Name: Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri l'immobilizzazione covalente di BMP-2 su superfici mediante monostrato auto-assemblato per studiare la segnalazione cellulare. Questo metodo preserva la bioattività della proteina per analisi di biologia cellulare.

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Ringraziamo il Prof. JP Spatz (Dipartimento di chimica biofisica, Università di Heidelberg e attrezzature dei nuovi materiali e dei Biosistemi, Istituto Max Planck per Sistemi Intelligenti, Stuttgart) per il suo supporto gentile. Il sostegno finanziario della Max-Planck-Gesellschaft e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) Sono notevolmente riconosciuto.

1. Sintesi di 11-Mercaptoundecanoyl-N-idrossisuccinimmide Ester (MU-NHS) <ol><li> Aggiungere goccia a goccia una soluzione di 500 mg di N-idrossisuccinimmide e 30 mg 4 - (dimetilammino) piridina in 10 ml di acetone (pa) a 1 g di acido 11-mercaptoundecanoic in 40 ml di diclorometano (pa) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Raffreddare la reazione a 0 ° C e aggiungere goccia a goccia 1,1 g N, N &#39;-dicicloesilcarbodiimmide in 10 ml di diclorometano (in atmosfera di azoto). Mantenere la reazione a bassa temperatura per 1 ora e poi agitare a temperatura ambiente durante la notte. </li><li> Filtrare il precipitato e asciugare sotto pressione ridotta. Purificare il prodotto mediante cromatografia flash con benzene petrolio e acetato di etile (pa) in un rapporto di 1:1. </li></ol> 2. Preparazione di strati d&#39;oro omogenei <ol><li> Vetrini pulite con panni di precisione e sonicare per 5 minuti in una soluzione contenente una miscela 1:1 di acetato di etile (pa) e metanolo (pa). Rinse substrati con metanolo e asciugare sotto flusso di azoto. </li><li> Posizionare i supporti puliti nel dispositivo di rivestimento polverizzazione. Evacuare la camera. Rimuovere lo strato di ossido di cromo superiore dal bersaglio di cromo sputtering per 60 sec. Porre i campioni sotto la trave di metallo e ricoprirli con uno strato di cromo 10 nm, seguita da rivestimento con uno strato di oro 40 nm. </li></ol> 3. Immobilizzazione superficie di BMP-2 <ol><li> Sciogliere MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentrazione finale di circa 1 mM e incubare substrati d&#39;oro nella soluzione MU-NHS a temperatura ambiente per 4 ore sotto atmosfera di azoto. </li><li> Superfici Sonicare in DMF per 2 minuti, sciacquare con DMF e MeOH e asciugare sotto flusso di azoto. </li><li> Preparare una soluzione stock di rhBMP-2 in sterile HCl 4 mm, con una concentrazione di 100 pg / ml (negozio aliquote a -80 ° C). Per diluizioni di lavoro (3,5 mcg / ml), diluire la soluzione madre in PBS / NaCl (PBS contenente 1 M NaCl) e unegolare a pH 8,5 immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Incubare superfici funzionalizzate MU-NHS nella soluzione rhBMP-2 ore a 4 ° C per una notte. Rimuovere il surnatante incubazione. Superfici Sonicare in PBS / NaCl per 2 minuti e lavare 3x con PBS sterile / NaCl. </li></ol> 4. Caratterizzazione superficiale <ol><li> Per bloccare l&#39;adsorbimento non specifico di anticorpo, incubare superfici con BSA 5% (w / v) in PBS per 1 ora a RT, seguita da incubazione con un anti-BMP-2 anticorpi (1:100 in 1% (w / v ) soluzione di BSA / PBS) per 1 ora a RT. Lavare le superfici due volte con PBS e ultrasuoni per 30 sec. </li><li> Incubare substrati con HRP-anticorpo secondario coniugato (1:1000 in 1% (w / v) di BSA / PBS) per 30 min a temperatura ambiente, poi lavare due volte con PBS. </li><li> Utilizzare Ampliflu test Red per misurare l&#39;attività enzimatica HRP a 570 nm con un lettore di piastre. </li></ol> 5. Analisi dell&#39;attività biologica <ol><li> Seed 1 x 10 5 topo C2C12 mioblasti per pozzetto in 6 pozzetti plAtes in terreno di coltura, costituiti da un elevato glucosio DMEM contenente piruvato supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Morire di fame cellule in DMEM senza siero per 3-5 ore prima di semina sulle superfici decorate con immobilizzata BMP-2. </li><li> Per le indagini dell&#39;induzione segnalazione breve termine, sostituire il mezzo da 200 microlitri DMEM fresco senza siero e posizionare le immobilizzati BMP-2 superfici sopra le celle. La superficie deve essere maneggiato con le pinzette punta fine per evitare di graffiare. </li><li> Rimuovere delicatamente le superfici e aspirare il terreno con una pipetta, lavare le cellule due volte con PBS. Procedere all&#39;analisi delle risposte delle cellule. </li><li> Per l&#39;analisi dell&#39;attività biologica a lungo termine, cellule piastra su superfici e cultura loro a 37 ° C / 5% di CO 2 in condizioni di siero bassi (2% FBS) per sei giorni. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo si descrive la preparazione di superfici funzionalizzate con bioattivo rhBMP-2. Questo approccio comprende due fasi: 1) la formazione iniziale di una auto-assemblaggio monostrato (SAM) di un linker bifunzionale sulla superficie di oro; 2) immobilizzazione covalente della proteina rhBMP-2. Nel lavoro precedente, abbiamo convalidato l&#39;effettivo legame del linker bifunzionale e il fattore di crescita, e dimostrato che in superficie immobilizzato rhBMP-2 mantiene la sua attività biologica 19.</...

Proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2) è un membro del fattore di crescita trasformante (TGF-β) famiglia e agisce come induttore del de novo formazione ossea e regolatore di diversi tessuti durante lo sviluppo embrionale e adulta omeostasi 1-3. Ogni monomero del omodimerica BMP-2 proteina biologicamente attiva contiene un motivo &quot;cisteina nodo&quot;, che è altamente conservata in tutti BMP 4. Sei dei sette residui di cisteina formano legami disolfuro intramolecolari che stabilizzano ciascun monomero, mentre la settima cisteina è coinvolto nella dimerizzazione, formando un legame intermolecolare tra i due monomeri 5,6. Questo nodo di cisteina altamente conservati definisce la struttura tridimensionale della proteina BMP-2 e determina le proprietà uniche, come la resistenza al calore, denaturanti e acido pH 7-9. BMP-2 si lega a serina / treonina chinasi recettori transmembrana, inducendo così la trasduzione del segnale <sup&gt; 10-12. A seconda della modalità di oligomerizzazione recettoriale, diverse vie di segnalazione vengono attivati: una cascata di segnalazione Smad-indipendente conduce ad induzione fosfatasi alcalina tramite segnalazione p38, mentre un percorso Smad-dipendente attivata risultati fosforilazione recettoriale in Smad traslocazione nucleare complesso e l&#39;attivazione della trascrizione dei specifici geni bersaglio, come l&#39;inibitore di differenziazione (Id) 12-14. In osso, BMP-2 induce la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e de novo formazione di osso. Attualmente, ricombinante espresso BMP-2 è applicata clinicamente per migliorare la guarigione di siti fratturati. Una strategia comune in ingegneria del tessuto osseo è l&#39;uso di fattori di crescita iniettabili, che è meno invasivo rispetto a sistemi di applicazione locale. Tuttavia, studi in vivo ed applicazioni cliniche hanno dimostrato che la breve emivita biologica, loc aspecificalizzazione e rapida domiciliazione del BMP-2 può portare a diversi problemi locali, ectopiche e sistemiche 15. Quindi, per ottenere una presentazione efficace, l&#39;intrappolamento o immobilizzazione di BMP-2 all&#39;interno o sul materiale necessario alla sua consegna locale e costante a sito bersaglio. Consegna sostenuta può essere ottenuto con metodi di conservazione non covalenti, come intrappolamento fisico, adsorbimento o complessazione di ioni 16. Tuttavia, è noto che adsorbimento non specifico di proteine ​​su superfici può causarne la denaturazione delle molecole 17. Per il legame di fattori di crescita covalente, diversi tipi di supporti sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni. L&#39;uso di molecole bifunzionali che mirano linking amminici o carbossilici gruppi della proteina per esempio, è un tipo di approccio che non richiede necessariamente modificazione delle proteine ​​per raggiungere la sua immobilizzazione. Infatti, mentre modificazione delle proteine ​​offre il vantaggio di controllare l&#39;orientamento proteine,l&#39;introduzione di domini artificiali, tag e catene peptidiche specifiche del sito può alterare l&#39;attività biologica di fattori di crescita 17. Così, per aggirare denaturazione dovuta all&#39;interazione con il materiale di supporto, le superfici possono essere funzionalizzati anticipo, per esempio, con un monostrato auto-assemblato (SAM) di una molecola di collegamento, seguito da accoppiamento del fattore desiderato 18. Abbiamo usato un approccio basato SAM per immobilizzare covalentemente BMP-2 su una superficie di mira i suoi residui amminici liberi e abbiamo dimostrato che la proteina immobilizzata mantiene sia la sua attività biologica a breve e lungo termine 19. Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 alle cellule per studi in vitro sui meccanismi che si verificano a livello della membrana cellulare e regolano segnalazione intracellulare responsabili per la segnalazione osteogenico.

<table><tbody><tr><td>N-idrossisuccinimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(dimetilammino)piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>acido 11-mercaptoundecanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-dicicloesilcarbodiimmide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrolio benzene</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformammide</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td>Senza carriere; espresso in E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli(dimetilsilossano) (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rhBMP-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Ampliflu Red test</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquido</td><td>Gibco</td><td>41966</td> Siero fetale bovino <td>ad alto contenuto di glucosio</td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Filtrato sterile, testato in coltura cellulare</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina 0,05% (1x) con EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina (0,1 M)</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Tampone di lisi (saggio ALP)19</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di zinco (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrofenilfosfato (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>Substrato della fosfatasi</td></tr><tr><td>Anti-misina catena pesante (MHC)</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi, Università dell'Iowa</td><td>MF20</td><td>Anticorpo monoclonale</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra anti-topo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequenza 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 Sistema di rivestimento catodico</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>Condizioni di rivestimento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sec</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 Lettore di lastre</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

legame covalente di bmp-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato monolayer approccio

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Proteina morfogenetica 2 (BMP-2) è un fattore di crescita incorporato nella matrice extracellulare del tessuto osseo. BMP-2 funge da innesco della differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e la formazione ossea novo de. L&#39;uso clinico di ricombinante umano BMP-2 (rhBMP-2) in combinazione con ponteggi ha sollevato controversie recenti, in base alla modalità di presentazione e l&#39;importo da erogare. Il protocollo qui presentato fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 per studi in vitro su cellule. Si descrive come formare un monostrato auto-assemblato composto da un linker eterobifunzionale, e mostriamo la successiva fase vincolante per ottenere l&#39;immobilizzazione covalente di rhBMP-2. Con questo approccio è possibile ottenere una presentazione sostenuta di BMP-2, pur mantenendo l&#39;attività biologica della proteina. Infatti, l&#39;immobilizzazione superficie di BMP-2 consente indagini mirate impedendo annunci aspecificheorption, riducendo la quantità di fattore di crescita e, in particolare, ostacolando rilascio incontrollato dalla superficie. Entrambi gli eventi di segnalazione a breve e lungo termine, innescato da BMP-2 si svolgono quando le cellule sono esposte a superfici che presentano covalentemente immobilizzato rhBMP-2, rendendo questo approccio adatto per studi in vitro sulle risposte cellulari ai BMP-2 stimolazione.

Nella nostra configurazione, l'oro è stato scelto come eccipiente in quanto fornisce un sistema biologicamente aspecifica ma chimicamente sintonizzabile. Inoltre, l'applicazione di monostrati auto-assemblaggio comporta molti vantaggi: SAM adsorbe spontaneamente tramite loro "testa-gruppi" a metalli e formare monostrati con pochi difetti, mentre i loro gruppi terminali funzionali possono essere ulteriormente modificati. Così prevedono la piattaforma per adattare le proprietà dell'interfaccia controllata in modo ancora al...

Noi descriviamo un metodo per realizzare immobilizzazione efficiente di BMP-2 sulle superfici. Il nostro approccio si basa sulla formazione di un monostrato auto-assemblato per realizzare il legame di BMP-2 attraverso i suoi residui amminici liberi covalente. Questo metodo è un utile strumento per studiare la segnalazione alla membrana cellulare.

Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di legare covalentemente due molecole di BMP alle superfici senza perdere la loro bioattività. Ciò si ottiene formando prima uno strato d'oro su un substrato mediante deposizione fisica da vapore. Il secondo passo è quello di creare un monostrato autoassemblato di mu NHSA bifunzionale NHS Thiol linker.Successivamente, RH BMP due è legato covalentemente al linker. Il passaggio finale consiste nel rimuovere i due BMP non legati mediante sonicazione. In definitiva, viene utilizzato un saggio di legame degli anticorpi per dimostrare il successo del legame di BMP 2 sulle superfici e l'attività biologica di BMP 2 legata alla superficie viene determinata nelle cellule analizzando la fosforilazione di SMA 1 5 8.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei fattori di crescita, ad esempio se il legame iniziale dei fattori di crescita ai loro recettori sulla superficie cellulare è sufficiente per innescare risposte di segnalazione. A dimostrare la procedura saranno due membri del mio laboratorio, Teresa Paul ed Elizabeth Schwab. Per iniziare questa procedura, pulire i vetrini coprioggetti con salviette d

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Chimica

Qui si mostrano come utilizzare Ligation analisi di prossimità (PLA), con una combinazione di anticorpi per visualizzare proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione nelle cellule fisso. Questa tecnica ci ha permesso di seguire l'accumulo nucleare di BMP endogene attivate effettore complessi e quantificare i loro livelli nel corso del tempo sotto BMP4 stimolazione.

Rilevazione di segnalazione Effettistica-Complessi valle di BMP4 utilizzo In situ PLA, una legatura di prossimità Assay

Viene presentato un protocollo per accoppiare covalentemente una grande varietà di singole molecole su una punta AFM. Vengono fornite procedure ed esempi per determinare la forza di adesione e l'energia libera di queste molecole su supporti solidi e bio-interfacce.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Descriviamo la fabbricazione e la caratterizzazione di sistemi nanobiologici che interfacciano substrati nanostrutturati con proteine immobilizzate e aptameri. Vengono riportate le fasi sperimentali rilevanti che coinvolgono la fabbricazione litografica di substrati nanostrutturati, la biofunzionalizzazione e la caratterizzazione della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS). È stata dimostrata la rilevazione SERS di proteine immobilizzate in superficie e il sondaggio del legame...

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Rilevamento di Biomolecole Utilizzando EBL manufatti nanostrutturati Substrati

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Biomateriali drogati con Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) sono stati utilizzati come una nuova strategia terapeutica per guarire fratture ossee non sindacale. Per superare gli effetti collaterali derivanti da un'incontrollabile rilascio del fattore, vi proponiamo una nuova strategia per sito-direttamente immobilizzare il fattore, creando così materiali con migliorate capacità osteogeniche.

Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

L'attaccamento covalente delle molecole della sonda alle punte a sbalzo a forza atomica (AFM) è una tecnica essenziale per lo studio delle loro proprietà fisiche. Questo ci permette di determinare la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza dei polimeri tramite la spettroscopia a forza singola a singola molecola basata su AFM con elevata riproducibilità.

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.

Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana

Quando le proteine precursori della famiglia Transforming Growth Factor ß sono espresse ectopicamente negli embrioni di Xenopus laevis, si dimerizzano, si scindono e vengono secrete nel blastocoele, che inizia nella blastula tardiva fino allo stadio iniziale di gastrula. Descriviamo un metodo per aspirare i prodotti di scissione dalla cavità del blastocoele per l'analisi immunoblot.

Analisi dei prodotti di scissione della famiglia Transforming Growth Factor ß secreti nel blastocoelo di embrioni di Xenopus laevis

Un modello in vitro della nicchia vascolare del midollo osseo viene stabilito seminando cellule mesenchimali ed endoteliali su idrogel PEG 3D prefabbricati. Le reti endoteliali, i componenti della ECM e l'attività ALP delle nicchie variano a seconda del fattore di crescita utilizzato. La piattaforma può essere utilizzata per modelli avanzati di cancro.

Semplice creazione di una nicchia vascolarizzata del midollo osseo osteogenico utilizzando idrogel prefabbricati di poli(glicole etilenico) (PEG) in una micropiastra di imaging

Viene fornito un protocollo per la sintesi e la caratterizzazione di monostrati di strutture metallo-organiche autoassemblate utilizzando cristalli di struttura metallo-organica (MOF) innestati in polimero. La procedura mostra che le particelle MOF innestate con polimero possono essere auto-assemblate in un'interfaccia aria-acqua, dando luogo a strutture monostrato ben formate, autoportanti, come evidenziato dall'imaging al microscopio elettronico a scansione.

Sintesi e caratterizzazione di monostrati di strutture metallo-organiche autoassemblate utilizzando particelle rivestite di polimero

Scopri l'immobilizzazione covalente di BMP-2 su superfici mediante monostrato auto-assemblato per studiare la segnalazione cellulare. Questo metodo preserva la bioattività della proteina per analisi di biologia cellulare.

Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio

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