Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana
November 20th, 2021
Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.
Questo video descrive le procedure dettagliate sull'utilizzo della sonda a forza biomembrana o BFP per misurare la costante molecolare della molla. Nella sonda di forza, la BFP è recentemente emersa nella superficie cellulare nativa o nell'analisi SITU Dynamic Force Spectroscopy. Lo scopo principale di questa tecnica è quello di misurare la genetica di legame a singola molecola.
Questa procedura di analisi dei dati è un messaggio semplice ma potente e fornisce informazioni meccaniche, in particolare la forza dinamica e l'infiammazione della membrana cellulare che esprime molecole. Durante il ciclo dell'esperimento BFP, la scommessa del microbioma della sonda con il globuli rosso e la successione, la cellula bersaglio e il legame molecolare del recettore del ligando tra la sonda e il bersaglio possono essere considerati come un sistema cerebrale collegato in serie. In base alla legge di Hooke, il reciproco della costante totale della molla di un sistema di molle connesse in serie è uguale alla somma della costante di molla inversa di ogni singolo componente, come mostra l'equazione.
La costante di molla dei globuli rossi viene calcolata in base al movimento degli eventi, che dipende dal radiale della micropipetta della sonda nell'orifizio. Il globuli rossi, l'area di contatto circolare tra il globuli rosso e la successione e la micro-pipetta aspirando la pressione. I dati stradali BFP sono ottenuti da uno strumento virtuale di visione sinistra fatto in casa, che controlla il movimento della micro-pipetta target da un traduttore di VA.
Un ciclo tattile PFP completo è composto da cinque fasi. Approach.Impinge.Contact. Ritrarre e dissociarsi. All'inizio, sottolinea che la posizione robusto APICS è indicata come X uguale a 0 in deshine nero.
Il bersaglio viene quindi guidato da un pezzo o da un traduttore per impattire e comprimere il robusto per causare un movimento di successione negativo. Lo noti come X più piccolo di zero nella linea del trattino rosso. Nella fase di retrazione, l'apice del busto rosso si sposta dalla posizione X più piccola di zero alla posizione X uguale a zero denominata fase di compressione.
Se si forma un legame tra il complesso molecolare del recettore del ligando, il globuli rosso sarebbe ulteriormente diverso da un'altra direzione positiva. Questo periodo X maggiore di zero è indicato come la fase di trazione dello stadio di retrazione. Lo stadio di retrazione è la parte più critica per determinare la costante di molla della molecola di legame.
Raccogli i dati stradali forza/tempo utilizzando la piattaforma di acquisizione dati BSP. Ogni esperimento di solito registra da 50 a 200 cicli di tocco, apri il software di analisi dei dati PFP. Fare clic sull'icona della cartella gialla e selezionare il file di dati della riga corrispondente facendo doppio clic su di essi.
Siamo nel programma. Quindi fare clic sui pulsanti freccia su e giù per passare da un evento all'altro. Utilizzo dei criteri di esclusione anomala per escludere eventi non validi.
Selezionare il tipo di dati di esportazione forzato al formato temporale e scegliere l'intervallo di tempo di stato appropriato. Fare clic sul pulsante Esporta dati di plottaggio. I dati esportati vengono salvati come file di testo per impostazione predefinita.
Questo file di testo contiene due colonne di dati. È la prima colonna che rappresenta i papà del tempo e la seconda colonna che rappresenta la forza corrispondente in ogni punto temporale. Traccia la curva di forza rispetto a quella temporale utilizzando un software di fogli di calcolo per ottenere la curva forzata rispetto a quella di spostamento.
Moltiplicare il valore temporale di ciascun punto dati per il movimento PSO Willow Steel. Azzerare il primo punto dati sottraendo il valore di spostamento più piccolo da ciascun punto dati. Questa trasformazione orizzontale non influisce sul successivo calcolo della costante di molla.
Nella curva forza contro spostamento, due gruppi distinti di attori erano diversi se si può identificare la nuova pendenza della forza. Ognuno rappresenta la fase compressiva e la fase di stile 10. Adatta una linea di regressione a ciascun gruppo di dati.
La linea con pendenza più ripida rappresenta la costante totale della molla in una fase del compressore indicata come K1. E la linea che era la parte superiore più piccola rappresenta la linea in questa fase di stile 10 indicata come K2.As ho menzionato, la costante totale della molla è il reciproco del figlio della costante di molla di serie di ciascun componente. Durante la fase di compressione del battito in modalità cellulare, il legame molecolare non viene allungato, quindi la costante della molla di legame molecolare non viene presa in considerazione. La costante della molla della cella target è descritta come l'equazione visualizzata dove K1 rappresenta la costante totale della molla durante la fase del compressore.
Nella fase di stile 10 della modalità beat to sell, la costante totale della primavera è il sole della costante della molla uverse del legame molecolare dei globuli rossi. E la cellula bersaglio, usa l'equazione visualizzata per calcolare la costante della molla di legame del moleculer, che K2 rappresenta la costante totale della molla. Si legge la fase di 10 stop.
Nella modalità beat to beat, poiché la deformazione B è trascurabile, il termine che descrive l'inverso della costante della molla della cella target si avvicina allo zero, quindi la costante totale della molla nella fase del compressore è equivalente alla costante della molla dei globuli rossi che mostra come la seguente equazione. Nella fase di trazione, la costante di molla del legame molecolare può essere calcolata sottraendo l'effetto del globuli rossi mostrando come seguente equazione. Raccogliere le costanti di molla del side-wind integrando l'assetto B, il complesso Beta 3, la cella K562 e la Febrifugina integrando l'atteggiamento B Beta tre complessi, calcolare la deviazione media e standard delle costanti di molla derivate su scala Newton o nanometri.
Ora dovresti avere una migliore comprensione di quali sono i requisiti per la misurazione e la costante di molla dai dati VFD. Le differenze tra la modalità beat to cell e la modalità beat to beat dovrebbero essere notate. Diverse molecole che presentano il servizio avranno difese diverse per la misura della costante di molla.
In conclusione, questa procedura passo-passo descrive come eseguire l'analisi costante della molla molecolare utilizzando la BFP. Prevediamo che saranno fatti sforzi futuri per automatizzare e integrare l'acquisizione dei dati BFP e l'analisi DFS in un unico programma di riposo per computer. Rendere l'intera analisi dei dati operativi BFP più facile da usare e alta in tutto.
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Panoramica
Il Biomembrane Force Probe (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari su cellule vive. Questo protocollo delinea l'analisi delle costanti di molla per i legami molecolari rilevati da BFP.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Spettroscopia di forza dinamica
- Interazioni molecolari
- Meccanica della membrana cellulare
Sfondo
- La tecnica BFP misura il legame di singola molecola.
- Fornisce informazioni meccaniche sulle membrane cellulari.
- L'analisi si basa sulla legge di Hooke.
- Comporta interazioni tra sonde e cellule bersaglio.
Obiettivo dello studio
- Misurare le costanti di molla molecolari.
- Analizzare le dinamiche di legame molecolare.
- Migliorare la comprensione delle interazioni della membrana cellulare.
Metodi utilizzati
- Utilizzo del Biomembrane Force Probe (BFP).
- Analisi della spettroscopia di forza dinamica in situ.
- Analisi dei dati delle interazioni molecolari.
- Applicazione della legge di Hooke per il calcolo della costante di molla.
Risultati principali
- Misurazione con successo delle costanti di molla molecolari.
- Approfondimenti sulla dinamica del legame molecolare.
- Dimostrazione dell'efficacia del BFP nell'analisi di cellule vive.
- Validazione dei modelli teorici attraverso dati sperimentali.
Conclusioni
- Il BFP è uno strumento potente per studiare le interazioni molecolari.
- La tecnica migliora la nostra comprensione della meccanica cellulare.
- Le applicazioni future potrebbero includere studi biologici più ampi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Measuring molecular spring constants via biomembrane force probe spectroscopy provides quantitative mechanical insights into ligand-receptor interactions, supporting target validation by characterizing bond stability and conformational dynamics. This approach enables mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular mechanics to functional signaling, informing go/no-go decisions before compound screening. The method enhances predictive confidence in target selection by revealing force-dependent binding behaviors that correlate with physiological mechanosensing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying bond stiffness and rupture forces under physiological loading rates.
- Operational Value: Enables direct comparison of molecular variants or mutants to identify stabilizing mutations that prolong bond lifetime.
- Scientific Value: Clarifies force-dependent conformational changes in receptors, supporting allosteric mechanism validation.
- Operational Value: Provides benchmark data for structure-guided design of therapeutics with optimized mechanical resilience.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-displacement curves that serve as orthogonal readouts for binding affinity in assay triage.
- Operational Value: Standardizes spring constant measurements across replicates using outlier exclusion criteria and regression fitting.
- Scientific Value: Distinguishes specific from nonspecific interactions based on tensile phase slope characteristics in bead-bead mode.
- Operational Value: Enables high-throughput collection of 50-200 touch cycles per experiment for robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular spring constants to cellular mechanosensing outputs, informing pathophysiological relevance in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from purified systems to native cell surfaces via bead-cell and bead-bead modes.
- Scientific Value: Measures cell contribution to total spring constant, deconvolving target-specific molecular mechanics from probe or cell artifacts.
- Operational Value: Facilitates cross-platform comparison of molecular mechanics using standardized Hooke's law-based analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanical phenotyping of targets after initial binding confirmation but before large-scale screening, helping prioritize targets with favorable force-stability profiles.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring how molecular bonds respond to mechanical perturbation, revealing catch-bond or slip-bond behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spring constant outputs that enable rank-ordering of ligand variants or therapeutic candidates.
- Analytics: Employs linear regression on force-displacement data to derive spring constants (K1, K2) from compressive and tensile phases, enabling condition comparison.
- Translational Research: Links molecular mechanics to cell-scale responses by measuring target cell contribution in bead-cell mode, supporting mechanistic continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nanotool for mechanical phenotyping across diverse receptor-ligand systems, reducing revalidation effort in follow-up campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, quantitative measures of bond elasticity and force-dependent kinetics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized data acquisition, outlier filtering, and exportable force-time datasets for external validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying mechanically fragile targets early, reducing investment in high-risk pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on bond stability metrics, complementing traditional affinity and selectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dynamic force spectroscopy, micropipette manipulation, and force calibration using red blood cell standards.
- Depends on custom-built BFP setup with piezoelectric translators and homemade virtual instrumentation for precise displacement control.
- Necessitates cross-team standardization of outlier criteria, time-range selection, and regression fitting protocols across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-cell to bead-bead mode to isolate molecular contributions from cellular mechanics.
- Limited by the need for stable molecular tethering and functional ligand-receptor expression on probe or target surfaces to avoid artifactual signals.
