基因改造的Picoeukaryote Ostreococcus金牛

该程序的总体目标是生成和选择新型模式生物 Austria Occus Tori 的稳定成沟系，Austria Occus Tori 是一种海洋微型真核生物 lgal 物种。这是通过首先在每次转化从 50 毫升致密 ALG 培养物中生成细胞沉淀来实现的。第二步是将细胞与线性化 DNA 混合，然后进行电穿孔。

在新鲜、培养基中稀释转化细胞并孵育过夜后，加入 0.2% 低熔点 aase 和选择性试剂，然后将混合物倒入小培养皿中。最后一步是挑选在恒定蓝光下孵育 2 到 3 周后生长的菌落。最终，在液体、培养基和随后的分子分析（如 PCR 和 Southern blot）中进行选择，以证明构建体成功整合到生成的转基因系的基因组中。

与拟南芥等现有模式生物相比，使用这种生物体的主要优点是大大降低了基因组复杂性，从而允许在几乎没有遗传冗余的情况下在后台研究调控网络。虽然在我的实验室里，我们使用骨枕来研究植物的生物钟，但它也可以用于研究许多其他复杂的细胞网络。因此，这项技术的意义远远超出了植物生物学的领域。

这种方法的视觉演示至关重要，因为尽管各个步骤看起来相当简单，但正确处理细胞和高效的工作流程对于获得良好结果至关重要。该程序的部分内容将由实验室的研究助理 Culin Kish 演示。将 Austria Occus 细胞在人工海水或 SW 中培养，制备每升 40 克的 SW 溶解液。

去离子水中的海盐浓度为千分之 30 或 PPT。使用盐度计添加富集、中等微量金属元素和维生素，然后在恒定光照下通过 0.22 微米过滤器对奥地利尾鸢菌株 O TT H 95 的总细胞进行过滤消毒。在装有月光蓝过滤器的植物生长培养箱中，光照强度应接近每秒每平方米 20 微摩尔，并保持在 20 摄氏度的温度细胞不需要不断搅拌，但每两到三天摇动一次以防止聚集。

为了维持，每 7 天在新鲜 SW 中以 1 至 100 的稀释度无菌传代培养细胞。每次转化需要 50 毫升细胞，细胞密度为 20 至 30 倍/毫升 10 至 6 个细胞。传代培养后 5 至 7 天应达到此密度。

近似细胞密度和 axe 可以在血细胞仪上估计至少 40 倍。放大或优先通过流式细胞术确定。此处显示了正常区域性与不正常区域性的示例。

每个生物参数图在 y 轴上显示侧向散射或 SSC，而在 x 轴上显示每个细胞的红色荧光或 FL 3。FL 3 代表叶绿素红色荧光，SSC 表示相对细胞大小。健康细胞落入奥地利人占窗口，而垂死细胞或污染细菌落入此窗口外。

理想情况下，超过 99% 的像元应位于 Austria Occus 窗口中。为了实现高效的遗传转化，每次转化需要 5 μg 纯线性化质粒，DNA 浓度为 1 μg/μL。在无菌去离子水中，质粒已被一种酶线性化，该酶在所用载体的骨架中切割，但在转基因或选择基因中未切割。

将含有 DNA 的微量离心管放在冰上，每次转化时将 2 毫米电穿孔管放在冰上。要转化的每个细胞系都需要不含 DNA 的对照。对于每次转化，将 50 毫升细胞转移到锥形底部的试管中，加入 0.1% 糖酸 F 68，并在 10 摄氏度下以 8， 000 倍 G 离心 10 分钟。

要沉淀细胞，请立即丢弃 sup natant，并向细胞中加入 1 毫升 Resus 悬浮缓冲液。Resus 通过上下移液悬浮细胞，转移到微型垃圾管中，并以 8， 000 次的速度旋转 10 分钟。G 在 10 摄氏度下工作，在第二次旋转后再次快速洗涤细胞。

切开 P 200 尖端，将每个沉淀重悬于 40 微升 Resus 悬浮液中。将 40 μL 重悬细胞缓冲到每管冰上的线性化 DNA 中。轻轻混匀并转移到电穿孔 vete 中。

将 vete 放入电穿孔机中。将设置调整为每个倒易传感器 6 千伏、600 欧姆和 25 微天。电穿孔后对细胞进行电作。

将细胞在比色皿中室温孵育 10 分钟。在此期间，标记组织培养瓶并向每个培养瓶中加入 30 毫升新鲜的 a SW。从每个培养瓶中取出 1 毫升 SW，轻轻加入相应的 vete 中孵育 2 分钟。

接下来，轻轻地取出现在包含细胞 glo 的 a SW，然后轻轻缓慢地直接抚摸到 a SW.In 培养瓶细胞通常会保持在大 glo 中。此时注意不要摇晃或干扰聚集的单元格。让细胞在培养箱中恢复 1 到 2 小时。

最后，通过手动摇动培养瓶重悬细胞。此时，细胞应自由重悬，并且不应看到任何团块。将培养物在电穿孔后的第二天在培养箱中回收过夜，将 2.1% 低熔点溶液在含有星形棒的瓶子中的双蒸水中高压灭菌。

将熔融温度保持在 65 至 90 摄氏度的较大烧杯中，放在加热磁力 STARR 上的盛水烧杯中。对于每次转化，准备 8 个 50 毫米培养皿和 8 个 50 毫升试管，每个试管含有 9 毫升 SW plus。必需的选择。

从培养箱中收集转化细胞。该程序最困难的部分是将转化的细胞包入低百分比的 agros 凝胶中，而不会因将细胞暴露在过多的热量下而破坏细胞的完整性。因此，快速有效地执行程序的接下来几个步骤非常重要。在无菌流动罩中工作。

将 1 毫升接近沸点的低熔点 aase 加入 9 毫升 SW.In 其中一根试管中，关闭试管并倒置混合。接下来，加入 0.5 毫升新鲜转化的细胞。快速关闭并倒置试管以混合，然后将其内容物倒入培养皿中。

对剩余的 7 个试管重复此过程，然后继续下一个转化瓶。将盘子放在流罩中打开一个小时，让 aray 凝固。然后盖上培养皿，小心地将它们转移到大方形培养皿中，每个培养皿装有四个圆形培养皿。

由于培养皿没有完全凝固，凝胶非常脆弱。处理餐具时要小心不要破坏凝胶。用 Paraform 密封方形培养皿，然后将它们放入培养箱中。

一旦出现菌落，使用带有切割尖端的 200 μL perpe。要在无菌罩中挑选菌落，只需选择游离菌落并吸出绿色菌落即可。注意不要包含来自邻近菌落的任何细胞。

将细胞转移至含有所选成分的 2 mL 液体培养基中。在 24 孔板中，通过上下抚摸混合。每次转化选择 24 或 48 个克隆后，用 para 膜密封板并转移至培养箱中。

一周后，将每个孔的 100 微升转移到 2 毫升新鲜的 SW 中，并进行选择。在 24 孔板中再生长 7 天。当转化 5 μg 线性化 DNA 时，存活的细胞系可用于进一步研究。

使用此方案。每个转化板应在 2 到 3 周后出现 20 到 60 个克隆。大约 80% 的挑选的菌落在液体培养基中被抗生素耐药性阳性选择，并用于遵循此程序的后续研究。

随后可以进行其他方法，如 PCR 或 Southern blot，以验证沟基因发育后的插入数和位置。这项技术使生物钟和细胞周期领域的研究人员能够了解他们各自系统的复杂组成部分和行为 在这个新的模式生物 Austria Caucus 中。Tori，看完这个视频，你应该对如何生成转基因奥地利核心小组系有很好的了解。