Name: Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri come ottimizzare superfici rivestite in poliuretano per la coltura a lungo termine di epatociti derivati da cellule staminali. Questo metodo sintetico migliora l'adesione cellulare e la funzione metabolica.

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1. Sintesi di PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diol) <img alt="Schema 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> Schema 1: Sintesi di PHNAGD Rappresentazione schematica della sintesi di PHNAGD.. PHNAGD è stato preparato dalla reazione di 1,6-Hexanodiol, dietilenglicole, neoppentyl glicole e acido adipico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diolo. <ol><li> Applicare trattamento termico ai monomeri 1,6-esandiolo, di (etilenglicole) e neopentilglicole a 40 ° C per 48 ore in stufa sotto vuoto per rimuovere l&#39;acqua residua. Lasciare al freddo fino a RT sotto vuoto. </li><li> Aggiungere 22 mmol di ciascun monomero e acido adipico (55 mmol) in un pallone a fondo tondo a due colli munito di una barra di agitazione e connesso ad un apparecchio di Dean-Stark. </li><li> Mettere tutta l&#39;assemblea sotto vuoto e scaldare delicatamente il glassware a 40 ° C per 6 ore, in modo da evitare l&#39;assorbimento di umidità durante l&#39;aggiunta della sostanza chimica nel pallone. </li><li> Aggiungi tramite siringa, goccia a goccia, 0,0055 moli di titanio catalizzatore (IV) butossido. </li><li> Mescolare la miscela di reazione a 180 ° C, in atmosfera N 2 per 24 ore, e raccogliere l&#39;acqua residua nella trappola di Dean-Stark. Lasciare raffreddare il prodotto a temperatura ambiente. </li></ol> 2 Sintesi di PU134 <img alt="Schema 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> Schema 2: Sintesi di PU134 Rappresentazione schematica della sintesi del poliuretano 134 PU134 è stato preparato per reazione di 1,0 equiv di un PHNGAD con 2,0 equiv di un Metilenebis 4,4-(fenil isocianato), seguita dall&#39;aggiunta di 1,0. equiv di una catena extender 1,4-butandiolo. <ol><li> Mescolare un equivalente della PHNGAD poliolo (Mn ~ 1.800 Da, 3.2 mmol) con due equivalenti di 4&#39;4-Metilenebis (fenil isocianato) (6,4 mmol) in anidra N, N -Dimethylformamide (12 ml). </li><li> Mescolare la miscela di reazione a 70 ° C, in atmosfera di N 2. </li><li> Aggiungi tramite siringa, goccia a goccia il titanio catalizzatore (IV) butossido (0,8% in peso). </li><li> Dopo 1 ora, aggiungere uno equivalente della catena extender 1,4-butandiolo (3,2 mmol). Aumentare la temperatura a 90 ° C e agitare per 24 h in atmosfera di N 2. </li><li> Dopo la reazione, raccogliere il poliuretano per precipitazione con l&#39;aggiunta di etere etilico (esano o acqua potrebbe essere utilizzato anche) gocciolamento nella soluzione di reazione fino a quando si verifica la precipitazione. </li><li> Centrifugare la soluzione a 5.300 xg per 5 min. </li><li> Decantare il surnatante e asciugare a 40 ° C in un forno a vuoto fino a quando il solvente evapora. Nota: Al fine di garantire che il prodotto finale della reazione possedere i corretti parametri relativi alla distribuzione dei pesi molecolari, il Grou funzionaleps del polimero, e le temperature di fusione e di transizione vetrosa, può essere utilizzato varie tecniche e metodi analitici, quali la cromatografia a permeazione di gel o spettroscopia FITR. </li></ol> 3 Preparazione di PU134 Solutions <ol><li> Pesare 200 mg di PU134 in una bottiglia di vetro. </li><li> Diluire PU134 ad una concentrazione finale del 2% in diversi solventi: cloroformio, una combinazione di cloroformio e toluene in rapporto 1: 1, tetraidrofurano, e la combinazione di tetraidrofurano e diclorometano nel rapporto 1: 1. Nota: L&#39;elezione del solvente destra varia a seconda del polimero da utilizzare. Solventi diversi possiedono diversi punti di ebollizione che possono influenzare la solubilizzazione del polimero. </li><li> La soluzione viene agitata per 20 minuti a temperatura ambiente usando un agitatore ad una velocità di 200 mot / min, fino a quando la soluzione diventa omogenea e nessun precipitato viene osservata. </li></ol> 4 Rivestimento di diapositive di vetro con PU134 <ol><li> Posizionare un rouDN 15 mm 2 coprioggetto sulla verniciatura giro. </li><li> Applicare 50 ml di soluzione di PU134 per ciascuno utilizzando una pipetta. Regolare il volume della soluzione PU134 conseguenza per il formato coprioggetto desiderato mantenendo il volume di superficie rapporto proporzionale. </li><li> Spin ogni coprioggetto per 7 secondi a 23 x g. </li><li> Aria coprioggetto asciutto a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della sterilizzazione. </li></ol> 5. irradiazione di Coprioggetti <ol><li> Gamma-irradiare coprioggetto rivestito di polimero, applicando una dose di 10 Grays utilizzando un irradiatore laboratorio per 12 min. </li><li> UV irradiare polimero rivestito coprioggetto utilizzando un 30 W, lampadina UV per 16 min ogni lato. </li><li> Posizionare il coprioggetto polimero rivestito in una piastra di coltura tissutale idonea a seconda della dimensione di diapositiva. </li></ol> 6. Microscopia Elettronica a Scansione <ol><li> Oro cappotto polimero coprioggetto per sputtering per 200 sec in un clima di 5 x 10 -1 millibar di pressione. </li><li> Cattura la micrographs del coprioggetto polimero rivestito utilizzando un microscopio elettronico a scansione ad una tensione di accelerazione di 20 kV in modalità di imaging elettroni secondari. </li></ol> 7. Osservazioni Microscopia a Forza Atomica <ol><li> Scansione un&#39;area di 20 x 20 micron della superficie del polimero. </li><li> Impostare una frequenza di scansione da 1,32 Hz a 1,60 Hz. </li><li> Impostare una risoluzione di 512 x 512 pixel nella regione scansionata. </li><li> Calcolare il Root Mean Square (RMS o Rq) del rivestimento, utilizzando la media delle deviazioni di altezza tratti dal piano dati dell&#39;immagine media, espressa come: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Dove Zi è il valore corrente Z, e N è il numero di punti all&#39;interno dell&#39;area dato. </li><li> 7.5 Calcolare la deviazione o media rugosità superficiale (Ra) dell&#39;immagine utilizzando, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Dove Z (x) è la funzione che descrive tegli superficie profilo analizzato in termini di altezza (Z) e la posizione (x) del campione sulla lunghezza valutazione &quot;L&quot;. Ra rappresenta il valore medio della superficie rispetto al piano di mezzeria. </li></ol> 8 coltura cellulare e la differenziazione <ol><li> Cultura e differenziare l&#39;umano linea di cellule staminali embrionali (hESC) H9 come descritto in Hay 17. </li><li> Staccare cellule utilizzando un reagente dissociazione e replate su vetrini rivestiti PU134 al giorno 9 del processo di differenziazione, in presenza di un mezzo privo di siero come descritto in Szkolnicka 18,19. Nota: L&#39;uso di una cella di dissociazione enzimatica è preferito al distacco delle cellule fisica. </li></ol> 9. citocromo P450 saggio funzionale <ol><li> Misurare l&#39;attività del CYP3A seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Incubare hESC epatociti derivati ​​al giorno 13 o il giorno 19, e dei media, senza cellule - come controllo negativo, con il substr appropriatomangiato per 5 ore a 37 ° C. </li><li> Raccogliere surnatanti di cellule e dei media, eseguire il test secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Misurare il livello di attività CYP e relativa normalizzata alla superficie (cm 2). </li></ol> 10 Immunostaining <ol><li> Lavare hESC derivato epatociti con PBS, per 1 min, ripetere due volte. </li><li> Aggiungere il ghiaccio freddo 100% di metanolo per riparare le cellule, posto in -20 ° C per 10 min. </li><li> Lavare le cellule con PBS per 5 minuti e ripetere due volte. </li><li> Incubare le cellule con PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA per 1 ora a RT. </li><li> Aspirare la soluzione PBST e aggiungere l&#39;anticorpo primario appropriato diluito in PBS / T (0,1% di Tween) / 1% BSA, incubare a 4 ° C con agitazione O / N. </li><li> Lavare le cellule con PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA per 5 min e ripetuto tre volte. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo appropriato in PBS / T (0,1% di Tween) / 1% BSA, aggiungere alle cellule e incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione. </li><li> Lavare le cellule con PBS per 5 minuti e ripetere per tre volte. </li><li> Aggiungi Mowiol 488 (contenente DAPI 1: 1.000) per ciascun bene, aggiungere un coprioggetto delicatamente per ridurre il numero di bolle d&#39;aria. Conservare le cellule fissato a 4 ° C al buio. Osservare colorazione utilizzando un microscopio con appositi filtri e lampada fluorescente. Gli anticorpi primari e secondari ottimizzati sono elencati nella Tabella 1. </li></ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
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<li>Shanbhag, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Progenitor+Cells+Grown+on+Hydrogel+Surfaces+Respond+to+the+Product+of+the+Transgene+of+Encapsulated+Genetically+Engineered+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts.</a> Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).</li>
<li>Battista, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+composition+of+3D+constructs+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).</li>
<li>Tian, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+hydrogel+as+Nogo-66+receptor+antibody+delivery+system+for+the+repairing+of+injured+rat+brain%3A+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro.</a> Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).</li>
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<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
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<li>Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell%E2%80%93Derived+Hepatocytes%3A+Potential+and+Challenges+in+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmecol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology.</a> Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).</li>
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<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

DCH è CSO, direttore, fondatore e azionista di FibromEd Products Ltd. MB e JPI sono soci fondatori in FibromEd Products Ltd.

Molti dei metodi attualmente utilizzati per generare epatociti da cellule staminali si basano su matrici indefinite di origine animale. Questi supporti possono essere costosi e molto variabile, che colpisce la funzione delle cellule e la stabilità, che rappresentano una barriera significativa applicazione. Pertanto, abbiamo effettuato una schermata per materiali sintetici che supportano la cultura di cellule staminali epatociti derivati. Abbiamo identificato, un semplice poliuretano (PU134), formata da polimerizzazione ...

I materiali biologici sono stati ampiamente utilizzati per la manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti 1. Mentre permettendo, questi substrati biologici spesso contengono una miriade di componenti non definiti. Matrigel è un substrato comunemente usato per la cultura e la differenziazione delle cellule staminali. Purtroppo, la sua composizione variabile influenza la funzione delle cellule e fenotipo. Anche se una serie di matrici biologiche alternative, più definite sono state utilizzate 2-7, la loro origine animale o scarsa scalabilità li rende i candidati non idonei per la produzione industriale. Pertanto, l&#39;individuazione di alternative sintetiche, a composizione definita e prestazioni affidabili, sono obiettivi chiave nella ricerca sulle cellule staminali. Nel tentativo di superare i limiti dei indefiniti substrati di coltura cellulare, collaborazioni interdisciplinari tra chimica e biologia hanno identificato materiali sintetici con la capacità di supportare fenotipo cellulare. Synthsubstrati ETIC sono scalabili, economiche, e possono essere realizzati in strutture 3D complesse, mimando l&#39;ambiente in vivo. Grazie a queste proprietà substrati sintetici sono stati ampiamente utilizzati per sostenere e guidare la differenziazione di molti tipi di cellule 8-10. Test di throughput avanzate e alte hanno facilitato la rapida proiezione di materiali sintetici, dai grandi librerie, e consegnati nuovi materiali con proprietà flessibili con ampie applicazioni nella ricerca e nello sviluppo 11-13 biomedico. Utilizzando un elevato throughput, polimero tecnologia di screening micro-array, abbiamo rapidamente identificato un semplice poliuretano (PU134), adatto per la manutenzione di cellule staminali derivate epatociti umani. Questo polimero è risultato essere superiore a substrati derivati ​​di origine animale per quanto riguarda la differenziazione e la funzione 14-16 epatociti. Abbiamo quindi ottimizzato il processo di rivestimento in condizioni, la topografia e la sterilizzazione per accedere effettisulle prestazioni del polimero nella stabilizzazione funzione degli epatociti e la durata della vita. Ciò ha implicazioni significative per quanto riguarda la comprensione fondamenti della biologia degli epatociti per la modellazione basata su cellule e applicazioni di medicina rigenerativa. La tecnologia qui descritta costituisce un esempio di come la superficie di un polimero sintetico può essere ottimizzato per preservare fenotipo cellulare. Crediamo che la combinazione di questa tecnologia con un protocollo di differenziazione degli epatociti privo di siero efficace ha il potenziale per fornire una produzione scalabile di epatociti per l&#39;utilizzo nella modellazione in vitro e della medicina rigenerativa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sintesi, preparazione, rivestimento e caratterizzazione di vetrini coprioggetti rivestiti in polimero PU134</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&uuml; hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>Irradiatore</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di rivestimento speciale</td> <td>Spin Coater</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Philips</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a forza atomica</td><td>DimensionV Nanoscope, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Lampadina UV</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope software di analisi</td><td>VEECO</td><td></td><td>versione 1.20</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Usa il software Volocity 4</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale</td><td>Corning, Regno Unito&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>vetrini Forniture</td> di <td>laboratorio scientifico</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>Dietilenglicole</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-esandiolo</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Glicole neopentilico</td><td>Sigma... Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Acido adipico</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>anidro N,N-Dimetilformammide</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>titanio (IV) butossido&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butandiolo&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Forno a vuoto</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Methylenebis(fenil isocianato)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrofurano</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inmunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate tampon salino (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>PBST, PBS composto da 0,1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; Forniture di laboratorio scientifico Ltd</td><td>EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich, Regno Unito</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Composto da Tris HCl e glicerolo secondo le istruzioni</td></tr><tr> del produttore<td colspan="4">Cell culture and Functional assay</td></tr><tr><td>CYP3A activity pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

stabilizzazione epatocellulare fenotipo utilizzando superfici sintetiche ottimizzati

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Attualmente, una delle principali limitazioni nella biologia cellulare è il mantenimento del fenotipo cellulare differenziato. Le matrici biologiche sono comunemente utilizzate per la coltura e il mantenimento di epatociti derivati da cellule staminali primarie e pluripotenti. Sebbene le matrici biologiche siano utili, consentono la coltura a breve termine degli epatociti, limitandone l'applicazione diffusa. Abbiamo cercato di superare i limiti utilizzando un rivestimento in polimero sintetico. I polimeri rappresentano una delle più ampie classi di biomateriali e possiedono un'ampia gamma di proprietà meccaniche, fisiche e chimiche, che possono essere messe a punto per lo scopo. È importante sottolineare che tali materiali possono essere scalati in base a standard di qualità garantita e mostrare coerenza da lotto a lotto. Ciò è essenziale se le cellule devono essere espanse per lo screening ad alto rendimento nell'industria farmaceutica o per la terapia cellulare. I poliuretani (PU) sono un gruppo di materiali che si sono dimostrati promettenti nelle colture cellulari. Vengono presentati e discussi i nostri recenti progressi nell'ottimizzazione di una superficie rivestita in poliuretano, per la coltura a lungo termine di epatociti umani che mostrano un fenotipo stabile.

Solvente del polimero influenza la topografia della superficie del polimero rivestito Poliuretano 134 è stato solubilizzato in cloroformio, da solo o in combinazione con toluene o tetraidrofurano o diclorometano ei vetrini spin-rivestiti con le diverse formulazioni. Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia a forza atomica (AFM) sono stati usati per caratterizzare le proprietà fisiche dei rivestimenti polimerici (Figura 1). Il rivestimento otte...

Questo articolo si concentrerà sullo sviluppo di superfici polimeriche rivestite a lungo termine, coltura stabile di cellule staminali derivate epatociti umani.

Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottimizzare le superfici rivestite con polimeri per preservare la coltura stabile a lungo termine di epatociti umani derivati da cellule staminali. Ciò viene ottenuto innanzitutto sintetizzando il poliuretano 1 3 4 o PU 1 3 4. Il secondo passaggio consiste nella scelta del solvente appropriato per solubilizzare PU 1 34.Successivamente, viene ottimizzato il processo di spin coating con il PU 1 3 4 sullo slip di vetro. L'ultimo passaggio consiste nell'ottimizzazione della procedura di sterilizzazione degli slip di vetro ricoperti con il polimero P 1 34, seguita infine da microscopia elettronica a scansione, microscopia a forza atomica e analisi del metabolismo dei farmaci. Vengono utilizzati saggi per dimostrare l'influenza del rivestimento con polimero PU 1 34 sulla funzionalità degli epatociti derivati da cellule staminali.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di matrici in coltura per mantenere cellule staminali potenti in grado di differenziarsi in epatociti, è che questi materiali sintetici possono essere opportunamente ottimizzati per scopi specifici e prodotti su scala per soddisfare standard di qualità garantita. Inoltre, presentano una coerenza tra diversi lotti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie epatiche, poiché rappresentano un esempio di come la superficie di un polimero sintetico possa essere ottimizzata per preservare il fenotipo cellulare.La procedura sarà dimostrata dal dottor Jeffrey Walton, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Prima di iniziare questa procedura, applicare un trattamento termico al mono 1,6-esandiolo, al diglicole di etilene e al neopentilglicolo a 40 gradi Celsius per 48 ore in un forno sotto vuoto, per rimuovere qualsiasi traccia residua di acqua. Aggiungere 22 millimoli di ciascun monomero e 55 millimoli di acido dpic a un pallone rotondo a due collo collegato a un apparecchio di Dean-Stark e munito di una barretta magnetica per agitazione.Successivamente, posizionare l'intero apparato sotto vuoto e riscaldare delicatamente la strumentazione a 40 gradi Celsius per sei ore, al fine di evitare qualsiasi assorbimento di umidità durante l'aggiunta del reagente al pallone. Dopo aver rimosso l'apparato dal forno e aver posto il sistema sotto azoto, aggiungere 0,0055 moli del catalizzatore titanio tetra, butossido, goccia a goccia mediante siringa, al pallone. Mescolare la miscela di reazione a 180 gradi Celsius per 24 ore, raccogliendo l'acqua residua nel trappolo di Dean-Stark.Lasciare raffreddare il prodotto a temperatura ambiente. Successivamente, mescolare 3,2 millimoli, ovvero un equivalente del poliolo P-H-N-G-A-G, con 6,4 millimoli, ovvero due equivalenti di 4,4'-metilendifenil diisocianato, in 12 millilitri di DML anidro, in un pallone rotondo bicollo collegato a un apparecchio di Dean-Stark e munito di una barretta magnetica a stella.Agitare la miscela di reazione a 70 gradi Celsius sotto atmosfera di azoto. Quindi aggiungere goccia a goccia tramite siringa il catalizzatore biossido di titanio a una concentrazione finale dello 0,8%. Dopo un'ora, aggiungere un equivalente del chain extender butandiolo-1,4 per ottenere il prodotto copolimerico. Aumentare la temperatura a 90 gradi Celsius e mantenere la reazione per 24 ore sotto atmosfera di azoto.Una volta che la miscela di reazione ha raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere lentamente a gocce un etere alchilico alla miscela di reazione fino a quando non si osserva la precipitazione del prodotto di poliuretano. Dopo aver trasferito la miscela di reazione in un tubo da centrifuga, centrifugare la soluzione a 5.300 ×g per cinque minuti. Dopo la decantazione, lasciare asciugare il surnatante a temperatura ambiente finché il solvente non è completamente evaporato.Successivamente, pesare 200 milligrammi di PU 1 34 in un contenitore di vetro. Diluire il campione fino a una concentrazione finale del 2% in cloroformio oppure in una miscela di cloroformio e toluene in rapporto uno a uno, oppure in tetracloruro di carbonio o in una combinazione di tetracloruro di carbonio e clorometano in rapporto uno a uno. Agitare vigorosamente la soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzando un agitatore impostato su una velocità di 200 movimenti al minuto, fino a quando la soluzione diventa omogenea e non si osserva alcun precipitato.Una volta terminato, posizionare un'ampia copertura di vetro quadrata da circa 15 millimetri sullo spin coter. Applicare 50 microlitri della soluzione PU uno attraverso quattro sulla copertura di vetro utilizzando una pipetta; far ruotare ogni copertura per sette secondi a 23 volte G. Successivamente, lasciare asciugare l'aria della copertura a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della sterilizzazione. A questo punto, irradiare con raggi gamma ogni copertura rivestita di polimero applicando una dose di 10 gray utilizzando un radiatore da laboratorio per 12 minuti.In alternativa, irradiare ogni coprioggetto rivestito con polimero utilizzando una lampadina UV da 30 watt per 16 minuti su ciascun lato. Al termine, posizionare il coprioggetto rivestito con polimero in una piastra da coltura tissutale adatta, in base alle dimensioni del coprioggetto. Dopo la coltivazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane, staccare le cellule mediante un reagente di dissociazione e riseminare queste ultime sui coprioggetti rivestiti con PU 1 34 al nono giorno del processo di differenziazione, in presenza di mezzo privo di siero, per l'analisi mediante microscopia elettronica a scansione.Le immagini dei diversi vetrini rivestiti mostrano che il rivestimento con toluene o cloroforo non era omogeneo, dimostrando una deposizione irregolare con precipitazione di PE 1 34. Al contrario, il tetraidrofurano ha permesso un rivestimento mediante spin coating molto più uniforme. Inoltre, l'analisi mediante microscopia a forza atomica dei diversi rivestimenti polimerici mostra una riduzione del 40% della rugosità di P 1 34 solubilizzato nel tetraidrofurano rispetto ad altri solventi, dimostrando un rivestimento di PU 1 34 più uniforme. Per un'applicazione biologica, è stata indotta la differenziazione in endoderma epatico e, al nono giorno, erano evidenti cellule simili a epatoblasti, con la maggior parte delle cellule esprimenti la citocheratina 19, la proteina alfa-fetoproteina e il fattore nucleare epatico 4α, nonché bassi livelli di albumina come indicatore della funzione metabolica.La funzione del citocromo P450 è stata valutata quattro giorni dopo il riseminamento su diverse superfici rivestite con polimeri. È stato osservato un aumento del doppio dell'attività metabolica nelle cellule riseminante su superfici rivestite con tetraidrofuranopolimero 1 3 4. Questi risultati dimostrano che l'attività metabolica degli epatociti derivati da cellule staminali embrionali umane migliora con una superficie di rivestimento P 1 34 più uniforme. L'analisi mediante imaging a contrasto non ha rivelato differenze macroscopiche dopo irradiazione UV o gamma, risultato ulteriormente confermato dall'analisi mediante microscopia elettronica a scansione.Epatociti derivati da cellule staminali embrionali umane, ripiattati su vetrini di vetro rivestiti con PU 1 34 sottoposti a radiazione gamma, hanno mostrato un aumento tripliato dell'attività della CYP tre a rispetto alle cellule ripiattate su vetrini di vetro rivestiti con PU 1 34 sottoposti a radiazione UV. Queste osservazioni dimostrano che la radiazione gamma rappresenta la tecnica di sterilizzazione ottimale. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di verificare l'omogeneità del rivestimento tra diversi vetrini rivestiti mediante spin coating e non dimenticare che lavorare con solventi chimici e strumentazione può essere estremamente pericoloso.Devono sempre essere adottate precauzioni come l'uso di occhiali di protezione durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Il metodo presentato qui descrive una soluzione scalabile e buone pratiche di fabbricazione (GMP) sistema di differenziazione -ready per generare cellule epatociti-come l'essere umano da cellule staminali pluripotenti. Serve come un sistema economico e standardizzato per generare cellule epatociti-come l'essere umano per la ricerca di base e applicata fegato umano.

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all'uso offre all'utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).

Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

I recenti progressi tecnici hanno consentito la produzione su larga scala di una piattaforma in vitro per il metabolismo dei farmaci e le applicazioni di tossicità. Un sistema epatico 2D+ completamente umano (TV2D+) fornisce risultati fisiologicamente rilevanti utilizzando i tradizionali metodi di coltura bidimensionale. Questo protocollo supporterà gli utenti finali nella configurazione, nella manutenzione e nell'applicazione del sistema.

Un sistema di coltura epatica interamente umano per applicazioni di sviluppo di farmaci

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