Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare con successo l'unità di filtrazione del nefrone e quantificare la filtrazione delle macromolecole fluorescenti attraverso la barriera di filtrazione nello spazio urinario in vivo. Ciò si ottiene preparando prima lo stadio del microscopio per l'animale vivo. Successivamente, il rene viene esposto e il ratto viene posizionato sul palco.

Quindi i singoli glomeruli vengono identificati e mappati e vengono acquisite immagini 3D di sfondo. Infine, viene infusa l'albumina fluorescente. Vengono acquisiti volumi 3D di singoli glomeruli e viene quantificata la permeabilità.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il coefficiente di filtrazione delle macromolecole attraverso i glomeruli nel rene attraverso l'uso della microscopia intrafiale a due fotoni. Il vantaggio principale della microscopia a due fotoni è che consente la quantificazione simultanea sia della filtrazione glomerulare che del riassorbimento tubulare prossimale e della transcitosi nell'animale. Allo stesso tempo, le implicazioni della tecnica si estendono oltre la meccanicistica nella diagnostica e nella terapia come l'importanza di comprendere sia il ruolo della filtrazione glomerulare che del tubo prossimale.

Il riassorbimento dell'albumina è fondamentale per determinare il targeting della terapia. Dopo aver anestetizzato il ratto, inserire una linea di accesso venoso a permanenza attraverso la vena giugulare o femorale e radere il fianco sinistro da appena sotto la gabbia toracica a appena sopra la coscia sinistra. Questo è un intervento chirurgico non di sopravvivenza.

Posiziona il topo piatto sul lato destro in modo che il lato sinistro rasato sia rivolto verso l'alto. Assicurati che sia piatto sulla panca con la sua postura allungata e non accovacciato con le zampe anteriori che si toccano e le zampe posteriori che si toccano molto delicatamente. Palpare per sentire il rene per determinare dove si trova naturalmente all'interno del retroperitoneo e usare un pennarello per tracciare una linea retta parallela al corpo con un paio di pinze dentali.

Raccogli la pelle e usa un paio di emostatici per pizzicare la pelle lungo la linea tracciata per schiacciare il tessuto e prevenire il sanguinamento usando un paio di forbici chirurgiche. Tagliare lungo l'incisione. Utilizzare la stessa procedura per tagliare lo strato muscolare esterno, che è sottile secondo necessità.

Utilizzare gli emostatici per prevenire il sanguinamento per l'incisione nello strato muscolare interno, che esporrà il peritoneo. Ripalpare il rene per stimarne le dimensioni. Pizzica una linea di incisione più piccola del rene assicurandoti che l'incisione sia appena sopra il rene.

È meglio fare questa incisione troppo piccola e ingrandirla se necessario. Individua il rene e usa una pinza per afferrare il grasso circostante lavorando verso il polo inferiore del rene mano su mano. Una volta raggiunto il polo inferiore del rene, tirare delicatamente il rene attraverso l'incisione mentre si stringe molto delicatamente sotto il rene per esternarlo.

Se l'incisione è troppo piccola, schiacciare lo strato muscolare e tagliare per allargarlo. Ripetere la procedura per esteriorizzare il rene dopo aver esteriorizzato il rene del ratto e aver posizionato il ratto sul tavolino del microscopio per l'imaging. Se il tuo microscopio è dotato di un tavolino motorizzato in grado di marcare le posizioni, utilizzando un'asta di fluoresceina a doppio passaggio, un filtro domino e un obiettivo a bassa potenza, trova e centra i singoli glomeruli, che appariranno come strutture circolari vuote circondate da tubuli prossimali.

Avere un'autofluorescenza giallo-arancione intrinseca che contrassegna ogni posizione, cambia la torretta con un obiettivo a immersione in acqua di potenza superiore e prendi set di dati 3D di ciascun glomeruli. Assicurarsi che gli anelli capillari e lo spazio Bowman siano chiaramente visibili. L'uso di una pseudo tavolozza di colori aiuterà a visualizzare queste strutture.

Successivamente, concentrandosi su un vaso sanguigno superficiale infondere lentamente albumina fluorescente, assicurandosi che venga dato il tempo per consentire la distribuzione sistemica per le molecole con un basso coefficiente di cingo glomerulare o GSC, è essenziale massimizzare i valori di intensità nel plasma, ma non raggiungere livelli che satureranno i fotorivelatori al microscopio. Ciò aumenta la rilevabilità delle molecole filtrate Dopo aver atteso circa 10 minuti per consentire la schiaritura di eventuali frammenti di piccolo peso molecolare, acquisire volumi 3D a intervalli di un micron da utilizzare nel calcolo dell'albumina utilizzando il software di elaborazione delle immagini metamorph. Caricare i set di dati 3D insieme alle immagini di sfondo per ciascun glomeruli nel volume contenente l'albumina fluorescente.

Individua un anello capillare superficiale con abbastanza spazio vuoto tra i suoi margini definiti e il bordo della capsula di Bowman. In background, volume. Individua lo stesso piano focale, che dovrebbe contenere tutti i segnali visivi dell'immagine contenente l'albumina.

Selezionare una regione all'interno dell'ansa capillare di interesse e annotare la lettura dell'intensità media. Quindi, seleziona una regione all'interno dello spazio Bowman e annota la lettura dell'intensità media. Questi saranno utilizzati come valori di fondo per la quantificazione.

Seleziona la regione simile all'interno dello spazio Bowman nell'albumina contenente l'immagine. Fallo per almeno altre due regioni per acquisire un valore per l'intensità media all'interno dello spazio di Bowman. Seleziona l'ansa capillare con l'intensità del plasma più luminosa e disegna una regione attorno ad essa.

Successivamente, utilizzando la funzione di soglia, evidenziare i valori luminosi all'interno del plasma circolante, evitando le striature scure che stanno circolando nei globuli rossi. Notare i valori medi di intensità dello spazio plasma selezionato. È importante selezionare preferenzialmente le aree luminose del plasma perché i fattori all'interno del sangue serviranno solo a causare una sottostima dei livelli di fluorescenza plasmatica.

Inserisci i valori in un foglio di calcolo Excel per calcolare il GSC, dove GSC è uguale alla differenza dello spazio grezzo del prodiere. Intensità meno sfondo Intensità dello spazio di Bowman divisa per la differenza tra l'intensità dell'ansa capillare grezza meno l'intensità dell'ansa capillare di fondo. L'assorbimento dell'albumina fluorescente filtrata avviene prevalentemente nel segmento iniziale dei tubuli prossimali.

Quello S, questo pannello mostra una sezione trasversale di un glomerulo e un segmento S uno prelevato da un ratto suggeritore Wistar di Monaco, circa 20 minuti dopo l'infusione di un bolo RSA rosso Texas iniziale. L'apertura dello spazio di Bowman e l'avido assorbimento dell'albumina in rosso sono mostrati nel segmento S one. Questo pannello mostra una proiezione 3D superficiale di 20 micron dello stesso set di dati e qui è mostrata una proiezione a potenza inferiore presa circa 60 minuti dopo l'infusione.

Queste immagini dimostrano che la microscopia intravitale può consentire la visualizzazione del destino del materiale infuso dopo la filtrazione, corroborando in una certa misura, il coefficiente di filtrazione osservato qui mostrato sono immagini prese dal glomerulo superficiale. Questo pannello è un'immagine di sfondo e questa immagine è stata scattata circa 12 minuti dopo l'infusione di albumina sierica di ratto rosso del Texas. Questi due pannelli sono disegnati in pseudo colore.

Tre piccole regioni di interesse disegnate nello spazio di Bowman sono utilizzate per calcolare l'intensità media dell'albumina fluorescente che si è spostata attraverso la barriera di filtrazione. I valori medi di intensità per le singole regioni sono stati riportati nell'area evidenziata all'interno della finestra di dialogo Mostra statistiche regione. Il valore GSC per l'albumina di 0,0111 derivato per questo glomerulo individuale rientra nella scena dell'intervallo in questo ceppo di ratti stellati di Monaco quando sono in condizione di alimentazione.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'analisi quantitativa e qualitativa possono essere eseguiti su altre strutture renali per rispondere a ulteriori domande come l'eventuale traffico della macromolecola dopo la filtrazione nello spazio urinario dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori in fisiologia renale di esplorare i processi fisiologici e fisiopatologici dinamici, non solo una volta ma longitudinalmente. Col tempo, lo è stato.