Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di aggirare i limiti dell'immunofluorescenza indiretta per studiare le cellule progenitrici neurali. Quando non sono disponibili anticorpi primari idonei di diverse specie ospiti. Inizialmente, viene iniettato un analogo della timidina per etichettare le cellule in divisione, dopodiché il tessuto viene raccolto, elaborato e tagliato in sezioni criogeniche.

Quindi viene eseguita l'immunofluorescenza multipla sequenziale per iniziare. Viene applicato un anticorpo primario non marcato, che viene poi legato da un anticorpo secondario marcato in fluorescenza. Successivamente, le pericopi aperte sul primo anticorpo secondario vengono bloccate con il siero della specie di anticorpo primario e tutte le immunoglobuline che potrebbero essere riconosciute dal secondo anticorpo secondario vengono ricoperte da frammenti fab non coniugati.

Ciò consente di trattare il tessuto con un secondo anticorpo primario, che può essere marcato con un diverso anticorpo secondario. In definitiva, le immagini delle sezioni vengono utilizzate per studiare lo sviluppo e la regolazione delle cellule progenitrici neurali in risposta a stimoli specifici e il loro coinvolgimento in particolari funzioni cerebrali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza multipla simultanea, è che elude i problemi che di solito derivano dalla necessità di utilizzare anticorpi primari allevati nella stessa specie ospite.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi adulta, come la proliferazione di sottogruppi progenitori dell'ippocampo in risposta a stimoli fisiologici o farmacologici, patologie cerebrali o invecchiamento. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la marcatura multipla con anticorpi primari della stessa specie ospite potrebbe portare ad attività incrociate di anticorpi indesiderati senza un adeguato blocco. Per prima cosa, pesare gli animali da iniettare e preparare una soluzione madre fresca di analogo della timidina da 10 milligrammi per millilitro per l'iniezione.

Quando la soluzione è pronta, preparare una dose aggiustata per il peso in una siringa a dosaggio fine con un ago da 30 gauge. Quindi trattenere il topo per la collottola e iniettare l'analogo della timidina intraperitoneale al punto temporale desiderato, anestetizzare profondamente il topo e trans cardio. Perfonderlo con 10 millilitri di PBS ghiacciato, seguiti da 40 millilitri di soluzione di formaldeide ghiacciata fresca.

Quindi sezionare il cervello e postarlo, fissarlo nello stesso fissativo dopo la fissazione. Incubare i cervelli raccolti per 24 ore in saccarosio al 10% a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire il cervello nel saccarosio al 30% e incubare per altre 48 ore.

Con i cervelli pronti per la crioprotezione, congelali a 25 gradi Celsius isop pentano. Successivamente, utilizzare un criostato per tagliare sezioni coronali di 40 micron per la conservazione a lungo termine. Trasferire le sezioni in una soluzione antigelo e mantenerle a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.

Inizia trasferendo le sezioni dalla soluzione antigelo a TBS con l'aiuto di una spazzola fine. Risciacquare accuratamente le ciocche, iniziando con un lavaggio notturno a quattro gradi Celsius, seguito da cinque lavaggi di 10 minuti a temperatura ambiente. Tutte queste incubazioni devono essere eseguite con un'agitazione delicata e continua.

Se uno degli antigeni di interesse è un analogo della timidina, a questo punto deve essere attuata una fase di denaturazione dell'acido cloridrico, seguita da una fase di neutralizzazione nel tampone di foro. Procedere con permeabilità e blocco dei siti di legame anticorpale aspecifici in TBS plus. Lasciare che l'incubazione prosegua per un'ora a temperatura ambiente, quindi incubare nel primo anticorpo primario diluito in TBS e per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Lavare le sezioni tre volte in TBS e una volta in TBST. Lascia andare ogni bagno per 10 minuti. Quindi incubare nel primo anticorpo secondario coniugato con fluorocromo per tre ore a temperatura ambiente.

D'ora in poi, proteggere le sezioni dall'esposizione alla luce. Dopo un'altra serie di lavaggi, trasferire le sezioni in una soluzione di siero al 10% di specie ospite da cui sono stati prodotti i due anticorpi primari. Incubare le sezioni in questa soluzione per tre ore per saturare le pericopi aperte sul primo anticorpo secondario.

Successivamente risciacquare tre volte in TBS e una volta in TBST per rimuovere il siero. Quindi preparare una soluzione di TBS plus con 50 microgrammi per millilitro di frammenti fab monovalenti non coniugati diretti contro la specie ospite dell'anticorpo primario. Questo copre gli epitopi che potrebbero altrimenti essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario.

Trasferire le sezioni in questa soluzione e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sciacquare le sezioni almeno tre volte in TBS e una volta in TBST. Durante i trasferimenti, tamponare gli inserti in rete contenenti le sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere i residui di fab

Ora incubare le sezioni nel secondo anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo un'altra serie di lavaggi, applicare il secondo anticorpo secondario per tre ore a temperatura ambiente. Infine lavare le sezioni tre volte in TBS e procedere con il montaggio delle sezioni di gelatina.

Asciugare all'aria i vetrini e coprirli utilizzando un'immagine del supporto di montaggio ANTIFA. Le sezioni marcate a fluorescenza con un microscopio a scansione laser confocale. Prendi pile di immagini in posizioni casuali lungo l'intera estensione del giro dentato con un ingrandimento di 400 volte.

Analizzare almeno 50 cellule di interesse selezionate casualmente per emisfero per la co-marcatura dei diversi marcatori. Per calcolare i numeri assoluti per specifiche popolazioni di cellule neonatali, moltiplicare le percentuali di cellule co-marcate con il numero totale di cellule neonate stimate dall'analisi di colorazione DAB. I metodi descritti sono stati utilizzati per quantificare e caratterizzare le cellule neonate nell'ippocampo postnatale e adulto di un ciclo carente di neurogenesi.

D modello murino knockout, la colorazione DAB contro diversi marcatori di proliferazione come KI 67 o BRDU ha costantemente rivelato differenze nel numero di cellule neonate tra topi wild type e knockout. Le cellule neonate marcate con BRDU potrebbero essere fenotipizzate con un protocollo convenzionale di immunofluorescenza multipla che prevede l'applicazione simultanea di anticorpi primari contro il nido B-R-D-U-G-F-A-P in GFP e doppia cortina. Ciò ha permesso di identificare con successo le cellule progenitrici neonate di tipo uno, tipo due A, tipo due B e tipo tre all'interno di un singolo campione.

In alternativa, con intervalli di tempo più lunghi tra l'iniezione di BRDU e il sacrificio dell'animale, il numero finale di neuroni neonati potrebbe essere analizzato mediante colorazione simultanea di nuovi neuroni BRDU. Il protocollo di immunomarcatura sequenziale ha funzionato perfettamente se le sezioni sono state prima incubate contemporaneamente con anticorpi anti KI 67 di coniglio, anti-GFP di capra e anti-doppio cordone di cavia e, in secondo luogo, con anticorpi anti GFAP di coniglio, ma non viceversa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare fino a quattro diversi antigeni nella singola sezione di tessuto utilizzando anticorpi primari sollevati nello stesso ospite.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere controlli appropriati per eliminare la possibilità di anticorpi, reattività crociata o falsi positivi. Tenere presente che la sequenza di incubazione degli anticorpi primari potrebbe influenzare fortemente l'esito del protocollo.