Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana
20 novembre 2021
Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.
Questo video descrive le procedure dettagliate sull'utilizzo della sonda a forza biomembrana o BFP per misurare la costante molecolare della molla. Nella sonda di forza, la BFP è recentemente emersa nella superficie cellulare nativa o nell'analisi SITU Dynamic Force Spectroscopy. Lo scopo principale di questa tecnica è quello di misurare la genetica di legame a singola molecola.
Questa procedura di analisi dei dati è un messaggio semplice ma potente e fornisce informazioni meccaniche, in particolare la forza dinamica e l'infiammazione della membrana cellulare che esprime molecole. Durante il ciclo dell'esperimento BFP, la scommessa del microbioma della sonda con il globuli rosso e la successione, la cellula bersaglio e il legame molecolare del recettore del ligando tra la sonda e il bersaglio possono essere considerati come un sistema cerebrale collegato in serie. In base alla legge di Hooke, il reciproco della costante totale della molla di un sistema di molle connesse in serie è uguale alla somma della costante di molla inversa di ogni singolo componente, come mostra l'equazione.
La costante di molla dei globuli rossi viene calcolata in base al movimento degli eventi, che dipende dal radiale della micropipetta della sonda nell'orifizio. Il globuli rossi, l'area di contatto circolare tra il globuli rosso e la successione e la micro-pipetta aspirando la pressione. I dati stradali BFP sono ottenuti da uno strumento virtuale di visione sinistra fatto in casa, che controlla il movimento della micro-pipetta target da un traduttore di VA.
Un ciclo tattile PFP completo è composto da cinque fasi. Approach.Impinge.Contact. Ritrarre e dissociarsi. All'inizio, sottolinea che la posizione robusto APICS è indicata come X uguale a 0 in deshine nero.
Il bersaglio viene quindi guidato da un pezzo o da un traduttore per impattire e comprimere il robusto per causare un movimento di successione negativo. Lo noti come X più piccolo di zero nella linea del trattino rosso. Nella fase di retrazione, l'apice del busto rosso si sposta dalla posizione X più piccola di zero alla posizione X uguale a zero denominata fase di compressione.
Se si forma un legame tra il complesso molecolare del recettore del ligando, il globuli rosso sarebbe ulteriormente diverso da un'altra direzione positiva. Questo periodo X maggiore di zero è indicato come la fase di trazione dello stadio di retrazione. Lo stadio di retrazione è la parte più critica per determinare la costante di molla della molecola di legame.
Raccogli i dati stradali forza/tempo utilizzando la piattaforma di acquisizione dati BSP. Ogni esperimento di solito registra da 50 a 200 cicli di tocco, apri il software di analisi dei dati PFP. Fare clic sull'icona della cartella gialla e selezionare il file di dati della riga corrispondente facendo doppio clic su di essi.
Siamo nel programma. Quindi fare clic sui pulsanti freccia su e giù per passare da un evento all'altro. Utilizzo dei criteri di esclusione anomala per escludere eventi non validi.
Selezionare il tipo di dati di esportazione forzato al formato temporale e scegliere l'intervallo di tempo di stato appropriato. Fare clic sul pulsante Esporta dati di plottaggio. I dati esportati vengono salvati come file di testo per impostazione predefinita.
Questo file di testo contiene due colonne di dati. È la prima colonna che rappresenta i papà del tempo e la seconda colonna che rappresenta la forza corrispondente in ogni punto temporale. Traccia la curva di forza rispetto a quella temporale utilizzando un software di fogli di calcolo per ottenere la curva forzata rispetto a quella di spostamento.
Moltiplicare il valore temporale di ciascun punto dati per il movimento PSO Willow Steel. Azzerare il primo punto dati sottraendo il valore di spostamento più piccolo da ciascun punto dati. Questa trasformazione orizzontale non influisce sul successivo calcolo della costante di molla.
Nella curva forza contro spostamento, due gruppi distinti di attori erano diversi se si può identificare la nuova pendenza della forza. Ognuno rappresenta la fase compressiva e la fase di stile 10. Adatta una linea di regressione a ciascun gruppo di dati.
La linea con pendenza più ripida rappresenta la costante totale della molla in una fase del compressore indicata come K1. E la linea che era la parte superiore più piccola rappresenta la linea in questa fase di stile 10 indicata come K2.As ho menzionato, la costante totale della molla è il reciproco del figlio della costante di molla di serie di ciascun componente. Durante la fase di compressione del battito in modalità cellulare, il legame molecolare non viene allungato, quindi la costante della molla di legame molecolare non viene presa in considerazione. La costante della molla della cella target è descritta come l'equazione visualizzata dove K1 rappresenta la costante totale della molla durante la fase del compressore.
Nella fase di stile 10 della modalità beat to sell, la costante totale della primavera è il sole della costante della molla uverse del legame molecolare dei globuli rossi. E la cellula bersaglio, usa l'equazione visualizzata per calcolare la costante della molla di legame del moleculer, che K2 rappresenta la costante totale della molla. Si legge la fase di 10 stop.
Nella modalità beat to beat, poiché la deformazione B è trascurabile, il termine che descrive l'inverso della costante della molla della cella target si avvicina allo zero, quindi la costante totale della molla nella fase del compressore è equivalente alla costante della molla dei globuli rossi che mostra come la seguente equazione. Nella fase di trazione, la costante di molla del legame molecolare può essere calcolata sottraendo l'effetto del globuli rossi mostrando come seguente equazione. Raccogliere le costanti di molla del side-wind integrando l'assetto B, il complesso Beta 3, la cella K562 e la Febrifugina integrando l'atteggiamento B Beta tre complessi, calcolare la deviazione media e standard delle costanti di molla derivate su scala Newton o nanometri.
Ora dovresti avere una migliore comprensione di quali sono i requisiti per la misurazione e la costante di molla dai dati VFD. Le differenze tra la modalità beat to cell e la modalità beat to beat dovrebbero essere notate. Diverse molecole che presentano il servizio avranno difese diverse per la misura della costante di molla.
In conclusione, questa procedura passo-passo descrive come eseguire l'analisi costante della molla molecolare utilizzando la BFP. Prevediamo che saranno fatti sforzi futuri per automatizzare e integrare l'acquisizione dei dati BFP e l'analisi DFS in un unico programma di riposo per computer. Rendere l'intera analisi dei dati operativi BFP più facile da usare e alta in tutto.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
La sonda di forza per biomembrane (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica utilizzata per misurare la costante elastica delle interazioni molecolari su cellule vive. Questo protocollo descrive l'analisi delle costanti elastiche dei legami molecolari rilevati mediante BFP.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Spettroscopia dinamica delle forze
- Interazioni molecolari
- Meccanica della membrana cellulare
Sfondo
- La tecnica BFP misura il legame di singole molecole.
- Fornisce informazioni meccaniche sulle membrane cellulari.
- L'analisi si basa sulla legge di Hooke.
- Comprende interazioni tra sonde e cellule bersaglio.
Scopo dello studio
- Misurare le costanti elastiche molecolari.
- Analizzare la dinamica del legame molecolare.
- Migliorare la comprensione delle interazioni della membrana cellulare.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo della sonda di forza a biomembrana (BFP).
- Analisi spettroscopica di forza dinamica in situ.
- Analisi dei dati sulle interazioni molecolari.
- Applicazione della legge di Hooke per il calcolo della costante elastica.
Risultati principali
- Misurazione riuscita delle costanti elastiche molecolari.
- Informazioni sulle dinamiche del legame molecolare.
- Dimostrazione dell'efficacia della BFP nell'analisi di cellule vive.
- Convalida di modelli teorici mediante dati sperimentali.
Conclusioni
- BFP è uno strumento potente per lo studio delle interazioni molecolari.
- La tecnica migliora la nostra comprensione della meccanica cellulare.
- Applicazioni future potrebbero includere studi biologici più ampi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione delle costanti elastiche molecolari mediante spettroscopia con sonda di forza basata su biomembrane fornisce informazioni quantitative di tipo meccanico sulle interazioni ligando-recettore, supportando la validazione degli obiettivi attraverso la caratterizzazione della stabilità del legame e della dinamica conformazionale. Questo approccio consente una riduzione del rischio di natura meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta, collegando la meccanica molecolare alla segnalazione funzionale e fornendo indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione prima dello screening dei composti. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi rivelando comportamenti di legame dipendenti dalla forza che si correlano con le vie fisiologiche di meccanosensazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando la rigidità del legame e le forze di rottura a velocità fisiologiche di applicazione del carico.
- Valore operativo: Consente il confronto diretto tra varianti molecolari o mutanti per identificare mutazioni stabilizzanti che prolungano la durata del legame.
- Valore scientifico: Chiarisce le variazioni conformazionali dipendenti dalla forza nei recettori, supportando la validazione di meccanismi alosterici.
- Valore operativo: Fornisce dati di riferimento per la progettazione strutturale di terapie con resistenza meccanica ottimizzata.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera curve forza-spostamento che fungono da letture ortogonali per l'affinità di legame nella selezione degli saggi.
- Valore operativo: Standardizza le misurazioni della costante elastica tra i replicati utilizzando criteri di esclusione degli outlier e analisi di regressione.
- Valore scientifico: Distingue interazioni specifiche da quelle non specifiche in base alle caratteristiche della pendenza nella fase di trazione in modalità bead-bead.
- Valore operativo: Consente la raccolta ad alto rendimento di 50-200 cicli di contatto per esperimento, per un'analisi statistica robusta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le costanti elastiche molecolari agli output del meccanosensing cellulare, fornendo informazioni sulla rilevanza fisiopatologica in modelli di malattia.
- Valore operativo: Permette la continuità tra sistemi purificati e superfici cellulari native mediante modalità bead-cellula e bead-bead.
- Valore scientifico: Misura il contributo cellulare alla costante elastica totale, separando la meccanica molecolare specifica per il bersaglio dagli artefatti del sonda o della cellula.
- Valore operativo: Facilita il confronto intersperimentale della meccanica molecolare utilizzando un'analisi standardizzata basata sulla legge di Hooke.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della scoperta precoce fornendo un fenotipaggio meccanico dei bersagli dopo la conferma iniziale del legame ma prima dello screening su larga scala, aiutando a prioritizzare i bersagli con profili di stabilità meccanica favorevoli.
- Biologia della scoperta: Verifica l'ipotesi sul bersaglio misurando come i legami molecolari rispondono a perturbazioni meccaniche, rivelando un comportamento da legame di tipo catch o slip.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili della costante elastica che permettono di ordinare gerarchicamente varianti di ligandi o candidati terapeutici.
- Analisi: Applica una regressione lineare ai dati di forza-spostamento per ricavare le costanti elastiche (K1, K2) dalle fasi compressive e di trazione, consentendo il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la meccanica molecolare alle risposte su scala cellulare misurando il contributo della cellula bersaglio in modalità bead-cell, supportando la continuità meccanicistica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce uno strumento nanometrico riutilizzabile per la fenotipizzazione meccanica in diversi sistemi recettore-ligando, riducendo lo sforzo di rivalidazione nelle campagne successive.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo misure dirette e quantitative dell'elasticità del legame e della cinetica dipendente dalla forza.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso l'acquisizione standardizzata dei dati, il filtraggio degli outlier e set di dati di forza-tempo esportabili per la validazione esterna.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando precocemente i bersagli meccanicamente fragili, riducendo gli investimenti in percorsi ad alto rischio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli corretta in base al rischio, basandosi su metriche di stabilità del legame, integrando i dati tradizionali di affinità e selettività.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in spettroscopia di forza dinamica, manipolazione con micropipetta e calibrazione della forza mediante standard di globuli rossi.
- Si basa su un apparato BFP su misura dotato di traslatori piezoelettrici e strumentazione virtuale autocostruita per un controllo preciso dello spostamento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i criteri di esclusione degli outlier, la selezione degli intervalli temporali e i protocolli di fitting di regressione in diversi siti.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio dalla modalità bead-cell a quella bead-bead per isolare il contributo molecolare dalla meccanica cellulare.
- È limitato dalla necessità di un ancoraggio molecolare stabile e di un'espressione funzionale di ligandi e recettori sulle superfici del sonda o del bersaglio, al fine di evitare segnali artefatti.
