Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana

Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.

Questo video descrive le procedure dettagliate sull'utilizzo della sonda a forza biomembrana o BFP per misurare la costante molecolare della molla. Nella sonda di forza, la BFP è recentemente emersa nella superficie cellulare nativa o nell'analisi SITU Dynamic Force Spectroscopy. Lo scopo principale di questa tecnica è quello di misurare la genetica di legame a singola molecola.

Questa procedura di analisi dei dati è un messaggio semplice ma potente e fornisce informazioni meccaniche, in particolare la forza dinamica e l'infiammazione della membrana cellulare che esprime molecole. Durante il ciclo dell'esperimento BFP, la scommessa del microbioma della sonda con il globuli rosso e la successione, la cellula bersaglio e il legame molecolare del recettore del ligando tra la sonda e il bersaglio possono essere considerati come un sistema cerebrale collegato in serie. In base alla legge di Hooke, il reciproco della costante totale della molla di un sistema di molle connesse in serie è uguale alla somma della costante di molla inversa di ogni singolo componente, come mostra l'equazione.

La costante di molla dei globuli rossi viene calcolata in base al movimento degli eventi, che dipende dal radiale della micropipetta della sonda nell'orifizio. Il globuli rossi, l'area di contatto circolare tra il globuli rosso e la successione e la micro-pipetta aspirando la pressione. I dati stradali BFP sono ottenuti da uno strumento virtuale di visione sinistra fatto in casa, che controlla il movimento della micro-pipetta target da un traduttore di VA.

Un ciclo tattile PFP completo è composto da cinque fasi. Approach.Impinge.Contact. Ritrarre e dissociarsi. All'inizio, sottolinea che la posizione robusto APICS è indicata come X uguale a 0 in deshine nero.

Il bersaglio viene quindi guidato da un pezzo o da un traduttore per impattire e comprimere il robusto per causare un movimento di successione negativo. Lo noti come X più piccolo di zero nella linea del trattino rosso. Nella fase di retrazione, l'apice del busto rosso si sposta dalla posizione X più piccola di zero alla posizione X uguale a zero denominata fase di compressione.

Se si forma un legame tra il complesso molecolare del recettore del ligando, il globuli rosso sarebbe ulteriormente diverso da un'altra direzione positiva. Questo periodo X maggiore di zero è indicato come la fase di trazione dello stadio di retrazione. Lo stadio di retrazione è la parte più critica per determinare la costante di molla della molecola di legame.

Raccogli i dati stradali forza/tempo utilizzando la piattaforma di acquisizione dati BSP. Ogni esperimento di solito registra da 50 a 200 cicli di tocco, apri il software di analisi dei dati PFP. Fare clic sull'icona della cartella gialla e selezionare il file di dati della riga corrispondente facendo doppio clic su di essi.

Siamo nel programma. Quindi fare clic sui pulsanti freccia su e giù per passare da un evento all'altro. Utilizzo dei criteri di esclusione anomala per escludere eventi non validi.

Selezionare il tipo di dati di esportazione forzato al formato temporale e scegliere l'intervallo di tempo di stato appropriato. Fare clic sul pulsante Esporta dati di plottaggio. I dati esportati vengono salvati come file di testo per impostazione predefinita.

Questo file di testo contiene due colonne di dati. È la prima colonna che rappresenta i papà del tempo e la seconda colonna che rappresenta la forza corrispondente in ogni punto temporale. Traccia la curva di forza rispetto a quella temporale utilizzando un software di fogli di calcolo per ottenere la curva forzata rispetto a quella di spostamento.

Moltiplicare il valore temporale di ciascun punto dati per il movimento PSO Willow Steel. Azzerare il primo punto dati sottraendo il valore di spostamento più piccolo da ciascun punto dati. Questa trasformazione orizzontale non influisce sul successivo calcolo della costante di molla.

Nella curva forza contro spostamento, due gruppi distinti di attori erano diversi se si può identificare la nuova pendenza della forza. Ognuno rappresenta la fase compressiva e la fase di stile 10. Adatta una linea di regressione a ciascun gruppo di dati.

La linea con pendenza più ripida rappresenta la costante totale della molla in una fase del compressore indicata come K1. E la linea che era la parte superiore più piccola rappresenta la linea in questa fase di stile 10 indicata come K2.As ho menzionato, la costante totale della molla è il reciproco del figlio della costante di molla di serie di ciascun componente. Durante la fase di compressione del battito in modalità cellulare, il legame molecolare non viene allungato, quindi la costante della molla di legame molecolare non viene presa in considerazione. La costante della molla della cella target è descritta come l'equazione visualizzata dove K1 rappresenta la costante totale della molla durante la fase del compressore.

Nella fase di stile 10 della modalità beat to sell, la costante totale della primavera è il sole della costante della molla uverse del legame molecolare dei globuli rossi. E la cellula bersaglio, usa l'equazione visualizzata per calcolare la costante della molla di legame del moleculer, che K2 rappresenta la costante totale della molla. Si legge la fase di 10 stop.

Nella modalità beat to beat, poiché la deformazione B è trascurabile, il termine che descrive l'inverso della costante della molla della cella target si avvicina allo zero, quindi la costante totale della molla nella fase del compressore è equivalente alla costante della molla dei globuli rossi che mostra come la seguente equazione. Nella fase di trazione, la costante di molla del legame molecolare può essere calcolata sottraendo l'effetto del globuli rossi mostrando come seguente equazione. Raccogliere le costanti di molla del side-wind integrando l'assetto B, il complesso Beta 3, la cella K562 e la Febrifugina integrando l'atteggiamento B Beta tre complessi, calcolare la deviazione media e standard delle costanti di molla derivate su scala Newton o nanometri.

Ora dovresti avere una migliore comprensione di quali sono i requisiti per la misurazione e la costante di molla dai dati VFD. Le differenze tra la modalità beat to cell e la modalità beat to beat dovrebbero essere notate. Diverse molecole che presentano il servizio avranno difese diverse per la misura della costante di molla.

In conclusione, questa procedura passo-passo descrive come eseguire l'analisi costante della molla molecolare utilizzando la BFP. Prevediamo che saranno fatti sforzi futuri per automatizzare e integrare l'acquisizione dei dati BFP e l'analisi DFS in un unico programma di riposo per computer. Rendere l'intera analisi dei dati operativi BFP più facile da usare e alta in tutto.