Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati

L'obiettivo generale di questa procedura è ottimizzare le superfici rivestite con polimeri per preservare la coltura stabile a lungo termine di epatociti umani derivati da cellule staminali. Ciò viene ottenuto innanzitutto sintetizzando il poliuretano 1 3 4 o PU 1 3 4. Il secondo passaggio consiste nella scelta del solvente appropriato per solubilizzare PU 1 34.

Successivamente, viene ottimizzato il processo di spin coating con il PU 1 3 4 sullo slip di vetro. L'ultimo passaggio consiste nell'ottimizzazione della procedura di sterilizzazione degli slip di vetro ricoperti con il polimero P 1 34, seguita infine da microscopia elettronica a scansione, microscopia a forza atomica e analisi del metabolismo dei farmaci. Vengono utilizzati saggi per dimostrare l'influenza del rivestimento con polimero PU 1 34 sulla funzionalità degli epatociti derivati da cellule staminali.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di matrici in coltura per mantenere cellule staminali potenti in grado di differenziarsi in epatociti, è che questi materiali sintetici possono essere opportunamente ottimizzati per scopi specifici e prodotti su scala per soddisfare standard di qualità garantita. Inoltre, presentano una coerenza tra diversi lotti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie epatiche, poiché rappresentano un esempio di come la superficie di un polimero sintetico possa essere ottimizzata per preservare il fenotipo cellulare.

La procedura sarà dimostrata dal dottor Jeffrey Walton, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Prima di iniziare questa procedura, applicare un trattamento termico al mono 1,6-esandiolo, al diglicole di etilene e al neopentilglicolo a 40 gradi Celsius per 48 ore in un forno sotto vuoto, per rimuovere qualsiasi traccia residua di acqua. Aggiungere 22 millimoli di ciascun monomero e 55 millimoli di acido dpic a un pallone rotondo a due collo collegato a un apparecchio di Dean-Stark e munito di una barretta magnetica per agitazione.

Successivamente, posizionare l'intero apparato sotto vuoto e riscaldare delicatamente la strumentazione a 40 gradi Celsius per sei ore, al fine di evitare qualsiasi assorbimento di umidità durante l'aggiunta del reagente al pallone. Dopo aver rimosso l'apparato dal forno e aver posto il sistema sotto azoto, aggiungere 0,0055 moli del catalizzatore titanio tetra, butossido, goccia a goccia mediante siringa, al pallone. Mescolare la miscela di reazione a 180 gradi Celsius per 24 ore, raccogliendo l'acqua residua nel trappolo di Dean-Stark.

Lasciare raffreddare il prodotto a temperatura ambiente. Successivamente, mescolare 3,2 millimoli, ovvero un equivalente del poliolo P-H-N-G-A-G, con 6,4 millimoli, ovvero due equivalenti di 4,4'-metilendifenil diisocianato, in 12 millilitri di DML anidro, in un pallone rotondo bicollo collegato a un apparecchio di Dean-Stark e munito di una barretta magnetica a stella.

Agitare la miscela di reazione a 70 gradi Celsius sotto atmosfera di azoto. Quindi aggiungere goccia a goccia tramite siringa il catalizzatore biossido di titanio a una concentrazione finale dello 0,8%. Dopo un'ora, aggiungere un equivalente del chain extender butandiolo-1,4 per ottenere il prodotto copolimerico. Aumentare la temperatura a 90 gradi Celsius e mantenere la reazione per 24 ore sotto atmosfera di azoto.

Una volta che la miscela di reazione ha raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere lentamente a gocce un etere alchilico alla miscela di reazione fino a quando non si osserva la precipitazione del prodotto di poliuretano. Dopo aver trasferito la miscela di reazione in un tubo da centrifuga, centrifugare la soluzione a 5.300 ×g per cinque minuti. Dopo la decantazione, lasciare asciugare il surnatante a temperatura ambiente finché il solvente non è completamente evaporato.

Successivamente, pesare 200 milligrammi di PU 1 34 in un contenitore di vetro. Diluire il campione fino a una concentrazione finale del 2% in cloroformio oppure in una miscela di cloroformio e toluene in rapporto uno a uno, oppure in tetracloruro di carbonio o in una combinazione di tetracloruro di carbonio e clorometano in rapporto uno a uno. Agitare vigorosamente la soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzando un agitatore impostato su una velocità di 200 movimenti al minuto, fino a quando la soluzione diventa omogenea e non si osserva alcun precipitato.

Una volta terminato, posizionare un'ampia copertura di vetro quadrata da circa 15 millimetri sullo spin coter. Applicare 50 microlitri della soluzione PU uno attraverso quattro sulla copertura di vetro utilizzando una pipetta; far ruotare ogni copertura per sette secondi a 23 volte G. Successivamente, lasciare asciugare l'aria della copertura a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della sterilizzazione. A questo punto, irradiare con raggi gamma ogni copertura rivestita di polimero applicando una dose di 10 gray utilizzando un radiatore da laboratorio per 12 minuti.

In alternativa, irradiare ogni coprioggetto rivestito con polimero utilizzando una lampadina UV da 30 watt per 16 minuti su ciascun lato. Al termine, posizionare il coprioggetto rivestito con polimero in una piastra da coltura tissutale adatta, in base alle dimensioni del coprioggetto. Dopo la coltivazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane, staccare le cellule mediante un reagente di dissociazione e riseminare queste ultime sui coprioggetti rivestiti con PU 1 34 al nono giorno del processo di differenziazione, in presenza di mezzo privo di siero, per l'analisi mediante microscopia elettronica a scansione.

Le immagini dei diversi vetrini rivestiti mostrano che il rivestimento con toluene o cloroforo non era omogeneo, dimostrando una deposizione irregolare con precipitazione di PE 1 34. Al contrario, il tetraidrofurano ha permesso un rivestimento mediante spin coating molto più uniforme. Inoltre, l'analisi mediante microscopia a forza atomica dei diversi rivestimenti polimerici mostra una riduzione del 40% della rugosità di P 1 34 solubilizzato nel tetraidrofurano rispetto ad altri solventi, dimostrando un rivestimento di PU 1 34 più uniforme. Per un'applicazione biologica, è stata indotta la differenziazione in endoderma epatico e, al nono giorno, erano evidenti cellule simili a epatoblasti, con la maggior parte delle cellule esprimenti la citocheratina 19, la proteina alfa-fetoproteina e il fattore nucleare epatico 4α, nonché bassi livelli di albumina come indicatore della funzione metabolica.

La funzione del citocromo P450 è stata valutata quattro giorni dopo il riseminamento su diverse superfici rivestite con polimeri. È stato osservato un aumento del doppio dell'attività metabolica nelle cellule riseminante su superfici rivestite con tetraidrofuranopolimero 1 3 4. Questi risultati dimostrano che l'attività metabolica degli epatociti derivati da cellule staminali embrionali umane migliora con una superficie di rivestimento P 1 34 più uniforme. L'analisi mediante imaging a contrasto non ha rivelato differenze macroscopiche dopo irradiazione UV o gamma, risultato ulteriormente confermato dall'analisi mediante microscopia elettronica a scansione.

Epatociti derivati da cellule staminali embrionali umane, ripiattati su vetrini di vetro rivestiti con PU 1 34 sottoposti a radiazione gamma, hanno mostrato un aumento tripliato dell'attività della CYP tre a rispetto alle cellule ripiattate su vetrini di vetro rivestiti con PU 1 34 sottoposti a radiazione UV. Queste osservazioni dimostrano che la radiazione gamma rappresenta la tecnica di sterilizzazione ottimale. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di verificare l'omogeneità del rivestimento tra diversi vetrini rivestiti mediante spin coating e non dimenticare che lavorare con solventi chimici e strumentazione può essere estremamente pericoloso.

Devono sempre essere adottate precauzioni come l'uso di occhiali di protezione durante l'esecuzione di questa procedura.