Analisi popolazione cellulare Durante carcinogenesi della pelle

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire analisi della popolazione cellulare nel modello murino di carcinoma basocellulare della pelle. Ciò si ottiene inducendo prima l'espressione genica bersaglio nei topi. Nella seconda fase, l'epidermide viene isolata dalla pelle del topo.

Dopo aver generato una sospensione di una singola cellula, le cellule epidermiche vengono marcate con specifici marcatori di servizio cellulare. In definitiva, i cambiamenti della popolazione cellulare durante lo sviluppo del tumore nella pelle possono essere monitorati mediante analisi citofluorimetrica. Lo sviluppo del cancro è un processo che coinvolge molti tipi di cellule.

Lo scopo di questa procedura è aiutare i ricercatori a studiare come le diverse cellule contribuiscono allo sviluppo del cancro della pelle. Questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni cellulari durante lo sviluppo del cancro della pelle, ma può anche essere applicato ad altri sistemi come il cancro al pancreas. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto è difficile determinare quando l'esperimento deve essere terminato senza una valutazione visiva.

Per iniziare, i topi ER di cheratina 14 Cree indicati come topi K 14 con i topi Rosa 26 contenenti il gene levigato mutante YFP marcato SMU M due indicato come SMU. Topi. Successivamente, immergere campioni di coda lunghi 0,5 centimetri raccolti da topi doppi positivi di età compresa tra tre e sei settimane in una soluzione di lisi della coda PCR diretta con un milligrammo per millilitro di proteinasi K.Quindi incubare i campioni durante la notte a 55 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, centrifugare il tessuto alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere i detriti.

Quindi, per genotipizzare ogni animale, utilizzare un microlitro di SNAT da ciascun campione in singole reazioni PCR con i primer e le condizioni raccomandate dal fornitore. Utilizzare un ago da alimentazione curvo calibro 20 per somministrare tamoxifene agli animali. Doppio positivo per K 14 C er e ROSA 26 mediante sonda orale per cinque giorni consecutivi per indurre l'espressione di OO M 2 nei cheratinociti.

In generale, i fenotipi sono più gravi sull'orecchio e sulla coda dei topi K 14 OO marcati con GFP per raccogliere la pelle per l'analisi cellulare. Per prima cosa, usa un tremore per rimuovere il pelo dall'animale soppresso. Quindi rimuovere la pelle del topo e immergere il tessuto in una soluzione di disbe a 37 gradi Celsius per una o due ore.

Dopo il trattamento con dispa, utilizzare un paio di pinze per separare l'epidermide dal derma. Ora usa un paio di forbici per tritare l'epidermide. Quindi immergere il tessuto in una soluzione di collagenasi quattro per una o due ore a 37 gradi Celsius in un tubo da 50 millilitri.

Agitare delicatamente il tubo ogni 20 minuti per dissociare le cellule. Utilizzare un microscopio per confermare la dissociazione cellulare quando è possibile rilevare singole cellule nel mezzo collagenasi. Incubare il campione per altri 30 minuti per aumentare la resa cellulare.

Quindi filtrare la miscela di tessuto attraverso un colino cellulare da 70 micron e lavare le cellule per 10 minuti a 500 volte G e temperatura ambiente per etichettare le cellule iniziando con il ressus, sospendendo il pellet appena lavato in PBS integrato con il 10% di FBS a 2,5 volte 10 delle sei cellule per millilitro. Quindi posizionare la soluzione cellulare sul ghiaccio per 30 minuti per bloccare qualsiasi legame non specifico. Successivamente, trasferire le aliquote delle cellule in microprovette da 1,5 millilitri per la marcatura specifica degli anticorpi.

Aggiunta degli anticorpi a ciascuna provetta a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Agitare delicatamente le provette per alcuni secondi per mescolare gli anticorpi con le cellule, quindi rimettere le provette sul ghiaccio per altri 30 minuti. Dopo aver lavato i tubi in un millilitro di PBS, risospendere i pellet in PBS e quindi aggiungere DPI ad una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.

Quando si analizzano i dati, selezionare prima le singole celle in base al grafico a dispersione diretta rispetto a quello laterale, escludendo le celle morte positive DABI. I topi non sviluppano carcinomi basocellulari tranne quando viene attivata la segnalazione del riccio, come si vede in queste immagini. L'espressione indotta dal tamoxifene dell'oncogeno YFP liscio levigato M due si traduce in un fenotipo cutaneo che è evidente anche a livello anatomico di crescita nei campioni colorati con h ed e della pelle di questi animali.

I tumori della pelle possono essere osservati nei topi K 14 SMU. Senza l'induzione di SMU M 2 YFP, la pelle dell'animale non mostrava una morfologia anormale di h ed e. La colorazione di questi grafici a punti mostra un'analisi rappresentativa delle cellule mieloidi in topi normali e portatori di tumore.

Le cellule CD 11 B positive GR one positive derivano da cellule mieloidi, alcune delle quali sono cellule soppressori di derivazione mieloide in topi normali e non smu M due indotti da YFP. La popolazione di cellule CD 11 B positive GR one positive è appena rilevabile, ma aumenta in risposta all'infiammazione o allo sviluppo del tumore. Nei topi K 14 SMU.

L'espressione indotta di smu, M, due YFP e cheratinociti nella pelle determina un aumento della popolazione cellulare CD 11 B positiva GR 1 positiva. Questa tecnica consentirà ai ricercatori nel campo della biologia della pelle di eseguire analisi molecolari del carcinoma a cellule B nei topi.