Name: Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri un protocollo ChIP-sequencing ad alto rendimento per mappare gli stati di cromatina nei tessuti tumorali. Questo metodo computazionale permette di analizzare modificazioni istoniche multiple simultaneamente, offrendo nuove prospettive nell'epigenetica del cancro.

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Ringraziamo Marcus Coyle, Curtis Gumbs, core SMF a MDACC per il supporto di sequenziamento. Il lavoro descritto in questo articolo è stato sostenuto da sovvenzioni dalla concessione NIH (CA016672) al nucleo di SMF e NCI awards (1K99CA160578 e R00CA160578) a K. R.

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti.

Questo protocollo descrive un modulo di ChIP-seq di alto-rendimento completo ed esaustivo per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in linee cellulari e tessuti del tumore umano. In qualsiasi protocollo di ChIP-seq, uno dei passi più importanti è la specificità dell'anticorpo. Qui, questo metodo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per le modifiche dell'istone sei descritta, i quali sono ChIP-grado e sono stati già convalidati nel nostro ed altri laboratori42,<su...

La maggior parte del genoma di mammiferi (98-99%) è costituita di sequenza non codificante, e queste regioni nocoding contengono elementi regolatori noti per partecipare nel controllare l'espressione genica e della cromatina organizzazione1,2. In una cellula normale, l'assembly specifico del DNA genomico in struttura della cromatina compattato è critica per l'organizzazione spaziale, regolamento e tempi precisi di vari processi DNA-collegato3,4,5. In una cellula tumorale tuttavia, modificazioni della cromatina di meccanismi epigenetici aberranti possono portare alla errata organizzazione della struttura della cromatina, compreso l'accesso a elementi regolatori, sistemi di loop cromosomiche e gene expression patterns6, 7,8,9,10.
Nonostante i recenti progressi, abbiamo limitato comprensione delle alterazioni epigenetiche che sono associati con la progressione del tumore o risposta terapeutica. L'epigenoma è costituito da una matrice di modifiche, tra cui marchi dell'istone e metilazione del DNA, che collettivamente formano uno stato dinamico (denominato stato di cromatina) che incide su reti di espressione genica e altri processi critici per il mantenimento identità cellulare. Recentemente, le alterazioni in esaltatori sono state indicate in malignità multiple studiando H3K27Ac profili11. Sebbene tali studi consentono di comprendere la correlazione dei marchi epigenetici isolati, più di 100 modificazioni epigenetiche sono stati identificati12,13 senza chiara comprensione dei loro ruoli biologici e interdipendenza. Inoltre, ci sono un numero ancora maggiore di modelli possibili combinatoriale di questi istoni e modificazioni del DNA, e non questi modelli combinatoriali - modifiche non individuali - che dettano epigenetici stati14. Quindi, c'è urgente bisogno di identificare le alterazioni in questi stati di cromatina durante la progressione del cancro o le risposte alla terapia. Conoscenza completa dell'epigenoma alterazioni nei cancri ha stato in ritardo in parte a causa di tecniche (ad esempio la generazione di dati su larga scala da piccole quantità di cliniche materiale/singole cellule) e analitiche (ad es. algoritmi per definire sfide di combinatoria Stati). Di conseguenza, c'è esigenza critica di metodi robusti ad alta produttività per la profilatura di gran numero di segni di modifiche dell'istone da materiale clinico e facile da implementare approcci computazionali per predire i modelli combinatoriale che faciliterà determinazione degli Stati epigenetici associato a diversi stadi di tumorigenesis e resistenza terapeutica. Ulteriori, dati disponibili dal recente epigenome profilatura studi15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in tessuti normali e linee cellulari può essere integrata con i profili di cromatina dei tumori per ulteriori approfondimenti su epigenome contributo alla biologia del tumore.
Profilatura di cromatina è diventato un potente strumento per identificare i modelli di associazione globale di vari cromatina modifiche15,24. Negli ultimi anni, ChIP-seq è diventato il "gold standard" per lo studio delle interazioni DNA-proteina su una scala globale25,26,27. Per ogni esperimento ChIP-seq, ci sono passaggi critici necessari per il suo successo, tra cui la dissociazione e la lavorazione del tessuto, determinare condizioni ottimale sonicazione, determinare la concentrazione di anticorpi ottimale per precipitazione, preparazione di biblioteca, Post-sequenziamento di elaborazione dei dati e dell'analisi a valle. Ognuno di questi passaggi contengono i punti di controllo chiave di controllo di qualità e quando presi insieme, sono cruciale per l'identificazione di potenziali bersagli per validazione funzionale correttamente. Attraverso l'innovazione in questi passaggi, parecchi studi precedenti hanno sviluppato metodologie per eseguire ChIP o ChIP-Seq da piccole quantità di tessuti28,29,30,31,32 . Inoltre, alcuni studi hanno suggerito protocolli per esperimenti di ChIP di alto-rendimento seguiti da PCR basati quantificazione33,34. Infine, alcune piattaforme di analisi disponibili pubblicamente per ChIP-Seq dati sono ora disponibili come Easeq35 e36di Galaxy. Tuttavia, è mancata una piattaforma integrata per l'esecuzione di ChIP-Seq in una moda di alto-rendimento in combinazione con una pipeline di calcolo per eseguire singolo marchio, come pure analisi dello stato della cromatina.
Questo protocollo descrive un workflow di ChIP-seq completo ed esauriente per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in tessuti tumorali e linee cellulari, con facile seguire le linee guida che comprende tutti i passaggi necessari per un esperimento riuscito. Adottando un metodo di alto-rendimento precedentemente descritto da Blecher-Gonen et al. 37, questo protocollo può essere eseguito su decine di campioni in parallelo ed è stato applicato con successo su linee cellulari del cancro e tumori umani quali il melanoma, colon, prostata e glioblastoma multiforme. Dimostriamo la metodologia per sei modifiche dell'istone di nucleo che rappresentano componenti chiave del panorama normativo epigenetico in linee cellulari di melanoma umano e campioni di tumore. Queste modifiche includono H3K27ac (esaltatori), H3K4me1 (attivi e in bilico rinforzatori), H3K4me3 (promotori), H3K79me2 (trascritto regioni), H3K27me3 (polycomb repressione) e H3K9me3 (heterochromatic repressione). Questi segni utilizzabile da solo o in combinazione per identificare stati di cromatina funzionalmente distinte che rappresentano i domini sia repressivi e attivi.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo H3K4me1 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27ac di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me3 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K79me2 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27me3 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>ChIP H3K9me3 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Life Scienze</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagenti</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Senza IgG</td><td>Sigma - Life Scienze</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tubo</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>tubo di dissociazione</td></tr><tr><td>16% formaldeide</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>inibitore della miniproteasi&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>compresse inibitori della proteasi</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS provette 0,65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>provette di sonicazione</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120,27</td><td>96 pozzetti supporto magnetico</td></tr><tr><td>tampone TE</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Perline AMPure XP Perline</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Perline paramagnetiche</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Kit di saggi ad alta sensibilità Qubit ds DNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>reagenti DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit di preparazione della libreria DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td> Kit di <td>preparazione della libreria DNA</td></tr><tr><td>Acqua</td> <td>priva di nucleasiAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ScreenTape D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>reagenti DNA ad</td></tr><tr><td>alta sensibilità Reagenti D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>reagenti DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Primer indice - Set 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>strumento per elettroferogramma DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>Dispositivo di sonicazione Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>disputatore a bagnomaria</td></tr><tr><td>Mixer</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termociclatore</td></tr><tr><td>a bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel Pipet</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>Piastra con gonna a 96 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrifuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td><td>centrifuga da banco</td></tr><tr><td>Centrifuga 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>centrifuga da tavolo</td></tr><tr><td>Strisce ottiche per provette (8x strisce)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tappi ottici per provette (8x strisce)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Punte di caricamento, 10 confezioni</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Vortice IKA MS3 Vortice</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli stati di cromatina usando high-throughput chip-sequencing nei tessuti del tumore

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modificazioni istoniche costituiscono una componente importante dell'epigenoma e svolgono un ruolo importante regolamentazione nella determinazione dello stato trascrizionale di loci associati. Inoltre, la presenza di modifiche specifiche è stata utilizzata per determinare la posizione e l'identità non codificanti elementi funzionali come rinforzatori. Negli ultimi anni, immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è diventato un potente strumento nel determinare i profili di genoma di modificazioni istoniche individuali. Tuttavia, è diventato sempre più chiaro che i modelli combinatoriali delle modificazioni della cromatina, denominati Stati della cromatina, determinano l'identità e la natura del locus genomico associato. Pertanto, i flussi di lavoro costituito da metodologie di (HT) robusti ad alta produttività per l'analisi di un numero di segni di modifiche dell'istone, nonché condotte analisi computazionali capaci di gestire miriadi di ChIP-Seq profilatura DataSet, sono necessari per completa determinazione degli Stati di epigenomic in gran numero di campioni. Il HT-ChIP-Seq flusso di lavoro qui presentato è costituito da due moduli: 1) un protocollo sperimentale per la profilatura diverse modificazioni istoniche da piccole quantità di campioni tumorali e linee cellulari in un formato a 96 pozzetti; e 2) una pipeline di analisi computazionale dati che combina gli strumenti esistenti per calcolare sia marchio individuale occupazione e modelli di stato della cromatina combinatoria. Insieme, questi due moduli facilitano facile elaborazione di centinaia di campioni di ChIP-Seq in maniera veloce ed efficiente. Il flusso di lavoro qui presentato è utilizzato per derivare modelli di stato della cromatina da 6 profili di contrassegno dell'istone in linee cellulari e tumori del melanoma. Nel complesso, vi presentiamo un flusso di lavoro completo di ChIP-seq che possa essere applicato a decine di campioni tumorali umani e linee cellulari di cancro per determinare aberrazioni epigenomic in varie malignità.

Questo protocollo permette l'immunoprecipitazione da tessuti tumorali congelati e linee cellulari che possono essere eseguite su decine di campioni in parallelo utilizzando un metodo di alto-rendimento (Figura 1A). Frammenti di cromatina deve essere compreso tra ~ 200-1000 bps per immunoprecipitazione ottimale. Abbiamo notato che il tempo necessario per raggiungere la stessa lunghezza di taglio differisce per diversi tessuti e tipi di cellule...

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare in modo imparziale i modelli di stato della cromatina combinatoria nei tessuti tumorali e nelle linee cellulari tumorali. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica del cancro, come ad esempio come uno stato di modifica dell'istone sterile potrebbe contribuire alla genesi del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile elaborare più modifiche istoniche, così come più campioni, sia contemporaneamente che in modo efficiente.Innanzitutto, dissociare manualmente 50 milligrammi di tessuto di melanoma e due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS, utilizzando una lama di rasoio sterile. Tritare il tessuto in pezzi di tre o quattro millimetri per circa cinque minuti in una piastra sterile per coltura tissutale. Trasferire la soluzione tissutale in un tubo dissociatore e aggiungere un altro ottavo millilitro di HBSS.Dissociare ulteriormente il tessuto, utilizzando un dissociatore, fino a omogeneizzarlo. Successivamente, reticolare il tessuto, aggiungendo 200 microlitri di formaldeide al 16% per tre millilitri di HBSS. Usando un mixer, agitare la mis

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L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è un metodo...

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Questo articolo descrive un protocollo ChIP-Seq semiautomatico e microscalato di regioni del DNA associate a una specifica modificazione degli istoni (H3K27ac) utilizzando una piattaforma di gestione dei liquidi ChIP, seguita dalla preparazione della libreria utilizzando la tagmentazione. La procedura comprende la valutazione del controllo ai fini della qualità e della quantità e può essere adottata per altre modificazioni istoniche o fattori di trascrizione.

Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

È descritto un protocollo ottimizzato Cliavage Under Target and Release Using Nuclease followed by next generation sequencing (CUT&amp;RUN-seq) per le linee cellulari neuroendocrine di cancro polmonare a piccole cellule. Consente la mappatura genomica a livello genomico di varie modifiche degli istoni e dei siti di legame del fattore di trascrizione (ad esempio E2F7) per indagare la deregolazione epigenetica e trascrizionale nella patobiologia degli SCLC.

Mappatura a livello genomico delle modifiche degli istoni e dei siti di legame dei fattori di trascrizione nelle linee cellulari neuroendocrine di cancro polmonare a piccole cellule utilizzando CUT&amp;RUN

Scopri un protocollo ChIP-sequencing ad alto rendimento per mappare gli stati di cromatina nei tessuti tumorali. Questo metodo computazionale permette di analizzare modificazioni istoniche multiple simultaneamente, offrendo nuove prospettive nell'epigenetica del cancro.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore (Video) | JoVE Journal

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

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