Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare in modo imparziale i modelli di stato della cromatina combinatoria nei tessuti tumorali e nelle linee cellulari tumorali. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica del cancro, come ad esempio come uno stato di modifica dell'istone sterile potrebbe contribuire alla genesi del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile elaborare più modifiche istoniche, così come più campioni, sia contemporaneamente che in modo efficiente.

Innanzitutto, dissociare manualmente 50 milligrammi di tessuto di melanoma e due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS, utilizzando una lama di rasoio sterile. Tritare il tessuto in pezzi di tre o quattro millimetri per circa cinque minuti in una piastra sterile per coltura tissutale. Trasferire la soluzione tissutale in un tubo dissociatore e aggiungere un altro ottavo millilitro di HBSS.

Dissociare ulteriormente il tessuto, utilizzando un dissociatore, fino a omogeneizzarlo. Successivamente, reticolare il tessuto, aggiungendo 200 microlitri di formaldeide al 16% per tre millilitri di HBSS. Usando un mixer, agitare la miscela a 10 giri al minuto per esattamente 10 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo aver rimosso il campione dall'incubatore, aggiungere 200 microlitri di glicina tumorale per tre millilitri di campione e agitare la miscela a 10 giri/min per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Centrifugare il campione a 934 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius utilizzando una centrifuga da banco. Al termine, rimuovere il surnatante e aggiungere cinque millilitri di PBS ghiacciato.

Quindi, centrifugare nuovamente il campione a 934 volte g, quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere 300 microlitri di tampone di raccolta ChIP con inibitori della proteasi per 50 milligrammi di tessuto e lisare i campioni per 30 minuti su ghiaccio. Mentre le celle lisano, accendere il disgregatore a bagnomaria e il sistema di raffreddamento associato e lasciare che la temperatura raggiunga i quattro gradi Celsius.

Posizionare il tubo del sonicatore nel disgregatore a bagno d'acqua e sonicare il tessuto del melanoma per 60 cicli a 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per ottenere frammenti di cromatina da 200 a 600 paia di basi. Per otto milligrammi di tessuto di melanoma, incubare tre microgrammi di ciascun anticorpo istonico con 20 microlitri di perline magnetiche di proteina g e 100 microlitri di tampone bloccante di legame per due ore a quattro gradi Celsius con rotazione, utilizzando un revolver a tubo. Dopo la sonicazione, diluire il campione cinque volte utilizzando il tampone di diluizione ChIP per ridurre la concentrazione di SDS allo 0,1%Al termine dell'incubazione delle microsfere magnetiche dell'anticorpo e della proteina g, rimuovere il tampone di diluizione ChIP e risospendere le perle in 240 microlitri del tampone fresco.

Quindi, inserire 20 microlitri di aliquote delle perle in 12 provette separate, ognuna delle quali verrà utilizzata per un campione di tessuto separato. Aliquotare uniformemente il materiale sonicato sulle perle di proteina g con anticorpi specifici e ruotare i tubi utilizzando un revolver a tubo durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina dopo la reticolazione inversa, trasferire la soluzione proteica anticorpale in una piastra a 96 pozzetti e posizionarla su un supporto magnetico.

Dopo aver lasciato aderire le perline per almeno 30 secondi, rimuovere il surnatante. Lavare le perle cinque volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio RIPA ghiacciato utilizzando una pipetta multicanale. Muovere continuamente il magnete per 30 secondi per lavaggio, quindi rimuovere il surnatante.

Dopo le fasi di lavaggio, aggiungere una miscela master di tampone di eluizione, contenente 44 microlitri di tampone di eluizione diretta, un microlitro di Rnasi e cinque microlitri di protenasi k per chip e inserire il campione per la reticolazione inversa. Incubare i campioni utilizzando un termociclatore PCR per quattro ore a 37 gradi Celsius, quattro ore a 50 gradi Celsius e da otto a 16 ore a 65 gradi Celsius. La mattina successiva, riposizionare i campioni sul magnete e trasferire il surnatante in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti che contiene il DNA precipitato amminico.

Aggiungere 2,3 microsfere paramagnetiche alla soluzione e pipettare accuratamente su e giù 25 volte utilizzando una pipetta multicanale. Successivamente, incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per altri quattro minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% ai campioni e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi senza disturbare le perle. Dopo aver lasciato asciugare le perline, rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 30 microlitri di tracciale da 10 millimolari. Miscelare pipettando 25 volte.

Dopo aver incubato i campioni a temperatura ambiente, riposizionarli sul magnete e incubare a temperatura ambiente per altri quattro minuti. Trasferire 20 microlitri di ciascun campione in una nuova piastra a 96 pozzetti per la preparazione della libreria. Dopo l'amplificazione PCR, rimuovere i campioni e portare il volume totale a 100 microlitri utilizzando acqua priva di nucleo.

Eseguire la selezione della dimensione paramagnetica su entrambi i lati aggiungendo prima 55 microlitri di perle a ciascun campione e mescolando 25 volte con una pipetta. Quindi incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per altri quattro minuti per ottenere frammenti di grandi dimensioni sulle perle che non sono adatti al sequenziamento.

Dopo l'incubazione, trasferire il surnatante in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere altri 25 microlitri di microsfere paramagnetiche e mescolare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente dal magnete per quattro minuti. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti.

Quindi scartare il surnatante. Lasciando i campioni sul magnete, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi senza disturbare le perle. Togliere l'etanolo e ripetere il lavaggio.

Dopo aver lasciato asciugare le perle, rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 25 microlitri di 10 millimolari di tracce a pH 8,0. Mescolare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente, lontano dal magnete per quattro minuti. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti.

Ora, quantifica le librerie utilizzando uno strumento per elettroferogramma del DNA ad alta sensibilità prima del multiplexing per assicurarti che le dimensioni siano adatte al sequenziamento. Questo protocollo consente l'immunoprecipitazione di tessuti tumorali congelati e linee cellulari che può essere eseguita su dozzine di campioni e in parallelo utilizzando un metodo ad alto rendimento. I frammenti di cromatina dovrebbero variare tra 200 e 1000 coppie di basi per un'immunoprecipitazione ottimale.

Il DNA ChIP purificato deve essere quantificato prima di procedere alla preparazione della libreria. Le librerie completate adatte al multiplexing e al sequenziamento di nuova generazione devono avere un numero compreso tra 200 e 600 coppie di basi ed essere prive di dimeri di primer. Dopo la post-sequenziazione, ci sono molte metriche di controllo della qualità che dovrebbero essere soddisfatte prima di procedere alle fasi successive della pipeline, come la chiamata dei picchi macs e l'analisi chromHmm.

campioni di ChIP devono essere arricchiti con il DNA in ingresso e ogni modifica istonica deve mostrare un profilo distinto che rappresenta una componente specifica del panorama epigenetico. L'algoritmo HMM al cromo utilizza un modello di Markov nascosto multivariato per identificare i modelli di cromatina combinatoria e spaziale ricorrenti più importanti in base alle modificazioni istoniche studiate. Utilizzando queste sei modifiche, l'HMM cromato identifica stati cromatinici funzionalmente distinti che rappresentano sia domini repressivi che attivi, come la repressione policomb, la repressione eterocromatica, la trascrizione attiva e gli enhancer attivi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante determinare le condizioni di sonicazione ottimali e le specifiche per gli anticorpi prima di continuare con la preparazione della libreria e l'analisi dei dati. Per apprendere questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento RRS e l'acquisizione della conferma cromosomica, per determinare la coalizione delle parti dello stato della cromatina con l'espressione genica e la struttura della cromatina più elevata.

Dopo l'esperimento, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica del cancro per esplorare i modelli di stato della cromatina nei campioni di tumore dei pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare e dissociare i tessuti tumorali, eseguire l'immunoprecipitazione della cromatina, preparare le librerie per il sequenziamento di nuova generazione, elaborare i dati post-sequenziamento e ottenere informazioni sulle fasi iniziali dell'analisi a valle. Non dimenticare che quando si lavora con la formaldeide, può essere estremamente pericolosa e quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come una cappa aspirante appropriata.