Name: Analisi popolazione cellulare Durante carcinogenesi della pelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Scopri l'analisi delle popolazioni cellulari nel carcinoma basocellulare cutaneo utilizzando un modello murino con citometria a flusso. Questo metodo permette di studiare le interazioni tra cellule tumorali e microambiente.

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Questo studio è stato sostenuto dal NCI (R01-R01-94160 e 155086), UI Simon Cancer Center e Centro di Wells per la Ricerca Pediatrica.

Questo studio è stato approvato dal Comitato IACUC presso l&#39;Indiana University School of Medicine. 1. Generare topi con genotipo corretto <ol><li> Stabilire un modello murino di BCC. Mate K14-CREER topi (Jackson laboratorio stock numero 005107) con R26-SmoM2 YFP topi (Jackson laboratorio stock numero 005.130) (18) per generare K14-CREER + e R26-SmoM2 YFP + topi. </li><li> Eseguire la genotipizzazione. Immergere i campioni coda (0,5 cm di lunghezza) in directPCR soluzione lisi coda con 1 mg / ml di proteinasi K a 55 ° C per una notte con agitazione. Il giorno successivo, rimuovere i residui di tessuto per centrifugazione a velocità massima in un micro-centrifuga (per mantenere il surnatante per la genotipizzazione). Usare 1 ml del supernatante per ciascuna reazione PCR con i primer e le condizioni raccomandate dal fornitore. Selezionare i topi con i genotipi giuste (all&#39;età di 3-6 settimane, buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg verrà applicata tramite SQ ogni 8-12 ore per 2-3 giorni dopo la coda snip) for il punto 2. </li></ol> 2. Indurre l&#39;espressione di SmoM2 nei cheratinociti della pelle Indurre SmoM2 espressione nei cheratinociti con somministrazione orale di tamoxifene (5 pg / kg di peso corporeo in 50 ml di olio vegetale in ciascuna alimentazione) per 5 giorni consecutivi mediante sonda gastrica con un ago di alimentazione (curva 20 gauge). 3. Preparazione di campioni della pelle In generale, i fenotipi sono più gravi sull&#39;orecchio e la coda in K14creER/R26SmoM2 GFP topi. Per preparare per le analisi delle cellule, abbiamo prima vendemmia della pelle del mouse dopo il sacrificio di animali con una procedura approvata istituzionale (CO 2 più dislocazione cervicale). 4. Isolando Epidermide <ol><li> Dopo i topi sacrificio con una procedura approvata (vedi punto 3), rimuovere pelliccia tramite trimmer. I campioni di pelle Immergere in soluzione dispasi (5 mg / ml in DMEM con 10% FBS) a 37 ° C per 1-2 ore (1 ora per i topi meno di 8 settimane e 2 hrper i topi vecchi di 8 settimane). </li><li> Dopo il trattamento dispasi, epidermide separata dal derma con il forcipe. </li></ol> 5. Generare cellule singole <ol><li> Per ottenere singola popolazione cellulare, tritare epidermide da forbici e poi immergere in soluzione IV collagenasi (1 mg / ml in DMEM con 10% FBS) per 1-2 ore a 37 ° C in un tubo da 50 ml. Provate a mescolare delicatamente i tubi ogni 20 min per aiutare dissociazione delle cellule. </li><li> Ispezionare dissociazione delle cellule al microscopio. Quando singole cellule possono essere rilevate nel medio collagenasi, incubare il campione per altri 30 min per aumentare la resa cella. In generale, l&#39;epidermide da un mouse può produrre fino a 10 7 cellule. </li><li> Filtrare la miscela tessuto attraverso colino cellula (diametro dei pori 70 micron), le cellule di spin giù a 1.500 giri tramite banco centrifugazione, e lavare una volta con PBS. </li></ol> 6. Cellule etichette ed eseguire analisi di flusso Citometria <ol><li> Risospendere le cellule in 10% FBSin PBS a 2,5 x 10 6 cellule / ml per bloccare il legame non specifico (in ghiaccio per 30 min) </li><li> Prelevare un&#39;aliquota di cellule a ciascuna di 1,5 ml per microtubi etichettatura anticorpo specifico. Aggiungere anticorpi differenti in ciascun tubo ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Mescolare gli anticorpi con le cellule attraverso un delicato vertice per alcuni secondi e lasciarli in ghiaccio per 30 minuti, quindi lavare con 1 ml di PBS. Per i campioni di BCC, abbiamo usato gli anticorpi per i seguenti marcatori: CD11b-PE più Gr1-APC (cellule mieloidi o cellule mieloidi soppressore-derivati); vimentina-FITC (fibroblasti) (vedi i reagenti per i dettagli). </li><li> Per la colorazione intracellulare, usiamo un kit e seguire il manuale del fornitore (vedi Reagenti per i dettagli). Usiamo cellule fresche per analizzare marcatori di superficie cellulare. Dopo superficie marcatore colorazione, lavare le cellule, e risospendere in PBS. DAPI aggiungere alla miscela cella ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. DAPI si macchia le cellule morte che saranno gated fuori da ulteriori analisi. </li><li> Analizzare i dati con specifisoftware c. Abbiamo prima selezionare singole cellule in base alla FSC e SSC trama, e utilizziamo DAPI popolazione negativo (cellule vive) per ulteriori analisi. </li></ol>

<ol><li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li>
<li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas%3A+attack+of+the+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li>
<li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li>
<li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+homolog+of+patched%2C+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li>
<li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li>
<li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2%3A+deletion+of+an+NH%282%29-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+the+PTCH%2C+SMOH%2C+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li>
<li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval%2C+but+questions+remain+for+wider+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li>
<li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li>
<li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li>
<li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li>
<li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li>
<li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li>
<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinoma+and+its+development%3A+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li>
<li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patched+1+conditional+null+allele+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li>
<li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li>
<li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li>
<li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li>
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<li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li>
<li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70(2010).</li>
<li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li>
<li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561(2011).</li>
<li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model%3A+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937(2011).</li>
<li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668(2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo descritto un metodo per l&#39;analisi di popolazione cellulare in BCC. Tessuti tumorali sono coerenti di molti tipi di cellule, e ciascun tipo cellulare si comporta diversamente in un determinato momento di carcinogenesi, che è molto difficile da recuperare anche nelle migliori condizioni in vitro. Usando questo protocollo, abbiamo dimostrato che lo sviluppo di carcinoma a cellule basali si accompagna l&#39;espansione delle cellule staminali epidermiche e reclutamento di cellule mieloidi. In confronto con le analisi immunoistochimica o immunofluorescenza, analisi di popolazione di cellule danno una valutazione più quantitativa delle variazioni di popolazione di cellule da anticorpi specifici per una varietà di tipi di cellule sono ora disponibili. Per questo protocollo, 10 settimane sono necessari per completare lo studio perché il cambiamento fenotipico da induzione genica richiede tempo. E &#39;quindi importante pianificare l&#39;esperimento prima del tempo. Per l&#39;isolamento delle cellule e di analisi, possono essere necessari due giorni interi. Poiché le cellule vive sono usati per analyses, è importante prenotare un FACSCalibur prima del tempo. Abbiamo anche elencato i problemi comuni quando si lavora con questo protocollo (vedi sotto). Nella nostra esperienza, di seguito sono i problemi più comuni che abbiamo incontrato: <ol><li> Scarsa separazione dell&#39;epidermide: questo può essere causato da un trattamento dispasi incompleto (prego aumentare il tempo di trattamento diapase) o di soluzione dispasi insufficiente (La pelle deve essere completamente immersa in soluzione dispasi). Usiamo almeno 5 ml di soluzione dispasi per un mouse. Il volume può variare in base alle dimensioni della pelle. </li><li> Bassa resa del numero di cellule: Può essere dovuto alla incompleta digestione con collagenasi IV. Per favore prima concentrazione collagenasi assegno o la data di scadenza. Questo può anche essere causato da insufficiente quantità di epidermide utilizzato. Inoltre, digestione enzimatica deve essere effettuata a 37 ° C con agitazione (si prega di regolare la temperatura prima di eseguire la digestione). </li><li> Grumi di cellule: Questo è molto comune per le cellule della pelle (cellule pipetteun paio di volte dopo aver attraversato il filtro (prima della centrifugazione), o l&#39;esistenza di Mg 2 + e Ca 2 + nella soluzione (si prega di utilizzare Mg 2 + e Ca 2 + libero PBS per il lavaggio delle cellule). </li><li> Troppe le cellule morte: questo potrebbe essere il risultato di tessuti degradati (si prega di utilizzare tessuti freschi), o over-digestione (evitare di incubazione con dispasi e collagenasi IV). </li></ol> Questo protocollo può essere combinato con trapianto di midollo osseo o trapianto di tessuto per esaminare l&#39;origine cella. Ad esempio, il trapianto di GFP che esprimono cellule del midollo osseo in topi letalmente irradiati ci permetterà di esaminare il contributo delle cellule del midollo osseo di fibroblasti associati al tumore e le cellule mieloidi. Allo stesso modo, i tumori della pelle possono essere trapiantate in un nuovo host mouse per esaminare le interazioni tumore-ospite. Oltre a esaminare i cambiamenti di popolazione di cellule durante la carcinogenesi, questo protocollo consentirà inoltre ai ricercatori di esaminareeffetti dei trattamenti farmacologici verso le cellule del tumore ambiente. Sebbene questo protocollo è progettato per utilizzare per analisi di popolazioni cellulari durante carcinogenesi della pelle, lievi modifiche possono essere fatte per altri tipi di cancro. In sintesi, le analisi di popolazione di cellule in modelli murini di cancro della pelle possono darci le modifiche dinamiche cellulari durante la carcinogenesi, portando ad una migliore comprensione della biologia cellulare nella trasformazione neoplastica e diversi eventi cellulari nel processo di trasformazione.

Come il tipo più comune di cancro umano, il carcinoma a cellule basali (BCC) colpisce circa 2 milioni di americani ogni anno 1. Accumulando evidenze indicano che l&#39;attivazione anormale del riccio (Hh) di segnalazione è la forza trainante alla base dello sviluppo BCC (Inviato a 2,3). Alterazioni di segnale hedgehog nel BCC comprendono mutazioni inattivanti PTCH1 4-6, mutazioni guadagno-di-funzione di SMO 7-9, e l&#39;espressione aberrante di Hh percorso fattori di trascrizione GLI1 10 e Gli2 11 o rare mutazioni inattivati ​​di Su regolatore negativo (FU ) 12. Attraverso tutti questi e altri studi, Federal Drug Administration (FDA) ha recentemente approvato l&#39;uso del segnale hedgehog inibitore Vismodegib per trattare metastatico e localmente avanzato BCC 13-15. Nonostante tutti questi risultati 16, noi ancora non comprendiamo i meccanismi molecolari e cellulari con la quale il segnale hedgehog drives carcinogenesis. Creazione di modelli animali con attivazione tessuto-specifica del segnale hedgehog è ancora importante per questi studi e per la nostra comprensione della resistenza ai farmaci. Nei topi, topi wild-type non sviluppano BCC, anche in presenza di forti dosi di agenti cancerogeni, radiazioni UV o ionizzanti. In contrasto, Ptch1 + / - topi sono suscettibili di sviluppo BCC 17,18. La penetranza di sviluppo BCC in Ptch1 + / - mice è di oltre il 50%, anche se PTCH1 18,19 + / - mice raramente sviluppano BCC full-grown se conservato in condizioni normali. Causa della letalità embrionale di Ptch1 - / -, tessuto-specifico knockout di PTCH1 è generalmente utilizzato per lo studio 20. Inoltre, l&#39;espressione condizionale pelle-specifica di oncogeno SmoM2 YFP (Krt14-CREER: R26-SmoM2 YFP o Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) porta alla formazione di molteplici BCC microscopici in età molto precoce, fornendo un semplice test genetico per segnalazione di Hh fannownstream di SMO 21. Ci sono tre grandi questioni della nostra conoscenza della biologia BCC. In primo luogo, l&#39;origine cellulare delle BCC non è del tutto chiaro. Mentre alcuni studi supportano l&#39;mosse del follicolo pilifero come sito cellula staminale 22-24, Youssef et al. 25 localizza il cellulare murina di origine dei tumori cutanei Hh-driven per essere nella regione nell&#39;epidermide inter-follicolare, non nel follicolo pilifero , utilizzando cellule specifiche Cre per attivare l&#39;espressione di un ROSA26-driven transgenico mutante SMO. In secondo luogo, interazioni cellulari durante lo sviluppo del BCC non sono ben compresi. E &#39;noto che i cheratinociti con segnale hedgehog attivi possono portare alla formazione di BCC, ma altri cambiamenti cellulari non sono ben compresi. Inoltre, il trattamento di Smo antagonisti nei topi può portare a farmacoresistenza 26-28. Urgono dunque nuovi obiettivi per BCC. La comprensione di questi tre problemi richiede l&#39;analisi dei cambiamenti cellulari in topi durante Carcinogenesis. Mentre diversi metodi sono stati pubblicati per la coltura dei cheratinociti, citometria a flusso e la pelle isolamento delle cellule staminali 29-31, al momento non ci sono procedure complete per l&#39;analisi di cellule in BCC del mouse. Grazie alla combinazione di metodi per modello murino di BCC, la separazione di epidermide, generazione di singole cellule da tessuti e analisi cellulari, forniremo ai lettori una serie di procedure per lo studio segnalazione cellulare, cellulari e interazioni molecolari durante lo sviluppo del BCC. Noi crediamo che questo protocollo permetterà ai lettori di vedere come ogni procedura è compiuta. Inoltre, abbiamo fornito alcuni dati per illustrare ciò che i risultati dovrebbero essere simile, e la risoluzione dei problemi per aiutare i lettori a superare le difficoltà durante l&#39;esecuzione di queste procedure.

<table><tbody><tr><td>reagente di lisi per PCR diretta (coda) </td><td>Viagen Biotech</td><td>102-T</td><td>store @ 4 gradi C</td></tr><tr><td>proteinasi K </td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td>negozio @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ApliTag 360 taq polimerasi </td><td>Applied biosystems</td><td>N8080155</td><td> negozio @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tamoxifen </td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td> negozio @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Ago di alimentazione (calibro 20) </td><td>Fisher scientific</td><td>01-290-9B</td><td></td></tr><tr><td>Dispase </td><td>Roche Diagnostic</td><td>04942078001</td><td>store @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Collagenase IV </td><td>Worthington</td><td>negozio LS004189</td><td>@ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Filtro cellulare </td><td>Fisher scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b-PE </td><td>eBioscience</td><td>12-0112-81</td><td>negozio @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Gr1-APC </td><td>eBioscience</td><td>17-5931-81</td><td>negozio @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-vimentina-FITC </td><td>eBioscience</td><td>11-9897-80</td><td>negozio @ 4 &deg; E</td></tr></tbody></table>

analisi popolazione cellulare durante carcinogenesi della pelle

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Lo sviluppo del cancro è un processo a più fasi che coinvolga molti tipi cellulari, comprese le cellule tumorali, cellule precursori immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali. Ogni tipo di cellule subisce segnalazione e funzionale cambiamenti durante la carcinogenesi. La sfida attuale per molti ricercatori del cancro è di sezionare questi cambiamenti in ciascun tipo cellulare durante il processo più fasi in vivo. Negli ultimi anni, gli autori hanno sviluppato una serie di procedure per isolare le diverse popolazioni di cellule durante lo sviluppo del cancro della pelle utilizzando K14creER/R26-SmoM2 topi YFP. La procedura è divisa in 6 parti: 1) la generazione di topi appropriati per lo studio (K14creER + e R26-SmoM2 YFP + topi in questo protocollo), 2) che induce SmoM2 espressione YFP in pelle di topo, 3) preparazione del mouse biopsie cutanee, 4) isolamento epidermide dalla pelle; 5) preparare le singole cellule di epidermide; 6) l&#39;etichettatura popolazioni di cellule singole per l&#39;analisi di citometria a flusso.Generazione di numero sufficiente di topi con genotipo destra è il passo limitante in questo protocollo, che può richiedere fino a due mesi. Il resto dei passaggi prendere un paio di ore ad alcuni giorni. All&#39;interno di questo protocollo, includiamo anche una sezione per la risoluzione dei problemi. Anche se ci concentriamo sul cancro della pelle, questo protocollo può essere modificato per fare domanda per altri modelli animali di malattie umane.

E &#39;noto che i topi non sviluppano carcinomi a cellule basali salvo Hh attivazione segnalazione. Figura 1 mostra il fenotipo pelle seguente espressione indotta di oncogeno spianato SmoM2 YFP. Figura 2 mostra l&#39;analisi di cellule mieloidi in topi normali e di tumore. CD11b + Gr1 + cellule derivano da cellule mieloidi, e alcuni di loro sono cellule derivate mieloidi soppressore. In situazione normale, il CD11b + + Gr1 popolazione cellulare è difficilmente rilevabile, ma aumenta in risposta ad infiammazione o sviluppo del tumore. Abbiamo mostrato che l&#39;espressione indotta di SmoM2YFP nei risultati cutanee in un aumento CD11b + Gr1 + cellule. Attualmente, i meccanismi molecolari alla base di questo cambiamento nella BCC non sono chiare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Figura 1. Morphologicacambia l dopo induzione SmoM2YFP in pelle di topo. alto mostra un diagramma di genotipi del mouse. Il pannello centrale: la K14creER + e R26-SmoM2 YFP + topo trattato con tamoxifene mostrato grossolanamente anomalia nella pelle (a destra), tumori cutanei nella sezione H &amp; E (a sinistra). Il pannello inferiore: il mouse senza SmoM2YFP induzione mostrava normale in cerca della pelle (a destra) e non morfologia anormale nella sezione H &amp; E (a sinistra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi del flusso di CD11b + Gr1 + cellule. Per esaminare il cambiamento di CD11b + Gr1 + cellule durante lo sviluppo del cancro della pelle, abbiamo isolato cellule singole e colorate con anticorpi marcati con fluorescenza a CD11b e Gr1. Dopo l&#39;analisi con FlowJo, abbiamo notato un aumento di questa popolazione di cellule nei tessuti cutanei da topi trattati con tamoxifene.

Carcinogenesi è un processo che coinvolge le interazioni tra cellule tumorali e il microambiente cancro. Per sezionare gli eventi molecolari, si ha la necessità di isolare diverse popolazioni di cellule in diverse fasi durante lo sviluppo del cancro. Utilizzando un modello murino di carcinoma a cellule basali, si descrive un protocollo per l&#39;analisi di cellule durante la carcinogenesi.

Analisi popolazione cellulare Durante carcinogenesi della pelle

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire analisi delle popolazioni cellulari nel modello murino di carcinoma a cellule basali del cancro della pelle. Questo viene raggiunto innanzitutto inducendo l'espressione del gene bersaglio nei topi. Nel secondo passaggio, l'epidermide viene isolata dalla pelle del topo.Dopo aver ottenuto una sospensione di singole cellule, le cellule epidermiche vengono marcate con specifici marcatori di superficie cellulare. In definitiva, i cambiamenti nelle popolazioni cellulari durante lo sviluppo del tumore a livello cutaneo possono essere monitorati mediante analisi citometrica in flusso. Lo sviluppo del cancro è un processo che coinvolge numerosi tipi cellulari.Lo scopo di questa procedura è aiutare il ricercatore a studiare come diverse cellule contribuiscano allo sviluppo del cancro della pelle. Questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni cellulari durante la formazione del cancro cutaneo, ma può essere applicato anche ad altri sistemi, come il cancro del pancreas. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è difficile stabilire quando l'esperimento debba essere interrotto senza una valutazione visiva.Per iniziare, incrociare topi ma cheratina 14 Cree ER, indicati come topi K 14, con topi Rosa 26 contenenti il gene smoothened mutante marcato con YFP SMU M due, indicati come SMU. Successivamente, immergere campioni di coda lunghi 0,5 centimetri, ottenuti da topi doppio positivi di età compresa tra tre e sei settimane, in soluzione di lisi per PCR diretta da coda contenente proteinasi K a una concentrazione di 1 milligrammo per millilitro. Incubare quindi i campioni tutta la notte a 55 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, centrifugare i tessuti alla velocità massima in una microcentrifuga per rimuovere i detriti.Quindi, per genotipizzare ogni animale, utilizzare un microlitro di SNAT da ciascun campione in reazioni PCR individuali con primers e condizioni raccomandate dal fornitore. Utilizzare un ago da alimentazione curvo calibro 20 per somministrare tamoxifene agli animali. Doppia positività per K 14 C er e ROSA 26 mediante sondino orale per cinque giorni consecutivi per indurre l'espressione di OO M due nei cheratinociti.In generale, i fenotipi sono più gravi sull'orecchio e sulla coda dei topi K 14 OO con GFP marcato per prelevare la pelle per l'analisi cellulare. Per prima cosa, utilizzare un rasoio per rimuovere il pelo dall'animale sacrificato. Quindi rimuovere la pelle del topo e immergere il tessuto in soluzione disbe a 37 gradi Celsius per uno o due ore.Dopo il trattamento con dispa, utilizzare una pinzetta per separare l'epidermide dal derma. Successivamente, usare un paio di forbici per tritare l'epidermide. Quindi immergere il tessuto in una soluzione di collagenasi IV per uno o due ore a 37 gradi Celsius in un tubo da 50 millilitri.Agitare delicatamente il tubo ogni 20 minuti per dissociare le cellule. Utilizzare un microscopio per confermare la dissociazione cellulare quando si rilevano cellule singole nel mezzo di collagenasi. Incubare il campione per ulteriori 30 minuti per aumentare il rendimento cellulare.Quindi filtrare la miscela di tessuto attraverso un filtro cellulare da 70 micron e lavare le cellule per 10 minuti a 500 × g e temperatura ambiente. Per etichettare le cellule, iniziare risospendendo il pellet appena lavato in PBS integrato con FBS al 10%, alla concentrazione di 2,5 × 10⁶ cellule per millilitro. Successivamente, collocare la soluzione cellulare sul ghiaccio per 30 minuti per bloccare qualsiasi legame non specifico. Poi, trasferire aliquote delle cellule in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro per l'etichettatura con anticorpi specifici.Aggiungere gli anticorpi in ogni tubo a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Vortexare delicatamente i tubi per alcuni secondi per mescolare gli anticorpi con le cellule, quindi rimettere i tubi sul ghiaccio per altri 30 minuti. Dopo aver lavato i tubi con un millilitro di PBS, risospendere i pellet in PBS e aggiungere il DPI a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.Quando si analizzano i dati, selezionare innanzitutto le singole cellule in base al grafico di dispersione anteriore rispetto a quello laterale, escludendo le cellule morte positive al DABI. I topi non sviluppano carcinomi a cellule basali, a meno che non venga attivata la segnalazione hedgehog, come osservato in queste immagini. L'espressione indotta da tamoxifene della proteina smoothened oncogenica smooth M due YFP determina un fenotipo cutaneo evidente già a livello anatomico di crescita nei campioni cutanei colorati con ematossilina-eosina provenienti da questi animali.I tumori della pelle possono essere osservati nei topi K 14 SMU. Senza l'induzione di due YFP da parte di SMU M, la pelle dell'animale non ha mostrato una morfologia anomala mediante colorazione ematossilina-eosina. Questi dot plot mostrano un'analisi rappresentativa delle cellule mieloidi nei topi sani e in quelli con tumori.Le cellule CD11b positive GR1 positive derivano da cellule mieloidi, alcune delle quali sono cellule soppressorie di origine mieloide nei topi normali e nei topi non SMU M2 YFP indotti. La popolazione di cellule CD11b positive GR1 positive è appena rilevabile, ma aumenta in risposta all'infiammazione o allo sviluppo tumorale. Nei topi K14-SMU.L'espressione indotta di smu M two YFP e dei cheratinociti nella pelle determina un aumento della popolazione cellulare positiva per CD 11 B e positiva per GR one. Questa tecnica permetterà ai ricercatori nel campo della biologia della pelle di eseguire analisi molecolari del carcinoma a cellule B nei topi.

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Descriviamo un protocollo per isolare in modo efficiente le cellule T residenti nella pelle da biopsie cutanee umane. Questo protocollo produce un numero sufficiente di linfociti residenti nella pelle umana vitali per l'analisi citofluorimetrica e la coltura ex vivo.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

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Questo rapporto descrive un protocollo CUBIC per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare pattern di espressione delle proteine, le cellule proliferanti, e sebociti alla risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale dei topi adulti per una varietà di applicazioni a valle come la biologia molecolare, la biochimica, lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza e gli usi primari in vitro (ad esempio, clonogenici cheratinociti).

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Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

La seguente procedura descrive un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione tumorale melanocitica nella pelle dorsali murina, utilizzando un modello di topo geneticamente modificato. Questo protocollo descrive l'iniziazione macroscopica e microscopica del melanoma cutaneo.

Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti

La carcinogenesi cutanea a due stadi è indotta da due sostanze chimiche applicate topicamente. Un mutagen 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) provoca mutazioni nelle cellule epidermiche e una continua applicazione dello stimolatore di crescita generale 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato accelera la formazione di papilloma cutaneo.

Modello di carcinogenesi cutanea indotta dalla sostanza chimica utilizzando Dimethylbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

La combinazione di IBEX (iterative bleaching-extends-multiplexity) e di un saggio commerciale di marcatura dei nucleotidi (Click-iT EdU) consente il rilevamento e la categorizzazione dei tipi di cellule in divisione in processi altamente dinamici in sezioni fisse di tessuto murino congelato. Inoltre, una nuova pipeline di elaborazione delle immagini open source fornisce l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto rendimento.

Flusso di lavoro di imaging e analisi ad alto rendimento per la valutazione dei fenotipi delle cellule cutanee e degli stati di proliferazione nei campioni di tessuto

Qui, forniamo un metodo per l'analisi dell'imaging di cellule vive che può essere utilizzato per tracciare manualmente i lignaggi dei cheratinociti di passaggio 0 e che consente la raccolta di metriche di proliferazione, tra cui il destino della divisione cellulare e la durata del ciclo cellulare.

Imaging di cellule vive con fotografia time lapse per studiare la cinetica di proliferazione dei cheratinociti epidermici

Qui, presentiamo un protocollo semi-automatizzato per l'identificazione e la quantificazione di cellule immunitarie e non immunitarie in sezioni cutanee utilizzando SCAnED, una macro gratuita basata su ImageJ per la segmentazione della pelle.

SCAnED - Una macro di segmentazione cutanea open-source per il rilevamento semi-automatico di cellule e nuclei nei compartimenti cutanei epidermici e dermici

Scopri l'analisi delle popolazioni cellulari nel carcinoma basocellulare cutaneo utilizzando un modello murino con citometria a flusso. Questo metodo permette di studiare le interazioni tra cellule tumorali e microambiente.

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