Name: Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata In-situ del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del LacZ-Tagged cellule tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a rilevare metastasi polmonari a risoluzione singola cella nel topo combinando perfusione in situ e colorazione X-Gal di cellule tumorali marcate con lacZ. Questo metodo riduce il rumore di fondo sanguigno e migliora la visibilità delle micro metastasi preservando l'architettura polmonare.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Lubor Borsig (Istituto di Fisiologia, Università di Zurigo) per i suoi consigli sulla tecnica della perfusione polmonare. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Krebsliga del Cantone di Zurigo, la L. Walter e Johanna Wolf Foundation, Zurigo, il Lydia Hochstrasser Foundation, Zurigo, il Fondo nazionale svizzero, SNF, Svizzera, Schweizerischer Verein Balgrist, e l&#39;Università di Zurigo.

1. In-situ perfusione polmonare e fissaggio <ol><li> Anestetizzare topi mediante iniezione ip di ~ 150 microlitri soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 112,5 mg / kg (di peso corporeo) ketamina, 16,5 mg / kg xilazina, e 15 mg / kg acepromazina (o da un altro anestesia contenente antidolorifici adeguati). </li><li> Quando riflessi del mouse non sono più rispettate, fissarlo sul tavolo operatorio indietro verso il basso e bagnare il pelo con il 70% di etanolo lisci i capelli giù. </li><li> Aprire la pelle dall&#39;addome fino al collo e tirare ai lati o rimuoverlo. </li><li> Aprire il peritoneo e il torace ad una dimensione ampia. Evitare rotture di vasi grandi (ad esempio il jugularis vena) per evitare una perdita di efficienza perfusione successivo. </li><li> Tagliare il caudalis vena cava sotto il fegato. </li><li> Utilizzare una siringa da 20 ml dotato di un 21G - ago 24G per iniettare lentamente 10-15 ml PBS nel ventricolo destro del cuore battere fino al polmone è completamente bianco eil cuore smette di battere (asistolia). </li><li> Afferrare i vasi sanguigni di cui sopra il fegato e il diaframma con una pinza vascolare. </li><li> Utilizzare una siringa da 10 ml dotato di un 21G - ago 24G per iniettare ~ 2 ml del 3% paraformaldeide (PFA) in PBS nel ventricolo destro. </li><li> Scoprire la trachea all&#39;esterno del torace. Utilizzare la stessa siringa per iniettare ~ 3 ml del 3% in PBS PFA craniale (fuori del torace) nella trachea fino ai polmoni è gonfiato. Immediatamente dopo la rimozione dell&#39;ago, pizzichi via caudale trachea della puntura con una pinza vascolare e attendere per 10 minuti per consentire fissaggio. </li><li> Transect i vasi sanguigni di sopra della pinza vascolare, rimuovere la fascetta e iniettare ~ 2 ml PBS nel ventricolo destro per rimuovere l&#39;eccesso PFA. </li><li> Forare le parti inferiori di tutti i lobi polmonari con un ago, rimuovere la pinza vascolare alla trachea e iniettare 3-5 ml di una soluzione di PolyFreeze incorporamento medio / PBS 01:01 nella trachea caudale della puntura prima fino alla PFA nella polmonelobi è sostituita dalla soluzione. </li><li> Rimuovere il polmone tirandola il cuore con una pinza e da sezionare legamenti del tessuto connettivo, vasi sanguigni e la trachea. Mantenere il cuore collegato ai polmoni. </li><li> A seconda di come procedere con l&#39;analisi del tessuto polmonare continuare con i protocolli descritti nelle sezioni 2 o 3. Se si vuole fare entrambe le analisi, rimuovere un lobo polmonare e procedere come descritto al punto 3. Trattare i lobi rimanenti collegati al cuore, come descritto al punto 2. </li></ol> 2. Visualizzazione di lacZ-etichetta cellule metastatiche del tumore in lobi polmonari Intere <ol><li> Posizionare il polmone in una tazza di plastica con coperchio di chiusura a tenuta e fissarla con 2% di formaldeide in PBS a temperatura ambiente per 30-60 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare accuratamente 3 volte con PBS. </li><li> Aggiungere almeno 10 ml preparata 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattoside (X-Gal) soluzione colorante (X-Gal soluzione stock [40 mg / ml inDimetilformammide] 01:40 diluito in soluzione di base di colorazione, pH 7.1 (Tabella 1), al riparo dalla luce). </li><li> Mettere un pezzo di garza in cima al polmone nuoto di mantenere completamente nella soluzione e posizionare il coperchio solo vagamente sulla pentola per consentire lo scambio di aria. </li><li> Incubare a 37 ° C per 3-5 ore al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere X-Gal soluzione, lavare una volta con PBS per rimuovere i residui di X-Gal soluzione (opzionale) e aggiungere 4% PFA. </li></ol> 3. Visualizzazione di lacZ-etichetta cellule metastatiche del tumore nel polmone criosezioni <ol><li> Prefill uno stampo incorporamento etichettati per 1/3 con media non diluito inclusione PolyFreeze. Mettere il lobo polmonare in alto e riempire con l&#39;incorporamento medio fino a che il lobo è completamente coperto. Cercate di evitare le bolle. </li><li> Incubare i polmoni incorporati a 4 ° C per 20 min. </li><li> Poi congelare i polmoni incorporati lentamente in una miscela di ghiaccio secco e isopentano e conservare a -80 ° C. </li><li> Tagliare 7-10 micron criosezioni su un criostato e montarle su vetrini da microscopio SuperFrostPlus. </li><li> Incubare le sezioni immediatamente con X-Gal soluzione di colorazione a 37 ° C per 24 ore in una camera umidificata. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBS 2 volte per 5 min e poi brevemente in acqua distillata. </li><li> Counter-macchia con rosso nucleare veloce per 10-30 sec, sciacquare in acqua distillata e montare i vetrini con Immu-Mount. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Asai et al. Riportato nell&#39;articolo originale sul Dunn-derivato topo modello LM8 OS che i tumori sc primarie derivate dalle cellule parentali Dunn, diversi da quelli derivati ​​dal altamente metastatico LM8 linea cellulare sub, non formano spontaneamente metastasi polmonari rilevabili in singenici topi C3H 14. Con le tecniche qui riportate, abbiamo inchiesta la formazione di metastasi in modelli murini Dunn/LM8 OS. Abbiamo approfittato di stabile lacZ-trasdotte Dunn e LM8 cellulares e di un protocollo di in-situ perfusione polmonare e fissaggio in topi. Immagini rappresentative di polmoni perfusi e non perfuso di topi iniettati sottocute con lacZ-trasdotte e non trasdotte controllo Dunn e LM8 cellule sono mostrati in Figura 1. Nei topi iniettati con cellule di controllo Dunn, metastasi macroscopiche e microscopiche rimasta non rilevabile nei polmoni non perfusi e perfuso (Figura 1A, I-IV). Ma, interessante, in topi iniettati con cellule Dunn-lacZ, X-gal colorazione blu rivelato micrometastatica foci di cellule singole o piccoli ammassi cellulari (&lt;0,1 mm) sulla superficie del non-perfusi polmoni (Figura 1A, vi). In- perfusione situ e la fissazione dei polmoni ulteriormente migliorato la rilevabilità di Dunn-lacZ micrometastasi (Figura 1A, viii). Tuttavia, per conseguenza macroscopica foci non è stato osservato (Figura 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; Nei topi iniettati con cellule di controllo LM8, traslucidi, appena rilevabile macrometastatic focolai più grandi di 0,1 mm di diametro sono stati rilevati a non perfusi polmoni (Figura 1B, i). Perfusione del polmone (Figura 1B, iii) non ha migliorato la rilevazione dei fuochi. Tuttavia, in topi iniettati con LM8-lacZ celle multiple X-Gal macchiato macro-blu (Figura 1B, v) e micrometastasi (Figura 1B, vi) sono stati rilevati sulla superficie del non-perfusi organi. Inoltre, la perfusione dei polmoni ulteriormente migliorato l&#39;individuazione delle macro e micrometastasi (Figura 1B, vii - viii). Di conseguenza, micro e macrometastasi divenne visibile una densità maggiore e un numero maggiore, principalmente a causa della traslucenza del tessuto perfuso in cui foci sotto la superficie dell&#39;organo divenne anche visibile. Un ulteriore hanalisi utilizzando criosezioni istologico di tessuto polmonare confermato la rilevabilità miglioramento delle metastasi polmonari nei topi iniettati con lacZ-trasdotte Dunn e LM8 cellule. Nei topi con tumori primari derivati ​​da Dunn-lacZ o LM8-lacZ cellule, a differenza di topi con tumori primari delle cellule di controllo, rispettivi micrometastasi o addirittura singola cella foci erano riconosciuti in sezioni polmonari (Figura 2). Inoltre, macrometastasi erano anche più chiaramente visibile in topi iniettati con LM8-lacZ cellule che negli animali iniettati con il controllo LM8 cellule (Figura 2C, D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figura 1. Rilevamento di metastasi spontanee di non trasdotte (I-IV) e lacZ-trasdotte (v-viii) Dunn (A) e LM8 (B) in cellule non-perfuso (I, II, V, VI) e perfuso (III, IV, VII, VIII) polmoni nei topi C3H. Metastasi a rappresentante X-Gal-staINED polmoni interi (V, VII in A e B) e rispettivi primi piani (VI, VIII in A e B) appaiono blu. Macrometastatic foci (&gt; 0,1 mm) negli organi dei topi iniettati con i tag LM8 cellule (i-iv in B) sono indicati da un asterisco. Le aree indicate nei primi piani sono rappresentativi per i polmoni interi. Barre di scala indicano 1 mm di immagini di polmoni interi e 0,1 mm di primi piani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figura 2. Rilevamento di Dunn e LM8 micrometastasi in criosezioni polmonari. Sezioni di tessuto polmonare ottobre incorporato state incubate in X-Gal soluzione di colorazione a 37 ° C per 24 ore in una camera umidificata e poi colorate con rosso nucleare fast. Frecce indicano micrometastatica foci riconosciuto in sezioni polmonari di topi iniettati con Dunn-lacZ (B) o LM8-lacZ cellule (D). Micrometastases rimasta non rilevabile in sezioni polmonari di topi iniettati con non trasdotte Dunn (A) o LM8 cellule (C). Barre di scala indicano 0,1 mm.

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<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I risultati qui presentati nel modello di topo Dunn/LM8 OS dimostrare la potenza del metodo appena stabilito che combina l&#39;X-Gal colorazione lacZ-etichetta cellule tumorali con l&#39;in-situ perfusione / fissaggio del tessuto polmonare. Questa combinazione delle due tecniche permette la rilevazione elevata sensibilità di lesioni micrometastatica fino a livello di singola cellula e migliora anche la visualizzazione macrometastasi sulla superficie polmonare (Figura 1) e in sezioni polmonari (Figura 2). Mentre l&#39;X-Gal colorazione permette inoltre la rilevazione di (micro) metastasi in altri organi, in-situ perfusione / fissazione migliora la rilevabilità di foci metastatici in tessuti diversi dal polmone solo leggermente a causa del colore naturale sangue e tessuti correlati di questi organi 13. Anche se la perfusione è diretta ad un altro organo, ad esempio il fegato, la rimozione del sangue potrebbe migliorare solo parzialmente dal contrastoween X-Gal colorazione e il colore naturale dell&#39;organo. Tuttavia, il metodo è applicabile a qualsiasi tipo di etichetta lacZ-cellule tumorali, migliorare notevolmente la rilevabilità di metastasi polmonari fino al livello di dormienti monocellulari micrometastasi e consente una quantificazione semplice e affidabile di macro e micrometastasi. Un limite di questo metodo e tutte le altre tecniche che si basano su geni reporter luciferasi, comprese le proteine ​​fluorescenti, e la stabilità del transgene. Come mostrato in figura 2d, non tutte le cellule tumorali all&#39;interno foci macrometastatic sono di colore blu, che indica una mancanza di beta-galattosidasi. Questo potrebbe essere correlato a necrosi, ma è più probabilmente dovuta ad una perdita di espressione del transgene. Abbiamo osservato che il Dunn e LM8 cellule sono molto efficaci nel down-regulation di lacZ e transgeni altri anche in continua selezione per l&#39;espressione. Abbiamo quindi commutata in studi recenti per l&#39;murine K12e K7M2 e gli umani HOS, 143B e SaOS-2 linee cellulari di osteosarcoma, tutte mantenute stabili lacZ espressione in vitro e in vivo fino al 100% nel tempo. Una volta stabile lacZ-espressione è garantita, questa tecnica può essere applicata in studi con gene-manipolati cellule tumorali, per esempio per investigare meccanicamente il processo di colonizzazione tessuto 13 e per lo sviluppo e la sperimentazione di nuove terapie obiettivo di eradicazione delle lesioni metastatiche 15 , 16. Inoltre, può servire come punto di riferimento per il miglioramento delle attuali tecniche di imaging radiologici, come la PET, (micro) TC e RM, utilizzati per la diagnosi precoce delle lesioni metastatiche. In uno studio PET recente (inedito) con traccianti diversi abbiamo verificato in vivo polmone rilevato metastasi ex vivo successivamente con il protocollo descritto. In uno studio in corso con un nuovo animale piccolo micro-CT (SkyScan) siamo così lontani abper rilevare le metastasi polmonari in vivo fino ad una dimensione di 0,5 mm ed ex vivo fino a 0,3 mm, ma relative ad una risoluzione di 0,1 mm. Curiosamente, questo è il limite che abbiamo impostato per distinguere macro-di micrometastasi con il metodo combinato di perfusione in situ e X-Gal colorazione. Questo sottolinea ancora una volta la sensibilità e l&#39;utilità di questa tecnica semplice e conveniente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamina) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml soluzione </td></tr><tr><td> Xylazin (xilazina) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml soluzione </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazina) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml soluzione </td></tr><tr><td> Bulldog Tipo Serrefine pinza vascolare </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 18051-35 </td><td> curvo, mm 35 </td></tr><tr><td> Tazza di plastica con coperchio </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 tazze ml con coperchio </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattoside (X-Gal); polvere </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> sciogliere in N, N-di-metilformammide a 40 mg / ml, negozio protetto dalla luce a -20 ° C </td></tr><tr><td> Colorazione soluzione basica, equilibrata a pH 7,1, memorizzato protetto dalla luce a 4 ° C per max. 1 mese </td><td> fatto da sé </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% di sodio desossicolato- </td></tr><tr><td> PolyFreeze Embedding Media </td><td> Polysciences; Distributore svizzero: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Incorporamento stampo </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 criostato </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost diapositive </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nucleare-Fast Red - soluzione di solfato di alluminio </td><td> Divisione Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, distributore svizzero: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e materiale.

una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in mouse di combinata<em&gt; in-situ</emperfusione&gt; del tessuto polmonare e x-gal colorazione del<em&gt; lacz</em&gt;-tagged cellule tumorali

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasi è la principale causa di morte nella maggior parte dei tipi di cancro e di conseguenza un obiettivo principale nella ricerca sul cancro. Tuttavia, il rilevamento di micrometastasi di immagini radiologica e il successo nella loro eradicazione terapeutico rimangono limitate. Mentre modelli animali hanno dimostrato di essere strumenti preziosi per la ricerca sul cancro 1, il controllo / visualizzazione di micrometastasi rimane una sfida e una valutazione imprecisa di diffusione metastatica in studi preclinici porta potenzialmente a risultati deludenti negli studi clinici 2. Di conseguenza, vi è un grande interesse per affinare i metodi per consentire finalmente rilevamento riproducibile e affidabile di metastasi al livello di singola cellula nel tessuto normale. L&#39;obiettivo principale è quindi sulle tecniche, che consentono l&#39;individuazione delle cellule tumorali in vivo, come la micro-tomografia computerizzata (micro-CT), la tomografia ad emissione di positroni (PET), bioluminescenza o imaging di fluorescenza &lt;sup&gt; 3,4. Attualmente stiamo ottimizzando queste tecniche per il monitoraggio in vivo della crescita tumorale primario e metastasi in modelli diversi osteosarcoma. Alcune di queste tecniche può essere utilizzato anche per l&#39;analisi ex vivo di metastasi accanto metodi classici come qPCR 5, 6 o FACS diversi tipi di colorazione istologica. Come valore di riferimento, abbiamo stabilito nel presente studio la trasfezione stabile o trasduzione di cellule tumorali con il gene lacZ codifica l&#39;enzima batterico β-galattosidasi che metabolizza il substrato cromogeno 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galattopiranoside (X-Gal) in un colorante blu insolubile indaco 7 e permette altamente sensibile e selettivo colorazione istochimica blu di cellule tumorali in vivo ex tessuti mouse per livello di singola cellula, come qui mostrato. Questo è uno strumento a basso costo e non attrezzature ad alta intensità, che consente la validazione precisa di metastasi 8 in studi di valutazione di un nuovoterapie ticancer 9-11. Un fattore limitante di X-gal colorazione è il basso contrasto, ad esempio, consanguinei colorazione rosso di ben tessuti vascolarizzati. In tessuto polmonare questo problema può essere risolto in situ perfusione polmonare, una tecnica che è stata recentemente istituita dal Borsig et al. Perfusi 12 anni che i polmoni di topi in anestesia per eliminarli dal sangue e per fissare e incorporarli in situ sotto inflazione attraverso la trachea. Questo metodo impedisce anche il collasso del polmone e mantiene quindi la morfologia funzionale alveoli polmonari, che migliora la qualità del tessuto per l&#39;analisi istologica. Nel presente studio, si descrive un nuovo protocollo, che sfrutta una combinazione di X-gal colorazione lacZ cellule tumorali che esprimono e in-situ perfusione e fissazione del tessuto polmonare. Questo protocollo permette raffinato alta sensibilità di rilevazione di singole cellule metastatiche nel polmone e permesso in un recente studio di detect &quot;dormienti&quot; micrometastasi polmonari in un modello murino 13, che è stato originariamente descritto di essere non-metastatico 14.

Il nuovo protocollo riportato nel presente studio permette la rilevazione selettiva delle metastasi polmonari con una risoluzione singola cellula nei topi combinata<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusione polmonare e la fissazione e colorazione X-Gal di<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali.

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

La metastasi rappresenta la causa principale di morte nella maggior parte dei tipi di cancro e, conseguentemente, un obiettivo centrale nella ricerca oncologica. Tuttavia, la rilevazione di...

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare il rilevamento di micro metastasi nel polmone del mouse ex vivo, preservando al contempo l'architettura dei polmoni in stato gonfiato. Questo risultato si ottiene innanzitutto perfondendo il polmone in situ con PBS per rimuovere il sangue, che rappresenta la principale fonte di fondo cromatico in tale tessuto. I passaggi successivi consistono nell'insufflare il polmone mediante iniezione di PFA, quindi pinzare per fissare il tessuto polmonare in condizione di gonfiamento.Successivamente, il polmone viene rimosso e ulteriormente fissato in PFA oppure singoli lobi polmonari vengono inclusi per la criosezionatura. I passaggi finali consistono nella colorazione dei tessuti con soluzione Xal e nella visualizzazione delle cellule tumorali LA zag; in definitiva, le metastasi possono essere rilevate a livello di singola cellula su lobi polmonari interi o su sezioni di tessuto polmonari mediante microscopio binoculare o microscopio ottico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo sky standing on its own, è che la rilevabilità delle micrometastasi migliora notevolmente grazie all'eliminazione dello sfondo legato al sangue.Iniziare il protocollo anestetizzando un topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina, xilazina e acepromazina in circa 150 microlitri di PBS. Quando i riflessi al dolore del topo non sono più osservabili, fissarlo sul tavolo operatorio. Rasare e passare l'alcol al 70% sul pelo.Aprire la pelle dall'addome fino al collo. Tirare la pelle ai lati o rimuoverla. Aprire con attenzione il peritoneo nel torace per evitare la rottura di vasi sanguigni importanti come le vene giugulari.Questo migliorerà l'efficienza della perfusione. Ora recidere la vena cava cardiaca al di sotto del fegato utilizzando una siringa da 20 millilitri con un ago da 21 a 24 gauge. Iniettare lentamente da 10 a 15 millilitri di PBS nel ventricolo destro del cuore in battito finché il polmone non diventa completamente bianco e il cuore non cessa di battere.Poi occludere con un clamp vascolare i vasi sanguigni sopra il fegato e il diaframma. Caricare una siringa da 10 millilitri con paraformaldeide al 3% e, utilizzando un ago da 21 a 24 gauge, iniettare nel ventricolo destro. Circa due millilitri.Scoprire la trachea al di fuori della cavità toracica e insufflare i polmoni mediante un'iniezione di circa tre millilitri di aldeide nella trachea dall'esterno della cavità toracica. Subito dopo aver rimosso l'ago, occludere la trachea in corrispondenza del punto di puntura con una pinza vascolare e attendere 10 minuti per consentire la fissazione. Successivamente, sezionare i vasi sanguigni al di sopra della pinza vascolare.Quindi rimuovere la pinza ed iniettare circa due millilitri di PBS nel ventricolo destro per eliminare l'eccesso di formaldeide. Pungere le parti inferiori di tutti i lobi polmonari con un ago ed eliminare la pinza vascolare dalla trachea. Iniettare ora tre-cinque millilitri di soluzione di inclusione diluita nella trachea, procedendo in modo analogo all'altra iniezione.Interrompere l'iniezione quando il paraform che si trova nei lobi polmonari viene sostituito dalla soluzione. Rimuovere con attenzione il polmone tirando il cuore con una pinza e sezionando i legamenti di tessuto connettivo, i vasi sanguigni e la trachea. Assicurarsi che il cuore rimanga collegato ai polmoni.Mettere da parte un lobo per sezioni crio e utilizzare il tessuto polmonare rimanente per la colorazione dell'intero polmone. Posizionare il polmone in un bicchiere di plastica con coperchio ermetico e fissarlo con formaldeide al 2% in soluzione salina fosfato (PBS). Apporre un pezzo di garza sulla sommità del polmone per mantenerlo immerso nella soluzione e lasciarlo a temperatura ambiente per 30 minuti.Dopo mezz'ora, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare accuratamente il tessuto con PBS per 3 volte. Preparare fresca la soluzione xal pronta all'uso diluendo un millilitro di soluzione madre xal, uno a 40, nella soluzione di colorazione di base e aggiungere almeno 10 millilitri della soluzione nel contenitore. Immergere il polmone con un pezzo di garza. Fissare il coperchio in modo lento per consentire lo scambio d'aria e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque ore al riparo dalla luce.Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di xal. Lavare i polmoni una volta con PBS per rimuovere la soluzione residua di xal e aggiungere almeno 10 millilitri di paraformaldeide al 4% in PBS. Il tessuto è ora pronto per l'istologia e può essere conservato a lungo nel PFA al 4% a quattro gradi Celsius.Iniziare riempiendo un terzo di uno stampo per inclusione con mezzo di inclusione poly forze non diluito. Quindi inserire il lobo polmonare nello stampo e continuare ad aggiungere mezzo fino a quando il lobo non è completamente ricoperto. Evitare con cura la formazione di bolle d'aria, quindi incubare il lobo incluso a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Successivamente, preparare i polmoni inclusi per il taglio congelandoli lentamente in una miscela di anidride carbonica solida e isopentano. Se necessario, possono ora essere trasferiti in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione. Tagliare al criostato sezioni criogeniche di sette-dieci micron del lobo e montare le sezioni su vetrini criogenici pronti all'uso disponibili in commercio. Una volta montate, incubare immediatamente le sezioni nella soluzione di colorazione Xal a 37 gradi Celsius per 24 ore in una camera umidificata. Il giorno successivo, risciacquare i vetrini due volte in PBS, per cinque minuti ciascun risciacquo.Proseguire con un breve risciacquo in acqua distillata. Colorare ora le preparazioni con rosso nucleare rapido per 10 secondi per ottenere una controcolorazione debole che rende lo xal più dominante, quindi risciacquare immediatamente la controcolorazione con acqua distillata. Per una controcolorazione più intensa, prolungare il tempo fino a 30 secondi o più.Montare i vetrini con immuno mount. La formazione di metastasi nei modelli murini di OS LM otto è stata riesaminata. Utilizzando le immagini rappresentative qui descritte di polmoni perfusi e non perfusi di topi inoculati contemporaneamente con cellule LM otto trasdotte con laxy e non trasdotte, controllate e LM otto, in topi inoculati con cellule controllate e LM otto.Metastasi macroscopiche e microscopiche sono rimaste indetectabili nei polmoni non perfusi e nei polmoni perfusi. Ma in modo interessante, nei topi inoculati con cellule Dun LA Z, la colorazione XGAL ha rivelato foci micrometastatici blu costituiti da singole cellule o piccoli aggregati cellulari sulla superficie dei polmoni non perfusi. La perfusione e fissazione in situ dei polmoni migliora ulteriormente la rilevabilità delle micrometastasi Dun LA Z. Tuttavia, non è stata osservata una crescita fino a foci macroscopici nei topi inoculati con cellule di controllo LM otto. Foci macro-metastatici traslucidi, appena rilevabili, di diametro superiore a 0,1 millimetro, sono stati identificati nei polmoni non perfusi. La perfusione polmonare non ha migliorato il riconoscimento di tali foci.Tuttavia, nei topi iniettati con cellule LAC Z ate, sono state rilevate multiple metastasi macroscopiche blu alla colorazione con X-gal sulla superficie degli organi non perfusi. Sono state inoltre rilevate metastasi microscopiche sulla superficie degli organi non perfusi. Inoltre, la perfusione dei polmoni ha ulteriormente migliorato la rilevabilità delle metastasi macroscopiche e microscopiche.Di conseguenza, micro e macro metastasi divennero visibili con una densità maggiore e in numero più elevato, principalmente a causa della traslucenza del tessuto perfuso, nella quale furono osservati anche foci al di sotto della superficie dell'organo. Un'analisi istologica aggiuntiva mediante sezioni criogeniche di tessuto polmonare confermò il miglioramento nella rilevabilità delle metastasi polmonari nei topi inoculati con cellule LAX Z transdotte e cellule LM otto nei topi con tumori primari derivati dalle cellule Dun LAX Z. Nelle sezioni polmonari furono riconosciute micro metastasi o addirittura foci costituiti da singole cellule.Questo non è stato osservato nei topi con tumori primari derivati dalle rispettive cellule di controllo. Inoltre, le macro metastasi erano anche più chiaramente visibili nei topi inoculati con cellule LM otto LA C rispetto agli animali con cellule di controllo LM otto. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la perfusione e la fissazione polmonare in ZI due e la successiva colorazione immunoistochimica delle metastasi nei polmoni asportati.Questa tecnica rappresenta un metodo altamente sensibile per valutare la distribuzione delle metastasi nel polmone in qualsiasi tipo di studio sul cancro e può inoltre fungere da parametro di riferimento per il miglioramento delle attuali tecniche di imaging in vivo, come la micro-TC, la PET e la risonanza magnetica, utilizzate per la rilevazione precoce delle lesioni metastatiche.

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Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata In-situ del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del LacZ-Tagged cellule tumorali (Video) | JoVE Journal

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata

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