Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata In-situ del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del LacZ-Tagged cellule tumorali

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare il rilevamento di micro metastasi nel polmone di topo ex vivo, preservando l'architettura polmonare gonfiata. Ciò si ottiene perfondendo prima il polmone in situ con PBS per rimuovere il sangue, che è la principale fonte di sfondo colorato in quel tessuto. I passaggi successivi sono gonfiare il polmone mediante iniezione di PFA, quindi pizzicare per fissare il tessuto polmonare sotto gonfiaggio.

Successivamente, il polmone viene rimosso e ulteriormente fissato in PFA o i singoli lobi polmonari vengono incorporati per la criosezione. Le fasi finali consistono nel colorare i tessuti in soluzione Xal e visualizzare le cellule tumorali LA zag. Infine, le metastasi su interi lobi polmonari o in sezioni di tessuto polmonare possono essere rilevate fino al livello di una singola cellula con un microscopio binoculare o un microscopio ottico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il cielo in piedi da solo, è che la rilevabilità delle micro metastasi è notevolmente migliorata grazie alla rimozione del fondo correlato al sangue.

Inizia il protocollo anestetizzando un topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina, xilazina e ace promazina in circa 150 microlitri di PBS. Quando i riflessi del dolore del mouse non si osservano più, fissarlo sul tavolo operatorio. Torna indietro e liscia i capelli con etanolo al 70%.

Aprire la pelle dall'addome fino al collo. Tirare la pelle ai lati o rimuoverla. Aprire con cautela il peritoneo nel torace per evitare la rottura di vasi grandi come le giugulari venose.

Ciò migliorerà l'efficienza della perfusione. Ora taglia la vena cava cardis sotto il fegato usando una siringa da 20 millilitri con un ago da 21 a 24 gauge. Iniettare lentamente da 10 a 15 millilitri di PBS nel ventricolo destro del cuore pulsante fino a quando il polmone è completamente bianco e il cuore smette di battere.

Quindi pizzicare i vasi sanguigni sopra il fegato e il diaframma con un morsetto vascolare. Caricare una siringa da 10 millilitri con aldeide paraforme al 3% e iniettare nel ventricolo destro con un ago da 21 a 24 gauge. Circa due millilitri.

Scoprire la trachea all'esterno del torace e gonfiare il polmone con un'iniezione nella trachea di circa tre millilitri di aldeide dall'esterno del torace. Quindi, subito dopo aver rimosso l'ago, pizzicare la trachea coccolata alla puntura con una pinza vascolare e attendere 10 minuti per consentire la fissazione. Quindi, sezionare i vasi sanguigni sopra il morsetto vascolare.

Quindi rimuovere il morsetto e iniettare circa due millilitri di PBS nel ventricolo destro per rimuovere la formaldeide in eccesso. Perforare le parti inferiori di tutti i lobi polmonari con un ago e rimuovere il morsetto vascolare in corrispondenza della trachea. Ora iniettare da tre a cinque millilitri di soluzione incorporante diluita nella trachea coccolata dall'altra iniezione.

Interrompere l'iniezione quando la pelle paraforme nei lobi polmonari viene sostituita dalla soluzione. Rimuovere il polmone con cautela tirando il cuore con una pinza e sezionando i legamenti del tessuto connettivo, i vasi sanguigni e la trachea. Assicurati di mantenere il cuore collegato ai polmoni.

Mettere da parte un lobo per le sezioni criogeniche e utilizzare il tessuto polmonare rimanente per l'intera colorazione lunga. Metti il polmone in un bicchiere di plastica con un coperchio a chiusura ermetica e fissalo con il 2% di formaldeide e PBS. Metti un pezzo di garza sopra il polmone per tenerlo nella soluzione e lascialo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo mezz'ora, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare accuratamente il fazzoletto Con PB S3 volte, preparare appena la soluzione xal pronta all'uso diluendo un millilitro di soluzione madre Xal, da uno a 40 nella soluzione colorante di base e aggiungerne almeno 10 millilitri nella coppa. Affondare il polmone con un pezzo di garza. Fissare il coperchio senza stringere per consentire il ricambio d'aria e incubarlo a 37 gradi Celsius per tre-cinque ore al riparo dalla luce.

Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione xal. Sciacquare i polmoni una volta con PBS per rimuovere la soluzione xal residua e aggiungere almeno 10 millilitri di aldeide paraforma al 4% in PBS. Il tessuto è ora pronto per l'istologia e può essere conservato a lungo nel PFA al 4% a quattro gradi Celsius.

Iniziare riempiendo un terzo di uno stampo da inclusione con un mezzo da inclusione in poliforze non diluito. Quindi caricare il lobo polmonare nello stampo e continuare ad aggiungere terreno fino a coprire completamente il lobo. Evitare accuratamente di formare bolle d'aria, ora incubare il lobo incorporato a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, preparare i polmoni incorporati per il sezionamento congelandoli lentamente in una miscela di ghiaccio secco e isop pentano. Se necessario, possono ora essere trasferiti in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione su un criostato tagliato da sette a 10 micron di sezioni criogeniche del lobo per montare le sezioni su vetrini pronti per la sezione criogenica disponibili in commercio Una volta montate, incubare immediatamente le sezioni in una soluzione colorante xal a 37 gradi Celsius per 24 ore in una camera umidificata. Il giorno successivo, sciacquare i vetrini in PBS due volte per cinque minuti per risciacquo.

Seguire questo con un breve risciacquo in acqua distillata. Ora controcolora i vetrini con il rosso nucleare veloce per 10 secondi per ottenere una colorazione di contrasto debole che rende lo xal più dominante e risciacqua immediatamente la macchia di contrasto con acqua distillata. Per una macchia di contrasto più scura, prolungare il tempo fino a 30 secondi o più.

Montare i vetrini con supporto immuno. La formazione di metastasi nei modelli murini di OS LM otto è stata riesaminata. Utilizzando le immagini rappresentative qui descritte di polmoni perfusi e non perfusi di topi iniettati contemporaneamente con laxy trasdotto e non trasdotto controllato done e LM otto cellule in topi iniettati con cellule controllate done.

Le metastasi macroscopiche e microscopiche sono rimaste non rilevabili nei polmoni non perfusi e perfusi. Ma è interessante notare che nei topi iniettati con cellule LA Z dun, la colorazione xgl ha rivelato focolai micrometastatici blu di singole cellule o piccoli gruppi cellulari sulla superficie dei polmoni non perfusi La perfusione in situ e la fissazione dei polmoni migliorano ulteriormente la rilevabilità delle micro metastasi dun la z, tuttavia, la crescita in focolai macroscopici non è stata osservata nei topi iniettati con LM di controllo otto cellule traslucide, Focolai macrometastatici appena rilevabili di diametro superiore a 0,1 millimetri sono stati riconosciuti nei polmoni non perfusi. La perfusione del polmone non ha migliorato l'individuazione dei focolai.

Tuttavia, nei topi iniettati con cellule Z LAC ate, sono state rilevate macrometastasi multiple di blu con colorazione X gal sulla superficie degli organi non perfusi. Micro metastasi sono state rilevate anche sulla superficie di organi non perfusi. Inoltre, la perfusione polmonare ha ulteriormente migliorato la rilevabilità di macro e micro metastasi.

Di conseguenza, le micro e macro metastasi sono diventate visibili con una densità più elevata e un numero maggiore, principalmente a causa della traslucenza del tessuto perfuso in cui sono diventati visibili anche i focolai sotto la superficie dell'organo. Un'ulteriore analisi istologica utilizzando sezioni criogeniche di tessuto polmonare ha confermato la migliore rilevabilità delle metastasi polmonari nei topi iniettati con cellule LAX Z trasdotte done e LM otto nei topi con tumori primari derivati da cellule Dun LAX Z. Micro metastasi o anche focolai di singole cellule sono stati riconosciuti nelle sezioni polmonari.

Questo non è stato osservato nei topi con tumori primari delle rispettive cellule di controllo. Inoltre, le macro metastasi erano anche più chiaramente visibili nei topi iniettati con LM otto cellule LA C rispetto agli animali con le otto cellule LM di controllo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la perfusione polmonare e la fissazione in ZI due e la successiva colorazione con exci delle metastasi nei polmoni asportati.

Questa tecnica è una lettura dell'endpoint altamente sensibile per la distribuzione delle metastasi nel polmone in qualsiasi tipo di studio sul cancro e può anche servire come punto di riferimento per il miglioramento delle attuali tecniche di imaging in vivo, come la micro ct, la PET e la risonanza magnetica utilizzate per la diagnosi precoce delle lesioni metastatiche.