Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare il rilevamento di micro metastasi nel polmone del mouse ex vivo, preservando al contempo l'architettura dei polmoni in stato gonfiato. Questo risultato si ottiene innanzitutto perfondendo il polmone in situ con PBS per rimuovere il sangue, che rappresenta la principale fonte di fondo cromatico in tale tessuto. I passaggi successivi consistono nell'insufflare il polmone mediante iniezione di PFA, quindi pinzare per fissare il tessuto polmonare in condizione di gonfiamento.

Successivamente, il polmone viene rimosso e ulteriormente fissato in PFA oppure singoli lobi polmonari vengono inclusi per la criosezionatura. I passaggi finali consistono nella colorazione dei tessuti con soluzione Xal e nella visualizzazione delle cellule tumorali LA zag; in definitiva, le metastasi possono essere rilevate a livello di singola cellula su lobi polmonari interi o su sezioni di tessuto polmonari mediante microscopio binoculare o microscopio ottico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo sky standing on its own, è che la rilevabilità delle micrometastasi migliora notevolmente grazie all'eliminazione dello sfondo legato al sangue.

Iniziare il protocollo anestetizzando un topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina, xilazina e acepromazina in circa 150 microlitri di PBS. Quando i riflessi al dolore del topo non sono più osservabili, fissarlo sul tavolo operatorio. Rasare e passare l'alcol al 70% sul pelo.

Aprire la pelle dall'addome fino al collo. Tirare la pelle ai lati o rimuoverla. Aprire con attenzione il peritoneo nel torace per evitare la rottura di vasi sanguigni importanti come le vene giugulari.

Questo migliorerà l'efficienza della perfusione. Ora recidere la vena cava cardiaca al di sotto del fegato utilizzando una siringa da 20 millilitri con un ago da 21 a 24 gauge. Iniettare lentamente da 10 a 15 millilitri di PBS nel ventricolo destro del cuore in battito finché il polmone non diventa completamente bianco e il cuore non cessa di battere.

Poi occludere con un clamp vascolare i vasi sanguigni sopra il fegato e il diaframma. Caricare una siringa da 10 millilitri con paraformaldeide al 3% e, utilizzando un ago da 21 a 24 gauge, iniettare nel ventricolo destro. Circa due millilitri.

Scoprire la trachea al di fuori della cavità toracica e insufflare i polmoni mediante un'iniezione di circa tre millilitri di aldeide nella trachea dall'esterno della cavità toracica. Subito dopo aver rimosso l'ago, occludere la trachea in corrispondenza del punto di puntura con una pinza vascolare e attendere 10 minuti per consentire la fissazione. Successivamente, sezionare i vasi sanguigni al di sopra della pinza vascolare.

Quindi rimuovere la pinza ed iniettare circa due millilitri di PBS nel ventricolo destro per eliminare l'eccesso di formaldeide. Pungere le parti inferiori di tutti i lobi polmonari con un ago ed eliminare la pinza vascolare dalla trachea. Iniettare ora tre-cinque millilitri di soluzione di inclusione diluita nella trachea, procedendo in modo analogo all'altra iniezione.

Interrompere l'iniezione quando il paraform che si trova nei lobi polmonari viene sostituito dalla soluzione. Rimuovere con attenzione il polmone tirando il cuore con una pinza e sezionando i legamenti di tessuto connettivo, i vasi sanguigni e la trachea. Assicurarsi che il cuore rimanga collegato ai polmoni.

Mettere da parte un lobo per sezioni crio e utilizzare il tessuto polmonare rimanente per la colorazione dell'intero polmone. Posizionare il polmone in un bicchiere di plastica con coperchio ermetico e fissarlo con formaldeide al 2% in soluzione salina fosfato (PBS). Apporre un pezzo di garza sulla sommità del polmone per mantenerlo immerso nella soluzione e lasciarlo a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo mezz'ora, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare accuratamente il tessuto con PBS per 3 volte. Preparare fresca la soluzione xal pronta all'uso diluendo un millilitro di soluzione madre xal, uno a 40, nella soluzione di colorazione di base e aggiungere almeno 10 millilitri della soluzione nel contenitore. Immergere il polmone con un pezzo di garza. Fissare il coperchio in modo lento per consentire lo scambio d'aria e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque ore al riparo dalla luce.

Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di xal. Lavare i polmoni una volta con PBS per rimuovere la soluzione residua di xal e aggiungere almeno 10 millilitri di paraformaldeide al 4% in PBS. Il tessuto è ora pronto per l'istologia e può essere conservato a lungo nel PFA al 4% a quattro gradi Celsius.

Iniziare riempiendo un terzo di uno stampo per inclusione con mezzo di inclusione poly forze non diluito. Quindi inserire il lobo polmonare nello stampo e continuare ad aggiungere mezzo fino a quando il lobo non è completamente ricoperto. Evitare con cura la formazione di bolle d'aria, quindi incubare il lobo incluso a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, preparare i polmoni inclusi per il taglio congelandoli lentamente in una miscela di anidride carbonica solida e isopentano. Se necessario, possono ora essere trasferiti in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione. Tagliare al criostato sezioni criogeniche di sette-dieci micron del lobo e montare le sezioni su vetrini criogenici pronti all'uso disponibili in commercio. Una volta montate, incubare immediatamente le sezioni nella soluzione di colorazione Xal a 37 gradi Celsius per 24 ore in una camera umidificata. Il giorno successivo, risciacquare i vetrini due volte in PBS, per cinque minuti ciascun risciacquo.

Proseguire con un breve risciacquo in acqua distillata. Colorare ora le preparazioni con rosso nucleare rapido per 10 secondi per ottenere una controcolorazione debole che rende lo xal più dominante, quindi risciacquare immediatamente la controcolorazione con acqua distillata. Per una controcolorazione più intensa, prolungare il tempo fino a 30 secondi o più.

Montare i vetrini con immuno mount. La formazione di metastasi nei modelli murini di OS LM otto è stata riesaminata. Utilizzando le immagini rappresentative qui descritte di polmoni perfusi e non perfusi di topi inoculati contemporaneamente con cellule LM otto trasdotte con laxy e non trasdotte, controllate e LM otto, in topi inoculati con cellule controllate e LM otto.

Metastasi macroscopiche e microscopiche sono rimaste indetectabili nei polmoni non perfusi e nei polmoni perfusi. Ma in modo interessante, nei topi inoculati con cellule Dun LA Z, la colorazione XGAL ha rivelato foci micrometastatici blu costituiti da singole cellule o piccoli aggregati cellulari sulla superficie dei polmoni non perfusi. La perfusione e fissazione in situ dei polmoni migliora ulteriormente la rilevabilità delle micrometastasi Dun LA Z. Tuttavia, non è stata osservata una crescita fino a foci macroscopici nei topi inoculati con cellule di controllo LM otto. Foci macro-metastatici traslucidi, appena rilevabili, di diametro superiore a 0,1 millimetro, sono stati identificati nei polmoni non perfusi. La perfusione polmonare non ha migliorato il riconoscimento di tali foci.

Tuttavia, nei topi iniettati con cellule LAC Z ate, sono state rilevate multiple metastasi macroscopiche blu alla colorazione con X-gal sulla superficie degli organi non perfusi. Sono state inoltre rilevate metastasi microscopiche sulla superficie degli organi non perfusi. Inoltre, la perfusione dei polmoni ha ulteriormente migliorato la rilevabilità delle metastasi macroscopiche e microscopiche.

Di conseguenza, micro e macro metastasi divennero visibili con una densità maggiore e in numero più elevato, principalmente a causa della traslucenza del tessuto perfuso, nella quale furono osservati anche foci al di sotto della superficie dell'organo. Un'analisi istologica aggiuntiva mediante sezioni criogeniche di tessuto polmonare confermò il miglioramento nella rilevabilità delle metastasi polmonari nei topi inoculati con cellule LAX Z transdotte e cellule LM otto nei topi con tumori primari derivati dalle cellule Dun LAX Z. Nelle sezioni polmonari furono riconosciute micro metastasi o addirittura foci costituiti da singole cellule.

Questo non è stato osservato nei topi con tumori primari derivati dalle rispettive cellule di controllo. Inoltre, le macro metastasi erano anche più chiaramente visibili nei topi inoculati con cellule LM otto LA C rispetto agli animali con cellule di controllo LM otto. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la perfusione e la fissazione polmonare in ZI due e la successiva colorazione immunoistochimica delle metastasi nei polmoni asportati.

Questa tecnica rappresenta un metodo altamente sensibile per valutare la distribuzione delle metastasi nel polmone in qualsiasi tipo di studio sul cancro e può inoltre fungere da parametro di riferimento per il miglioramento delle attuali tecniche di imaging in vivo, come la micro-TC, la PET e la risonanza magnetica, utilizzate per la rilevazione precoce delle lesioni metastatiche.