Name: Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri un protocollo ChIP-sequencing ad alto rendimento per mappare gli stati di cromatina nei tessuti tumorali. Questo metodo computazionale permette di analizzare modificazioni istoniche multiple simultaneamente, offrendo nuove prospettive nell'epigenetica del cancro.

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Ringraziamo Marcus Coyle, Curtis Gumbs, core SMF a MDACC per il supporto di sequenziamento. Il lavoro descritto in questo articolo è stato sostenuto da sovvenzioni dalla concessione NIH (CA016672) al nucleo di SMF e NCI awards (1K99CA160578 e R00CA160578) a K. R.

<ol><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulated+Neighborhoods%3A+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMARCB1-mediated+SWI%2FSNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
<li>Jäger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178(2015).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li>
<li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(14)00205-6">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17320507">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01148-3">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li>
<li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033(2014).</li>
<li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086(2014).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromHMM%3A+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798982">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1%2C000+mouse+early+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li>
<li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method%2C+Matrix+ChIP%3A+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16397291">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Tang, M. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/819971#.WilfHUtrxZ0">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li>
<li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).</li>
<li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li>
<li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti.

Questo protocollo descrive un modulo di ChIP-seq di alto-rendimento completo ed esaustivo per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in linee cellulari e tessuti del tumore umano. In qualsiasi protocollo di ChIP-seq, uno dei passi più importanti è la specificità dell'anticorpo. Qui, questo metodo illustra le condizioni di immunoprecipitazione per le modifiche dell'istone sei descritta, i quali sono ChIP-grado e sono stati già convalidati nel nostro ed altri laboratori42,<su...

La maggior parte del genoma di mammiferi (98-99%) è costituita di sequenza non codificante, e queste regioni nocoding contengono elementi regolatori noti per partecipare nel controllare l'espressione genica e della cromatina organizzazione1,2. In una cellula normale, l'assembly specifico del DNA genomico in struttura della cromatina compattato è critica per l'organizzazione spaziale, regolamento e tempi precisi di vari processi DNA-collegato3,4,5. In una cellula tumorale tuttavia, modificazioni della cromatina di meccanismi epigenetici aberranti possono portare alla errata organizzazione della struttura della cromatina, compreso l'accesso a elementi regolatori, sistemi di loop cromosomiche e gene expression patterns6, 7,8,9,10.
Nonostante i recenti progressi, abbiamo limitato comprensione delle alterazioni epigenetiche che sono associati con la progressione del tumore o risposta terapeutica. L'epigenoma è costituito da una matrice di modifiche, tra cui marchi dell'istone e metilazione del DNA, che collettivamente formano uno stato dinamico (denominato stato di cromatina) che incide su reti di espressione genica e altri processi critici per il mantenimento identità cellulare. Recentemente, le alterazioni in esaltatori sono state indicate in malignità multiple studiando H3K27Ac profili11. Sebbene tali studi consentono di comprendere la correlazione dei marchi epigenetici isolati, più di 100 modificazioni epigenetiche sono stati identificati12,13 senza chiara comprensione dei loro ruoli biologici e interdipendenza. Inoltre, ci sono un numero ancora maggiore di modelli possibili combinatoriale di questi istoni e modificazioni del DNA, e non questi modelli combinatoriali - modifiche non individuali - che dettano epigenetici stati14. Quindi, c'è urgente bisogno di identificare le alterazioni in questi stati di cromatina durante la progressione del cancro o le risposte alla terapia. Conoscenza completa dell'epigenoma alterazioni nei cancri ha stato in ritardo in parte a causa di tecniche (ad esempio la generazione di dati su larga scala da piccole quantità di cliniche materiale/singole cellule) e analitiche (ad es. algoritmi per definire sfide di combinatoria Stati). Di conseguenza, c'è esigenza critica di metodi robusti ad alta produttività per la profilatura di gran numero di segni di modifiche dell'istone da materiale clinico e facile da implementare approcci computazionali per predire i modelli combinatoriale che faciliterà determinazione degli Stati epigenetici associato a diversi stadi di tumorigenesis e resistenza terapeutica. Ulteriori, dati disponibili dal recente epigenome profilatura studi15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in tessuti normali e linee cellulari può essere integrata con i profili di cromatina dei tumori per ulteriori approfondimenti su epigenome contributo alla biologia del tumore.
Profilatura di cromatina è diventato un potente strumento per identificare i modelli di associazione globale di vari cromatina modifiche15,24. Negli ultimi anni, ChIP-seq è diventato il "gold standard" per lo studio delle interazioni DNA-proteina su una scala globale25,26,27. Per ogni esperimento ChIP-seq, ci sono passaggi critici necessari per il suo successo, tra cui la dissociazione e la lavorazione del tessuto, determinare condizioni ottimale sonicazione, determinare la concentrazione di anticorpi ottimale per precipitazione, preparazione di biblioteca, Post-sequenziamento di elaborazione dei dati e dell'analisi a valle. Ognuno di questi passaggi contengono i punti di controllo chiave di controllo di qualità e quando presi insieme, sono cruciale per l'identificazione di potenziali bersagli per validazione funzionale correttamente. Attraverso l'innovazione in questi passaggi, parecchi studi precedenti hanno sviluppato metodologie per eseguire ChIP o ChIP-Seq da piccole quantità di tessuti28,29,30,31,32 . Inoltre, alcuni studi hanno suggerito protocolli per esperimenti di ChIP di alto-rendimento seguiti da PCR basati quantificazione33,34. Infine, alcune piattaforme di analisi disponibili pubblicamente per ChIP-Seq dati sono ora disponibili come Easeq35 e36di Galaxy. Tuttavia, è mancata una piattaforma integrata per l'esecuzione di ChIP-Seq in una moda di alto-rendimento in combinazione con una pipeline di calcolo per eseguire singolo marchio, come pure analisi dello stato della cromatina.
Questo protocollo descrive un workflow di ChIP-seq completo ed esauriente per la mappatura del genoma degli Stati della cromatina in tessuti tumorali e linee cellulari, con facile seguire le linee guida che comprende tutti i passaggi necessari per un esperimento riuscito. Adottando un metodo di alto-rendimento precedentemente descritto da Blecher-Gonen et al. 37, questo protocollo può essere eseguito su decine di campioni in parallelo ed è stato applicato con successo su linee cellulari del cancro e tumori umani quali il melanoma, colon, prostata e glioblastoma multiforme. Dimostriamo la metodologia per sei modifiche dell'istone di nucleo che rappresentano componenti chiave del panorama normativo epigenetico in linee cellulari di melanoma umano e campioni di tumore. Queste modifiche includono H3K27ac (esaltatori), H3K4me1 (attivi e in bilico rinforzatori), H3K4me3 (promotori), H3K79me2 (trascritto regioni), H3K27me3 (polycomb repressione) e H3K9me3 (heterochromatic repressione). Questi segni utilizzabile da solo o in combinazione per identificare stati di cromatina funzionalmente distinte che rappresentano i domini sia repressivi e attivi.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo H3K4me1 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27ac di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me3 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K79me2 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27me3 di grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>ChIP H3K9me3 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Life Scienze</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagenti</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Senza IgG</td><td>Sigma - Life Scienze</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tubo</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>tubo di dissociazione</td></tr><tr><td>16% formaldeide</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>inibitore della miniproteasi&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>compresse inibitori della proteasi</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS provette 0,65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>provette di sonicazione</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120,27</td><td>96 pozzetti supporto magnetico</td></tr><tr><td>tampone TE</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Perline AMPure XP Perline</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Perline paramagnetiche</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Kit di saggi ad alta sensibilità Qubit ds DNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>reagenti DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit di preparazione della libreria DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td> Kit di <td>preparazione della libreria DNA</td></tr><tr><td>Acqua</td> <td>priva di nucleasiAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ScreenTape D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>reagenti DNA ad</td></tr><tr><td>alta sensibilità Reagenti D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>reagenti DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Primer indice - Set 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>strumento per elettroferogramma DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>Dispositivo di sonicazione Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>disputatore a bagnomaria</td></tr><tr><td>Mixer</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termociclatore</td></tr><tr><td>a bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel Pipet</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>Piastra con gonna a 96 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrifuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td><td>centrifuga da banco</td></tr><tr><td>Centrifuga 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>centrifuga da tavolo</td></tr><tr><td>Strisce ottiche per provette (8x strisce)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tappi ottici per provette (8x strisce)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Punte di caricamento, 10 confezioni</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Vortice IKA MS3 Vortice</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli stati di cromatina usando high-throughput chip-sequencing nei tessuti del tumore

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modificazioni istoniche costituiscono una componente importante dell'epigenoma e svolgono un ruolo importante regolamentazione nella determinazione dello stato trascrizionale di loci associati. Inoltre, la presenza di modifiche specifiche è stata utilizzata per determinare la posizione e l'identità non codificanti elementi funzionali come rinforzatori. Negli ultimi anni, immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è diventato un potente strumento nel determinare i profili di genoma di modificazioni istoniche individuali. Tuttavia, è diventato sempre più chiaro che i modelli combinatoriali delle modificazioni della cromatina, denominati Stati della cromatina, determinano l'identità e la natura del locus genomico associato. Pertanto, i flussi di lavoro costituito da metodologie di (HT) robusti ad alta produttività per l'analisi di un numero di segni di modifiche dell'istone, nonché condotte analisi computazionali capaci di gestire miriadi di ChIP-Seq profilatura DataSet, sono necessari per completa determinazione degli Stati di epigenomic in gran numero di campioni. Il HT-ChIP-Seq flusso di lavoro qui presentato è costituito da due moduli: 1) un protocollo sperimentale per la profilatura diverse modificazioni istoniche da piccole quantità di campioni tumorali e linee cellulari in un formato a 96 pozzetti; e 2) una pipeline di analisi computazionale dati che combina gli strumenti esistenti per calcolare sia marchio individuale occupazione e modelli di stato della cromatina combinatoria. Insieme, questi due moduli facilitano facile elaborazione di centinaia di campioni di ChIP-Seq in maniera veloce ed efficiente. Il flusso di lavoro qui presentato è utilizzato per derivare modelli di stato della cromatina da 6 profili di contrassegno dell'istone in linee cellulari e tumori del melanoma. Nel complesso, vi presentiamo un flusso di lavoro completo di ChIP-seq che possa essere applicato a decine di campioni tumorali umani e linee cellulari di cancro per determinare aberrazioni epigenomic in varie malignità.

Questo protocollo permette l'immunoprecipitazione da tessuti tumorali congelati e linee cellulari che possono essere eseguite su decine di campioni in parallelo utilizzando un metodo di alto-rendimento (Figura 1A). Frammenti di cromatina deve essere compreso tra ~ 200-1000 bps per immunoprecipitazione ottimale. Abbiamo notato che il tempo necessario per raggiungere la stessa lunghezza di taglio differisce per diversi tessuti e tipi di cellule...

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare in modo imparziale i modelli di stato della cromatina combinatoria nei tessuti tumorali e nelle linee cellulari tumorali. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica del cancro, come ad esempio come uno stato di modifica dell'istone sterile potrebbe contribuire alla genesi del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile elaborare più modifiche istoniche, così come più campioni, sia contemporaneamente che in modo efficiente.Innanzitutto, dissociare manualmente 50 milligrammi di tessuto di melanoma e due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS, utilizzando una lama di rasoio sterile. Tritare il tessuto in pezzi di tre o quattro millimetri per circa cinque minuti in una piastra sterile per coltura tissutale. Trasferire la soluzione tissutale in un tubo dissociatore e aggiungere un altro ottavo millilitro di HBSS.Dissociare ulteriormente il tessuto, utilizzando un dissociatore, fino a omogeneizzarlo. Successivamente, reticolare il tessuto, aggiungendo 200 microlitri di formaldeide al 16% per tre millilitri di HBSS. Usando un mixer, agitare la miscela a 10 giri al minuto per esattamente 10 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo aver rimosso il campione dall'incubatore, aggiungere 200 microlitri di glicina tumorale per tre millilitri di campione e agitare la miscela a 10 giri/min per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Centrifugare il campione a 934 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius utilizzando una centrifuga da banco. Al termine, rimuovere il surnatante e aggiungere cinque millilitri di PBS ghiacciato.Quindi, centrifugare nuovamente il campione a 934 volte g, quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere 300 microlitri di tampone di raccolta ChIP con inibitori della proteasi per 50 milligrammi di tessuto e lisare i campioni per 30 minuti su ghiaccio. Mentre le celle lisano, accendere il disgregatore a bagnomaria e il sistema di raffreddamento associato e lasciare che la temperatura raggiunga i quattro gradi Celsius.Posizionare il tubo del sonicatore nel disgregatore a bagno d'acqua e sonicare il tessuto del melanoma per 60 cicli a 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per ottenere frammenti di cromatina da 200 a 600 paia di basi. Per otto milligrammi di tessuto di melanoma, incubare tre microgrammi di ciascun anticorpo istonico con 20 microlitri di perline magnetiche di proteina g e 100 microlitri di tampone bloccante di legame per due ore a quattro gradi Celsius con rotazione, utilizzando un revolver a tubo. Dopo la sonicazione, diluire il campione cinque volte utilizzando il tampone di diluizione ChIP per ridurre la concentrazione di SDS allo 0,1%Al termine dell'incubazione delle microsfere magnetiche dell'anticorpo e della proteina g, rimuovere il tampone di diluizione ChIP e risospendere le perle in 240 microlitri del tampone fresco.Quindi, inserire 20 microlitri di aliquote delle perle in 12 provette separate, ognuna delle quali verrà utilizzata per un campione di tessuto separato. Aliquotare uniformemente il materiale sonicato sulle perle di proteina g con anticorpi specifici e ruotare i tubi utilizzando un revolver a tubo durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina dopo la reticolazione inversa, trasferire la soluzione proteica anticorpale in una piastra a 96 pozzetti e posizionarla su un supporto magnetico.Dopo aver lasciato aderire le perline per almeno 30 secondi, rimuovere il surnatante. Lavare le perle cinque volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio RIPA ghiacciato utilizzando una pipetta multicanale. Muovere continuamente il magnete per 30 secondi per lavaggio, quindi rimuovere il surnatante.Dopo le fasi di lavaggio, aggiungere una miscela master di tampone di eluizione, contenente 44 microlitri di tampone di eluizione diretta, un microlitro di Rnasi e cinque microlitri di protenasi k per chip e inserire il campione per la reticolazione inversa. Incubare i campioni utilizzando un termociclatore PCR per quattro ore a 37 gradi Celsius, quattro ore a 50 gradi Celsius e da otto a 16 ore a 65 gradi Celsius. La mattina successiva, riposizionare i campioni sul magnete e trasferire il surnatante in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti che contiene il DNA precipitato amminico.Aggiungere 2,3 microsfere paramagnetiche alla soluzione e pipettare accuratamente su e giù 25 volte utilizzando una pipetta multicanale. Successivamente, incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per altri quattro minuti.Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% ai campioni e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi senza disturbare le perle. Dopo aver lasciato asciugare le perline, rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 30 microlitri di tracciale da 10 millimolari. Miscelare pipettando 25 volte.Dopo aver incubato i campioni a temperatura ambiente, riposizionarli sul magnete e incubare a temperatura ambiente per altri quattro minuti. Trasferire 20 microlitri di ciascun campione in una nuova piastra a 96 pozzetti per la preparazione della libreria. Dopo l'amplificazione PCR, rimuovere i campioni e portare il volume totale a 100 microlitri utilizzando acqua priva di nucleo.Eseguire la selezione della dimensione paramagnetica su entrambi i lati aggiungendo prima 55 microlitri di perle a ciascun campione e mescolando 25 volte con una pipetta. Quindi incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per altri quattro minuti per ottenere frammenti di grandi dimensioni sulle perle che non sono adatti al sequenziamento.Dopo l'incubazione, trasferire il surnatante in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere altri 25 microlitri di microsfere paramagnetiche e mescolare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente dal magnete per quattro minuti. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti.Quindi scartare il surnatante. Lasciando i campioni sul magnete, aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi senza disturbare le perle. Togliere l'etanolo e ripetere il lavaggio.Dopo aver lasciato asciugare le perle, rimuovere i campioni dal magnete e aggiungere 25 microlitri di 10 millimolari di tracce a pH 8,0. Mescolare pipettando 25 volte e incubare a temperatura ambiente, lontano dal magnete per quattro minuti. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, riposizionare i campioni sul magnete e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti.Ora, quantifica le librerie utilizzando uno strumento per elettroferogramma del DNA ad alta sensibilità prima del multiplexing per assicurarti che le dimensioni siano adatte al sequenziamento. Questo protocollo consente l'immunoprecipitazione di tessuti tumorali congelati e linee cellulari che può essere eseguita su dozzine di campioni e in parallelo utilizzando un metodo ad alto rendimento. I frammenti di cromatina dovrebbero variare tra 200 e 1000 coppie di basi per un'immunoprecipitazione ottimale.Il DNA ChIP purificato deve essere quantificato prima di procedere alla preparazione della libreria. Le librerie completate adatte al multiplexing e al sequenziamento di nuova generazione devono avere un numero compreso tra 200 e 600 coppie di basi ed essere prive di dimeri di primer. Dopo la post-sequenziazione, ci sono molte metriche di controllo della qualità che dovrebbero essere soddisfatte prima di procedere alle fasi successive della pipeline, come la chiamata dei picchi macs e l'analisi chromHmm.I campioni di ChIP devono essere arricchiti con il DNA in ingresso e ogni modifica istonica deve mostrare un profilo distinto che rappresenta una componente specifica del panorama epigenetico. L'algoritmo HMM al cromo utilizza un modello di Markov nascosto multivariato per identificare i modelli di cromatina combinatoria e spaziale ricorrenti più importanti in base alle modificazioni istoniche studiate. Utilizzando queste sei modifiche, l'HMM cromato identifica stati cromatinici funzionalmente distinti che rappresentano sia domini repressivi che attivi, come la repressione policomb, la repressione eterocromatica, la trascrizione attiva e gli enhancer attivi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante determinare le condizioni di sonicazione ottimali e le specifiche per gli anticorpi prima di continuare con la preparazione della libreria e l'analisi dei dati. Per apprendere questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento RRS e l'acquisizione della conferma cromosomica, per determinare la coalizione delle parti dello stato della cromatina con l'espressione genica e la struttura della cromatina più elevata.Dopo l'esperimento, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica del cancro per esplorare i modelli di stato della cromatina nei campioni di tumore dei pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare e dissociare i tessuti tumorali, eseguire l'immunoprecipitazione della cromatina, preparare le librerie per il sequenziamento di nuova generazione, elaborare i dati post-sequenziamento e ottenere informazioni sulle fasi iniziali dell'analisi a valle. Non dimenticare che quando si lavora con la formaldeide, può essere estremamente pericolosa e quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come una cappa aspirante appropriata.

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Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

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Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore (Video) | JoVE Journal

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

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