Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottimizzare le superfici rivestite di polimero per preservare la coltura stabile a lungo termine di epatociti umani derivati da cellule staminali. Ciò si ottiene sintetizzando prima il poliuretano 1 3 4 o il PU 1 3 4. Il secondo passo è scegliere il solvente giusto per solubilizzare PU 1 34.

Successivamente, viene ottimizzato il processo di centrifugazione con il PU 1 3 4 sul vetrino coprioggetto. La fase finale è l'ottimizzazione della procedura di sterilizzazione dei vetrini di vetro rivestiti in polimero P 1 34, in ultima analisi, la microscopia elettronica a scansione, la microscopia a forza atomica e il metabolismo dei farmaci. I saggi vengono utilizzati per mostrare l'influenza del rivestimento polimerico PU 1 34 nella funzione degli epatociti derivati da cellule staminali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'uso di al Metrices in coltura per mantenere le cellule staminali URI potenti che hanno epatociti, è che questi materiali sintetici possono essere messi a punto per lo scopo e una scala s per standard di qualità garantiti. Inoltre, visualizzano la coerenza del bus del batch due. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie del fegato perché rappresenta un esempio di come la superficie di un polimero sintetico possa essere ottimizzata per preservare il fenotipo cellulare.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Jeffrey Walton, un postdoc del mio laboratorio Prima di iniziare questa procedura. Applicare il trattamento termico al glicole etilenico mono a sei esani e al glicole neo PenTile a 40 gradi Celsius per 48 ore in un forno sottovuoto. Per rimuovere l'acqua residua, aggiungere 22 millimoli di ciascun monomero e 55 millimoli di acido dpic a un pallone a fondo tondo a due colli collegato a un apparecchio dean stark e dotato di una barra di agitazione magnetica.

Successivamente, posizionare l'intero gruppo sotto vuoto e riscaldare delicatamente la vetreria a 40 gradi Celsius per sei ore per evitare qualsiasi assorbimento di umidità durante l'aggiunta della sostanza chimica al pallone. Dopo aver tolto il gruppo dal forno e aver posto il sistema sotto azoto, aggiungere 0,0055 moli del catalizzatore titanio quattro, ma ossido goccia a goccia con una siringa al pallone. Mescolare la miscela di reazione a 180 gradi Celsius per 24 ore, raccogliendo l'acqua residua nella trappola dean stark.

Lasciare raffreddare il prodotto a temperatura ambiente. Quindi mescolare 3,2 millimole, o un equivalente del poliolo P-H-N-G-A-G con 6,4 milli mole o due equivalenti di quattro quattro metile e un isocianato di bisfenolo. In 12 millilitri di DML anidro in un pallone a fondo tondo a due colli collegato a un apparato dean stark e dotato di una barra stella magnetica.

Mescolare la miscela di reazione a 70 gradi Celsius in un'atmosfera di azoto. Quindi aggiungere il catalizzatore di titanio quattro ossido goccia a goccia tramite siringa a una concentrazione finale dello 0,8%Dopo un'ora, aggiungere un equivalente dell'estensore della catena un quadrante a quattro butani per dare il prodotto copolimero. Aumenta la temperatura a 90 gradi Celsius e muori di fame per 24 ore in un'atmosfera di azoto.

Una volta che la miscela di reazione ha chiamato a temperatura ambiente un etere dal goccia a goccia verso la miscela di reazione fino a quando non si osserva la precipitazione del prodotto poliuretanico. Dopo aver trasferito la miscela di reazione in una provetta da centrifuga, centrifugare la soluzione a 5, 300 volte G per cinque minuti. Dopo la decantazione, il supinato si asciuga a temperatura ambiente fino a quando il solvente evapora.

Funziona successivamente pesare 200 milligrammi di PU 1 34 in una bottiglia di vetro. Diluire il campione fino a una concentrazione finale del 2% in cloroformio o cloroformio e toluene in rapporto uno a uno o tetraroran o una combinazione di tetra roran anti clorometano. In rapporto uno a uno, agitare energicamente la soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente utilizzando un agitatore alla velocità di 200 movimenti al minuto fino a quando la soluzione diventa omogenea e non si osserva alcun precipitato.

Al termine, posizionare un vetrino quadrato di circa 15 millimetri sulla centrifuga. Applicare 50 microlitri della soluzione di PU da uno a quattro sul vetrino coprioggetti utilizzando una pipetta, girare ogni vetrino coprioggetti per sette secondi a 23 volte G.Quindi asciugare il vetrino coprioggetti all'aria a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della sterilizzazione. A questo punto, irradiare con raggi gamma ogni vetrino coprioggetto rivestito in polimero applicando una dose di 10 grigi utilizzando un radiatore da laboratorio per 12 minuti.

In alternativa, irradiare UV ogni vetrino coprioggetto rivestito in polimero utilizzando una lampadina UV da 30 watt per 16 minuti su ciascun lato. Al termine, posizionare il vetrino coprioggetto rivestito in polimero in una piastra di coltura tissutale adatta in base alle dimensioni del vetrino. Dopo la coltura e la differenziazione, la linea di cellule staminali embrionali umane ha staccato le cellule utilizzando il reagente di dissociazione e le ha riprodotte sui vetrini di copertura rivestiti in PU 1 34 al nono giorno del processo di differenziazione in presenza di microscopia elettronica a scansione con terreno libero di siero.

Le immagini dei diversi vetrini di copertura rivestiti mostrano che il rivestimento con toluene o cloroformio non era omogeneo, dimostrando un rivestimento irregolare con precipitazione PE 1 34. Al contrario, il tetraedro ha permesso il rivestimento di rotazione di una superficie molto più uniforme. Inoltre, l'analisi al microscopio a forza atomica dei diversi rivestimenti polimerici mostra una riduzione del 40% della rugosità di P 1 34 solubilizzato in tetra idrofurina rispetto ad altri solventi, dimostrando un rivestimento PU 1 34 più uniforme è stata indotta una differenziazione dell'endoderma epatico per applicazioni biologiche e al nono giorno, erano evidenti cellule simili a blasti epato con la maggior parte delle cellule che esprimevano la proteina feta alfa citocheratina 19 e il fattore nucleare dell'epatocita per alfa e bassi livelli di albumina come misura della funzione metabolica.

La funzione del citocromo P 4 50 è stata valutata quattro giorni dopo il replating su diverse superfici rivestite di polimero. È stato osservato un aumento di due volte dell'attività metabolica nelle cellule ripiastrate su tetra hydro fure mpu 1 3 4 superfici rivestite. Questi risultati dimostrano che l'attività metabolica degli epatociti derivati da cellule staminali embrionali umane è migliorata con un rivestimento P 1 34 più uniforme L'imaging a contrasto non ha mostrato differenze grossolane dopo l'irradiazione UV o gamma, il che è stato ulteriormente confermato dall'analisi al microscopio elettronico a scansione.

epatociti derivati da cellule staminali embrionali umane ripiastrati su vetrini di vetro rivestiti in PU 1 34 irradiati con raggi gamma hanno mostrato un aumento di tre volte dell'attività del CYP tre a rispetto alle cellule ripiastrate su vetrini di vetro rivestiti in PU 1 34 irradiati con raggi UV. Queste osservazioni dimostrano che la radiazione gamma è la tecnica di sterilizzazione ottimale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare l'omogeneità del rivestimento tra i diversi CLO di spin coating e non dimenticare che lavorare con strumentazione a solventi chimici può essere estremamente pericoloso.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre applicazioni come indossare occhiali di sicurezza.