Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di legare covalentemente due molecole di BMP alle superfici senza perdere la loro bioattività. Ciò si ottiene formando prima uno strato d'oro su un substrato mediante deposizione fisica da vapore. Il secondo passo è quello di creare un monostrato autoassemblato di mu NHSA bifunzionale NHS Thiol linker.

Successivamente, RH BMP due è legato covalentemente al linker. Il passaggio finale consiste nel rimuovere i due BMP non legati mediante sonicazione. In definitiva, viene utilizzato un saggio di legame degli anticorpi per dimostrare il successo del legame di BMP 2 sulle superfici e l'attività biologica di BMP 2 legata alla superficie viene determinata nelle cellule analizzando la fosforilazione di SMA 1 5 8.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei fattori di crescita, ad esempio se il legame iniziale dei fattori di crescita ai loro recettori sulla superficie cellulare è sufficiente per innescare risposte di segnalazione. A dimostrare la procedura saranno due membri del mio laboratorio, Teresa Paul ed Elizabeth Schwab. Per iniziare questa procedura, pulire i vetrini coprioggetti con salviette di precisione e sonicarli per cinque minuti in una miscela uno a uno di acetato di etile e metanolo.

Dopo la sonicazione, sciacquare i substrati con metanolo e asciugarli sotto il flusso di azoto. Posizionare i substrati puliti in un dispositivo di rivestimento sputter ed evacuare la camera. Rimuovere lo strato di ossido di cromo più in alto dal bersaglio di cromo polverizzando per 60 secondi.

Quindi rivestire il substrato con uno strato di cromo a 10 nanometri seguito da un rivestimento con uno strato d'oro a 40 nanometri. Al termine, rimuovere i substrati d'oro dalla camera e metterli da parte. Trasferire i substrati d'oro in un pallone a fondo tondo a due colli e incubarli in un millimolare M-U-N-H-S in DMF a temperatura ambiente per quattro ore in atmosfera di azoto.

Dopo l'incubazione, sonicare i substrati in DMF per due minuti. Sciacquateli con DMF e metanolo e asciugateli sotto il flusso di azoto. Diluire la soluzione madre RHB MP two con un molare di cloruro di sodio in PBS per ottenere una concentrazione finale di 3,5 microgrammi per millilitro.

Regolare questa soluzione di lavoro a pH 8,5 con idrossido di potassio sterile da 10 millimolari immediatamente prima dell'uso. Posizionare l'anello A-P-D-M-S sopra il campione. Trasferire il substrato in una piastra a sei pozzetti per assicurarsi che solo le superfici del substrato siano esposte alla soluzione di incubazione.

Quindi incubare i substrati M-U-N-H-S funzionalizzati con la soluzione di lavoro RHB MP two a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver rimosso il surnatante di incubazione, aggiungere un molare di cloruro di sodio in PBS e sonicare i substrati per due minuti. Al termine, lavare i substrati tre volte con cloruro di sodio sterile di un molare in PBS per bloccare l'assorbimento aspecifico dell'anticorpo.

Incubare i substrati in 5%BSA in PBS per un'ora a temperatura ambiente. Quindi incubare i substrati con una soluzione di due anticorpi anti BMP per un'ora a temperatura ambiente al termine, lavare i substrati due volte con PBS e sonicarli per 30 secondi. Successivamente, incubare i substrati in una soluzione di anticorpi secondari coniugati HRP per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi lavarli due volte con PBS.

Utilizzare il test del rosso antinfluenzale per misurare l'attività enzimatica dell'HRP a 570 nanometri con un lettore di piastre che semina una volta 10 alla quinta bocca C due mioblasti C 12 per pozzetto in piastre a sei pozzetti in terreno di crescita e incubarli per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Una volta che le piastre sono state rimosse dall'incubatore, aspirare il terreno dai pozzetti e far morire di fame le cellule in DMEM privo di siero per tre-cinque ore prima di seminare sulle due superfici del substrato BMP funzionalizzate per lo studio dell'induzione del segnale a breve termine. Sostituire il terreno con 200 microlitri di DMEM fresco privo di siero e posizionare il BMP immobilizzato due substrati sopra le cellule utilizzando una pinzetta a punta fine dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Rimuovere delicatamente i substrati e aspirare il terreno con una pipetta. Quindi lavare le cellule due volte con PBS e procedere all'analisi delle risposte cellulari utilizzando l'elettroforesi su gel e il western blotting per l'analisi dell'attività biologica a lungo termine. Placcare le cellule sulle superfici come descritto in precedenza e coltivarle a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 in 2% FBS per sei giorni.

Dopo l'incubazione. Imaging delle cellule mediante microscopia a fluorescenza per verificare RH BMP, due superfici di legame che presentano RH BMP immobilizzato, due sono state incubate con un anticorpo specifico BMP, due e un anticorpo secondario coniugato con HRP. L'RH BMP due immobilizzato in superficie o I BMP due è stato rilevato prima e dopo la stimolazione cellulare.

Qui è mostrato il successo del legame di RH BMP due alla superficie in una conferma riconosciuta dall'anti BMP due IgG. L'RH BMP 2 immobilizzato in superficie è stato quantificato utilizzando il saggio metrico della cole rossa dell'influenza amli e i dati mostrano che dopo la stimolazione cellulare, la proteina è stata ancora rilevata sulle risposte cellulari di superficie alle superfici che presentano RHB MP immobilizzato, sono state valutate e confrontate con l'effetto di substrati d'oro non trattati. Qui, le cellule C due C 12 sono state stimolate per 30 minuti da RHB MP due superfici funzionalizzate che si avvicinano dall'alto.

In questo modello, BMP 2 inibisce la differenziazione delle cellule in miotubi multinucleati e induce fenotipi di osteoblasti. L'attivazione di SMAD 1, 5, 8, che sono reporter a valle della via di segnalazione BMP 2 è analizzata mediante western blotting, come mostrato qui. La fosforilazione di SM si osserva dopo 30 minuti di stimolazione con I BMP due, mentre non si verifica fosforilazione di SMAD 1 58 nelle cellule esposte a campioni di oro non trattati.

Questo risultato indica che il processo di immobilizzazione non altera l'attività a breve termine di BMP 2 e innesca le prime fasi della segnalazione smad per determinare se I BM P 2 influenza la differenziazione osteogenica a lungo termine. Il livello di espressione della fosfatasi alcalina è stato studiato mediante un saggio di metrica cole. L'attività della fosfatasi alcalina delle cellule C 2 C 12 è stata misurata dopo aver incubato le cellule per sei giorni su oro semplice e su due superfici IBP.

L'attività della fosfatasi alcalina nei lisati di cellule coltivate su superfici I BM P due ha mostrato un assorbimento significativamente più elevato rispetto al controllo. Questo risultato rivela che l'IBMP 2 induce l'espressione della fosfatasi alcalina nelle cellule C 2 C 12 per studiare l'effetto dell'IBP 2. Alla miogenesi C, due cellule C 12 sono state piastrate direttamente su oro o su superfici funzionalizzate e coltivate in condizioni di basso siero.

Dopo sei giorni, è stata eseguita la colorazione della catena pesante della miosina come mostrato qui. C, due cellule C 12 non sono riuscite a formare miosina a catena pesante miosina in presenza di I, BM, P due, a differenza delle cellule su substrati d'oro. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immobilizzazione di BMP due su nanoparticelle d'oro per rispondere a ulteriori domande.

Ad esempio, la quantità di BMP 2 immobilizzata è localmente necessaria per innescare in modo efficiente le risposte di segnalazione.