Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare il potenziale di migrazione dei neuroprogenitori enterici in presenza di vari fattori di crescita. Ciò si ottiene sezionando prima l'intestino tenue embrionale di topo popolato da cellule neurocroste fluorescenti. Il secondo passo consiste nell'utilizzare un microtomo vibrante per realizzare fette di intestino spesse 200 micron.

Successivamente, queste fette vengono incubate sopra un gel di collagene contenente fattori di crescita. Il passaggio finale consiste nel staccare le fette per rivelare le cellule migratorie sottostanti. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per mostrare il modello di migrazione delle cellule all'interno del gel di collagene.

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nella biologia dello sviluppo, come fornire una migliore comprensione dell'interazione tra le varie vie di segnalazione alla base della formazione del sistema nervoso periferico. 12 giorni dopo il ritrovamento di un tappo vaginale, sopprimere la femmina di topo e rimuovere l'utero, mettere l'utero in una capsula di Petri di vetro piena di ghiaccio. La PBS fredda taglia l'utero trasversalmente tra i singoli rigonfiamenti del deum per isolare ogni sito di impianto dell'embrione al microscopio da dissezione, usa una pinza sottile per rimuovere lo strato muscolare dell'utero.

Apri il sacco vitellino viscerale e l'amnio per rivelare l'embrione. Fai attenzione quando recidi i vasi sanguigni, unendo l'embrione al sacco vitellino poiché sono intrecciati con l'intestino in via di sviluppo. Quindi, inserisci una pinza chiusa nella cavità addominale appena sopra il fegato di colore rosso scuro e lasciali aprire.

Questo crea un'apertura trasversale nella cavità dell'addome. Tirare la pinza aperta verso il basso verso l'estremità posteriore dell'embrione per aprire completamente l'addome. Una volta aperto, afferra il tessuto connettivo dietro il fegato ed estrai le budella.

Facendo attenzione a non rompere l'intestino. Taglia il colon in qualsiasi punto per liberare le viscere dal resto dell'embrione. Riserva la parte della coda per dopo.

Estrarre il tessuto connettivo dal cieco e poi l'intestino lavorando con attenzione per non ferirli sull'estremità rostrale dell'intestino tenue. Tagliare il fegato e lo stomaco, nonché il meso, il nefro e le creste genitali, se presenti. Infine, isolare l'intestino tenue tagliando via il cieco e il colon, nonché il tessuto connettivo rimanente.

Come prima, fai attenzione a non intaccare l'intestino. Lasciare l'intestino tenue in PBS a temperatura ambiente per il minor tempo possibile prima di incorporarlo. Dopo aver reciso l'embrione al collo, registrare il numero di somiti della coda per determinare con precisione lo stadio di sviluppo embrionale.

Prima di procedere con le dissezioni embrionali, sciogliere 1,5 grammi di agros in 100 millilitri di PBS e mantenere a 50 gradi Celsius. Preparare lo stampo da inclusione tagliando longitudinalmente una provetta da microcentrifuga da due millilitri per asportare circa un quarto della parete della provetta. Versare gli agro sciolti nello stampo e lasciarlo raffreddare fino a quando non sarà solo leggermente caldo al tatto.

Quando è pronto, tenere l'intestino con una pinza per l'estremità rostrale piegata e tirarlo molto lentamente attraverso l'agros, lungo la lunghezza dello stampo. Questo aiuta a mantenere l'intestino dritto mentre gli agro set rilasciano il tessuto non appena inizia a resistere allo spostamento e tengono traccia dell'orientamento della coccola rostrale dell'intestino. Successivamente, mettere lo stampo in frigorifero per due o tre minuti per farlo solidificare completamente.

Una volta solidificati, togliete gli agro dallo stampo e rifilate gli agro in eccesso ad entrambe le estremità, praticando dei tagli perpendicolari all'intestino. Incollare l'estremità rostrale del blocco agros al tavolino metallico di un microtomo e tagliare l'eccesso di aros su tutti i lati. Quindi, montare lo stadio metallico sulla camera vibrante del microtomo.

Se necessario, regolare l'angolazione del tavolino in modo che l'intestino sia il più verticale possibile. Coprire il campione con PBS ghiacciato prima di portare la lama microtone a pochi millimetri sotto la superficie del tampone. Quando è pronto, eseguire tagli trasversali di 200 micron della coccola più dell'intestino tenue.

Assicurarsi che ogni fetta di agro contenga una sezione intestinale completa. Depositare delicatamente le fette appena tagliate su un gel di collagene precedentemente preparato. Posizionando una fetta verso il centro di ogni pozzetto per consentire la migrazione delle cellule della cresta neuronale fuori dalle melanzane, incubare le fette per tre giorni.

Trascorso questo tempo, rimuovere delicatamente le fette dal gel di collagene con una pinza, facendo attenzione a non danneggiare il gel sottostante. Per garantire che il modello di migrazione cellulare non venga disturbato, è importante evitare di toccare direttamente il gel di collagene durante le successive fasi di incubazione e lavaggio. Per prima cosa, fissare le celle con 500 microlitri di PFA al 4% per pozzetto per un'ora a temperatura ambiente.

Successivamente, sostituire il fissativo con 500 microlitri di soluzione DPI per pozzetto e incubare per 10 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere con cura la soluzione DPI e lavare ogni pozzetto tre volte con 500 microlitri di PBS per cinque minuti. Infine, fotografa le cellule fluorescenti incorporate nel gel di collagene all'interno di ciascun pozzetto.

In questo esempio, i fattori di crescita sono stati utilizzati per stimolare la migrazione delle cellule neurocroste enteriche che esprimono GFP. La linea tratteggiata rappresenta le dimensioni e la posizione approssimative dell'esposizione. Prima che venisse rimosso il gel, il numero e la diffusione delle cellule che esprimono GFP che migrano fuori dall'explan intestinale è risultato essere significativamente maggiore nelle condizioni trattate rispetto a quelle non trattate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare il potenziale di migrazione dei progenitori neurali enterici incubando fette intestinali su un gel di collagene contenente fattori di crescita.