150 centimetri quadrati. E a questa fiaschetta aggiungo lo zucchero. Così, mentre le cellule giravano, ho pesato abbastanza zucchero per aggiungere 15 milligrammi per ml di surnatante.

Lo lascerò completamente sciogliere, e dopo di che filtrerò sterile il mio surnatante. Quindi ora aggiungerò lo zucchero 15 milligrammi per ml di surnatante. Ho rimesso il tappo e dato che non sto lavorando in condizioni sterili, non importa se mangiato va nel tappo, quindi mescolo fino a quando tutto lo zucchero non si è sciolto.

Dovrebbe essere abbastanza veloce. Sì, ora tutto lo zucchero è sciolto. Quindi tutto quello che devo fare è che il filtro sterile è surnatante e poi lo aliquoterò.

Quindi normalmente faccio da 10 a 15 mil di aliquote che conservo a meno 20 gradi. Aliquote di questo tipo possono essere conservate per diversi mesi. Puoi anche conservare il tuo TCGF in frigorifero, ma poi lo userei entro i prossimi 10-15 giorni.

Negli ultimi due giorni, vi ho mostrato come preparare il fattore di crescita delle cellule T, e questo surnatante è molto semplice da preparare ed è molto economico da preparare. Quindi lo usiamo molto spesso in laboratorio per mantenere le nostre linee di cellule T in coltura senza dover acquistare costosi cocktail di citochine. Quindi buona fortuna con i tuoi esperimenti.