Name: Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri un protocollo di immunoistochimica sequenziale per rilevare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta in una singola sezione tissutale, superando le limitazioni degli anticorpi della stessa specie ospite.

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Gli autori ringraziano S. Tausch per l'eccellente assistenza tecnica. Il lavoro è stato sostenuto da BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) e DFG (FOR1738).

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali viventi sono state effettuate in conformità con la direttiva comunitaria 86/609 / CEE del Consiglio le linee guida sulla cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e approvato dal comitato etico locale (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. Iniezione intraperitoneale della timidina Analoghi <ol><li> Pesare animali il giorno prima dell&#39;iniezione. Calcolare la quantità di timidina analogico richiesto per tutte le iniezioni in programma il giorno successivo, così come i singoli volumi di iniezione ponderati di un / ml di soluzione di 10 mg. </li><li> Preparare timidina soluzione madre di 10 mg / ml. (ATTENZIONE! Analoghi della timidina sono tossici. Seguire le specifiche schede di sicurezza (MSDS) fornite dai fornitori, vale a dire, indossare camice e guanti, usare una cappa). <ol><li> Prendere timidina analogico dal freezer e portarlo a RT, circa. 21 ° C. Pesare 10 mg e aggiungeresalina sterile (per BrdU e CldU) o 0,04 N NaOH (in soluzione salina sterile, per IDU), vortice. Posizionare per almeno 10 - 15 minuti in un bagno d&#39;acqua a 50 ° C e agitare ogni 2 - 3 minuti per sciogliere la polvere. NOTA: utilizzare soluzioni per un massimo di 24 ore se conservato a temperatura ambiente e per diverse settimane a -20 ° C. Proteggere le soluzioni dalla luce (coprire con un foglio di alluminio). Controllare sempre per precipitati e ri-sciogliere, se necessario. </li></ol></li><li> Trattenere il mouse per la collottola e intraperitoneale iniettare una, adattata al peso appropriato volume di soluzione di riserva (a temperatura ambiente) con una siringa di dosaggio fine con un G 30 ago. NOTA: In caso CldU e Idu devono essere somministrati sequenzialmente all&#39;interno dello stesso animale, ritengono iniettare concentrazioni equimolari (ad esempio, 42,5 mg / kg CldU e 57,5 mg / kg IdU, che corrispondono a 50 mg / kg BrdU). Pertanto, regolare i volumi di iniezione delle soluzioni 10 mg / ml di archivi conseguenza. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto <ol><li> Prepare 4% di formaldeide in tampone fosfato 0,1 M pH 7,4, il giorno prima della perfusione. Conservare a 4 ° C. </li><li> Transcardially perfusione topi profondamente anestetizzati (3,5% isoflurano) attraverso il ventricolo sinistro con 10 ml PBS freddo, poi con 40 ml ghiacciata formaldeide (portata 5 ml / min). Sezionare il cervello e post-fix nello stesso fissativo per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Trasferire il cervello consecutivamente in 10% (24 ore a 4 ° C) e del 30% di saccarosio (fino lavandini cerebrali, ca. 48 ore). Per il congelamento, lentamente immergere il cervello crioprotetti in -25 ° C fino a quando non isopentano bolle emergono dal tessuto. Conservare a -80 ° C. </li><li> Tagliare sezioni coronali di 40 micron di spessore su un microtomo congelatore (temperatura del blocco a -25 a -16 ° C). Trasferimento sequenziale sezioni in soluzione antigelo contenente pozzetti di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti (vedi figura 1). Conservare a -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Schema di trasferire fette microtomo in un 24-pozzetti. Inizia a A1 e mettere le fette successive in riga A, dopo A6 passare alla riga successiva B e così via. Al raggiungimento D6, tornare a A1 e continuare. Questa disposizione consente di fette per la quantificazione di ogni n ° sezione di un intero cervello. Per la quantificazione delle cellule neonate prendere ogni 6 th sezione cervello (equivalente al contenuto di una colonna), per immunofluorescenza fenotipizzazione prendere ogni sezione 12 th (equivalente al contenuto di 2 righe alternate di una colonna). 3. Immunostaining NOTA: Le sezioni sono lavorate senza flottante, di solito in 6 pozzetti dotati di una piastra di supporto e inserti in mesh. In via eccezionale, il blocco, incubazioni anticorpi e reazioni ABC sono fatto in 12 o 24 e piastre senza inserti in rete (da 0,5 a 1 ml per well è sufficiente, a seconda del numero di fette che devono essere tinto). Durante queste fasi, di trasferire le sezioni con l&#39;aiuto di un pennello sottile (risciacquare con ogni nuova soluzione). Tutte le incubazioni sono fatti con agitazione continua (max 150 rpm). <ol><li> Immunoistochimica (metodo ABC) <ol><li> Trasferire le sezioni di antigelo in TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O / N a 4 ° C, 5 volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno) per rimuovere completamente l&#39;antigelo. </li><li> Incubare per 30 min a 1,5% H 2 O 2 in TBS-T per placare la perossidasi endogena. Prestare attenzione alla frizzante e ri-immergere le sezioni, se necessario. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Optional: Nel frattempo preriscaldare un armadio di riscaldamento e 2 N HCl a 37 ° C. Incubare sezioni per 30 min a 37 ° C in 2 N HCl per denaturare il DNA. Delicatamente sezioni separate con l&#39;aiuto di una spazzola. </li><li> Optional: Neutralizzare le sezioni per 10 min a 0,1 M borato a pH8.5, RT. Durante il trasferimento, brevemente tamponare gli inserti in mesh che contengono sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere avanzi HCl. Lavare 2 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Incubare in TBSplus per permeabilize il tessuto e per bloccare legame anticorpo siti non specifici, 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare in anticorpo primario diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Incubare in biotinilato anticorpo secondario diluito in TBSplus, 3 ore a temperatura ambiente. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. Nel frattempo ... </li><li> Preparare complesso ABC secondo il protocollo del produttore (1% A + 1% B in TBS-T). Lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Incubare sezioni AB reagente per 1 ora a RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Preparare 50 ml di 0,5 mg / ml DAB in TBS-T per 6 o 12 pozzetti, diviso in due metà e pipette 4 ml o 2 ml per pozzetto rispettivamente. Trasferimento sezioni in DAB soluzione (ATTENZIONE! DAB è tossico. Seguire la specific MSDS fornite dal fornitore, vale a dire, indossare camice e guanti, utilizzano una cappa). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 1% H 2 O 2 al restante soluzione DAB 25 ml, mescolare e volumi pipetta equivalenti come sopra ad ogni pozzetto per iniziare la reazione perossidasi. Incubare per 12 min. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Montare le sezioni per diapositive in gelatina, aria secca O / N. Coverslip con mezzo di montaggio permanente. </li><li> Optional: Controcolorare prima di mettere il vetrino (vedi paragrafo 3.5). NOTA: Se il rapporto segnale-rumore è basso a causa di alta sfondo, ripetere il trattamento H 2 O 2 dopo l&#39;incubazione con il reagente AB (passo 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-immunofluorescenza <ol><li> Singolo o simultanea immunofluorescenza multipla <ol><li> Trasferire le sezioni di antigelo in TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O / N a 4 ° C, 5 volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno) per rimuovere completamente unnel sistema di raffreddamento. </li><li> Optional: come passi 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incubare in TBSplus per permeabilize il tessuto e bloccare vincolante anticorpi siti non specifici, 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare in cocktail anticorpo primario (ad esempio, ratto α-BrdU, cavia α-DCX, α-GFP capra) diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Incubare in cocktail di anticorpi secondari coniugati a fluorocromi (ad esempio, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-capra, tutti derivati ​​in asino) diluito in TBSplus, 3 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. D&#39;ora in poi proteggere sezioni dalla luce. Lavare 3 volte in TBS per 15 min ciascuno. </li><li> Montare le sezioni per diapositive in gelatina, aria secca O / N. Coverslip con mezzo di montaggio acquoso. </li></ol></li><li> Sequenziale immunofluorescenza multipla con anticorpi primari di una stessa specie ospiti <ol><li> Come passi 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incubare in fiprimo anticorpo primario (ad esempio, α-antigene coniglio A), O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in prima anticorpi coniugati a fluorocromi secondaria (ad esempio, Rhodamine Red-cong. Asino α-coniglio), 3 hr RT. D&#39;ora in poi proteggere sezioni dalla luce. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in 10% di siero normale dalla stesso host gli anticorpi primari (ad esempio siero, coniglio) per 3 ore RT per saturare paratopes aperte sul primo anticorpo secondario. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in TBSplus con 50 mg / ml monovalenti non coniugata Fab frammenti diretti contro l&#39;ospite degli anticorpi primari (ad esempio, IgG α-rabbit (H + L)) per coprire epitopi che potrebbero essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario, O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare almeno 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. Durante il trasferimento, brevemente swab agli inserti in mesh che contengono sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere eventuali avanzi Fab. </li><li> Incubare in secondo anticorpo primario (ad esempio, coniglio α-antigene B), O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in secondo anticorpi coniugati a fluorocromi secondaria (ad esempio, Alexa-488-cong. Asino α-coniglio), 3 hr RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra. NOTA: Per etichettare antigeni con anticorpi da diverse specie ospite aggiungerli al punto 3.2.2.2 e rispettivi anticorpi secondari al punto 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Uno degli anticorpi secondari da specie come uno degli anticorpi primari NOTA: Questo protocollo è adatto a quadrupla-colorazione contro BrdU o Ki67 insieme GFAP, nestina-GFP e DCX. <ol><li> Seguire rigorosamente protocollo passi 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Fino a questo punto usare solo siero asino in TBSplus. </li><li> Incubare in TBSplus contenente siero di capra 3% per 1 ora a RT. Questo copre paratopes aperte sul anticorpo secondario α-caprino. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in AMCA-cong. capra α-coniglio diluito in TBSplus, 3 hr RT o O / N 4 ° C. Risciacquare tre volte in TBS per 15 min ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra. </li></ol></li><li> CldU, Idu co-colorazione <ol><li> Sciacquare, denaturare e neutralizzare le sezioni come descritto nella sezione 3.2.1 (punti 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incubare con 20 mg / ml non coniugati frammenti Fab α-topo IgG (H + L) in TBSplus, 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 4 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuno. </li><li> Incubare in cocktail anticorpo primario contenente ratto α-BrdU (1: 400; purificato IgG2) e α-BrdU del mouse (1: 350) diluito in TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in cocktail anticorpo secondario contenente asino biotinilate α-rat (1: 500) e FITC-conj. asino α-topo frammenti Fab (1: 100). Lavare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. </li><li> Incubare in Rhodamine Red-cong. Streptavidin, 2 ore a RT. Lavare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuno, montare e applicare il coprioggetto come sopra. </li></ol></li><li> L&#39;amplificazione del segnale di fluorescenza nei topi nestina-GFP <ol><li> Aggiungi capra α-GFP per il cocktail anticorpo primario. </li><li> Aggiungi un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo proprietà spettrali simili a GFP (come Alexa 488 cong. Asino α-capra) per il cocktail anticorpo secondario. </li></ol></li></ol></li><li> Recupero Epitope <ol><li> Effettuare smascheramento dopo risciacquo antigelo. Piroscafo Preriscaldare con 6 o 12 e piastre contenenti 0,1 M citrato a pH 6,0-95 - 99 ° C (circa 25 min). </li><li> Trasferire le sezioni nel tampone citrato calda e vapore per 30 minuti (coprire i piatti con un foglio di alluminio come plastica lID non sono resistenti al calore). </li><li> Posizionare immediatamente le piastre in un bagno di ghiaccio per raffreddare. Questo aiuta a proteggere morfologia tissutale, che è di particolare importanza quando si lavora con sezioni di cervello di animali postnatale. </li><li> Lavare 3 volte in TBS per 10 minuti ciascuno per sciacquare e neutralizzare il citrato e continuare colorazione. </li></ol></li><li> Mouse anticorpi sul tessuto del mouse <ol><li> Aggiungere 20 mg / ml monovalenti frammenti Fab α-topo IgG (H + L; stessa specie ospiti di anticorpo secondario) per la prima fase di blocco (ad esempio, step 3.1.5 o 3.2.1.3). </li><li> Lavare 4 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuno, e procedere con rispettivo protocollo. </li></ol></li><li> Violetto cresolo di contrasto <ol><li> Soluzione Preriscaldare violetto cresolo a 60 ° C (in vaso di vetro). Incubare i vetrini nella soluzione calda per 3 minuti. </li><li> Sciacquare in aq. dest. e disidratare 2 volte per 1 min ogni a 70%, 96% e 100% di isopropanolo. </li&gt; <li> Chiaro per 5-6 min in xilene o sostituto xilene e coprioggetto con un mezzo di montaggio permanente compatibile. </li></ol></li></ol> Analisi 4. Dati <ol><li> Contare le cellule neonate perossidasi colorate in ogni 6 ° sezione lungo l&#39;intera estensione rostrocaudale del giro dentato. Utilizzare un microscopio ottico con ingrandimento 400X. </li><li> Moltiplicare i numeri di cellule risultanti con l&#39;intervallo di intersezione per ottenere una stima del numero totale di cellule neonato. </li><li> Immagine la fluorescenza etichettato sezioni con un microscopio laser confocale laser dotato di adeguati e sistemi di filtraggio. Prendere pile di immagini in posizioni casuali lungo l&#39;intera estensione del giro dentato a 400X ingrandimenti e analizzare almeno 50 celle selezionate a caso di interesse per emisfero per co-marcatura con altri marcatori. </li><li> Moltiplicare le percentuali risultanti di cellule co-marcati (% / 100), con il numero totale di cellule neonate per calcolare assolutanumero di specifiche popolazioni cellulari neonati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Quantificazione e identificazione di sottopopolazioni di cellule neonato è un tema centrale nella ricerca neurogenesi adulta. Combinando i marcatori di proliferazione e di anticorpi contro le proteine ​​espresse durante le fasi specifiche di neurogenesi adulta permette la rilevazione immunoistochimica di queste sottopopolazioni. Alcuni degli anticorpi o combinazioni di anticorpi richiedono condizioni di colorazione specifiche. Etichettatura di divisione delle cellule con analoghi della timid...

Due regioni cerebrali costitutivamente generare nuovi neuroni per tutta la vita, la zona subventricolare dei ventricoli laterali e la zona subgranulare (SGZ) del giro dentato dell&#39;ippocampo (DG). I nuovi neuroni derivano da cellule progenitrici neurali e passare attraverso diverse fasi di sviluppo morfologico e fisiologico, prima di raggiungere la maturità 1,2. Da un glia-come radiale cellule staminali lentamente dividendo (tipo 1) fasi consecutive di transito amplificare cellule progenitrici intermedie sorgono. I sottotipi più indifferenziate (tipo 2a e 2b tipo) hanno una forma irregolare con brevi, processi tangenziali. Essi generano neuroblasti (tipo 3) che uscire gradualmente il ciclo cellulare di diventare neuroni immaturi (con dendriti estese verso lo strato molecolare) e, infine, integrare nella rete ippocampale granuli maturi. Per le loro caratteristiche fisiologiche particolari queste cellule forniscono il circuito con una maggiore plasticità 3 suggeting un ruolo unico in funzione ippocampale. In realtà, gli studi degli ultimi dieci anni hanno generato una sostanziale evidenza che neurogenesi adulta contribuisce alla memoria spaziale, la separazione del modello e comportamento emotivo 4,5. Neurogenesi adulta può essere studiato con diversi approcci. Analoghi della timidina incorporano nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare e permettono la nascita datazione, la quantificazione e il destino l&#39;analisi delle cellule neonato 6-8. Applicazione sequenziale di diversi analoghi della timidina (ad esempio, CldU, EdU o IDU) può essere utilizzato per studiare il turnover cellulare o popolazioni di cellule nate in diversi momenti durante il corso di un esperimento 9. Un&#39;alternativa, marcatore endogeno per la proliferazione cellulare è Ki67. È espressa nelle cellule in divisione durante tutte le fasi del ciclo cellulare (G1, S, G2, M), tranne la fase di riposo (G0) e l&#39;inizio della G1 10,11. Per analizzare il fenotipo di popolazioni cellulari neonati nell&#39;adulto dentate del giro diversi marcatori molecolari specifici stadio possono essere utilizzati come GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP è un marker di astrociti maturi, ma si esprime anche in cellule gliali radiali come nel prosencefalo adulti. Nestin è un filamento intermedio specifico per le cellule gliali radiali-like e cellule progenitrici intermedi precoci. DCX è una proteina associata ai microtubuli espresso in progenitori intermedi, neuroblasti e neuroni immaturi. Sulla base del (co) espressione di questi tre marcatori e le caratteristiche morfologiche delle cellule marcate quattro sottotipi di cellule progenitrici distinti possono essere identificati: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), di tipo 2 bis (GFAP -, nestina + , DCX -), di tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) e di tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etichettatura dei DCX insieme NeuN, che si esprime nei neuroni postmitotiche, consente la differenziazione di immature (DCX +, NeuN +) e maturo (DCX -, NeuN +) neuroni granulari. I marcatori di cui sopra sono spesso utilizzati per immunofluorescenza co-etichettatura e la successiva microscopia confocale per analizzare il numero e l&#39;identità delle cellule neonate. Ciò richiede in genere anticorpi di diverse specie ospite per evitare indesiderate anticorpi cross-reattività. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi primari adatti per la ricerca neurogenesi sono sollevate nei conigli o topi (ad esempio, mouse α-BrdU, topo α-NeuN, coniglio α-Ki67, α-GFAP coniglio). Questo porta a gravi limitazioni nel numero e combinazione di antigeni che possono essere valutati in una singola fetta. Questo a sua volta non solo aumenta lo sforzo di colorazione, come più colorazioni devono essere eseguite, ma potrebbe anche compromettere l&#39;affidabilità dei risultati. Inoltre, alcuni antigeni sono suscettibili di formalina epitopo mascheratura fissaggio indotta (ad esempio, Ki67, Nestina). Siamo qui descriviamo modifiche dai protocolli immunomarcatura singola e multipla classici (ad esempio, il recupero degli epitopi, multiple immunostaining sequenziale, uso di nestina-GFP topi transgenici 12) superare molti di questi problemi. In particolare, il protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo permette colorazione contro un massimo di quattro diversi antigeni anche se parte degli anticorpi è derivato dallo stesso host. Questo consente il rilevamento simultaneo di tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo cellule progenitrici tipo 3, nonché la loro attività proliferativa all&#39;interno di una singola sezione.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Somministrazione analogica della timidina</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deossiuridina, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>tossico (mutageno, teratogeno)</td></tr><tr><td>5-Cloro-2&primo;-deossiuridina, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>tossico (mutageno, teratogeno)</td></tr><tr><td>5-Cloro-2&prime;-deossiuridina, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>tossico (mutageno, teratogeno)</td></tr><tr><td>5-Iodo-2&prime;-deossiuridina, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>tossico (mutageno, teratogeno)</td></tr><tr><td colspan="4">Preparazione tissutale</td></tr><tr><td>Isoflurano-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide in polvere (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml; en</td><td>16005</td><td>tossico, infiammabile</td></tr><tr><td>Pompa di perfusione PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubi da laboratorio Masterflex Tygon, &Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Ago di alimentazione, dritto, 21 G, punta a oliva da 1,75 mm, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo di congelamento Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre multipozzetto per colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine piroscafo</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell Inserti a membrana in rete di poliestere da 24 mm</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>precaricato in piastre di coltura a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Inserti a membrana in rete di poliestere Netwell da 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>precaricato in piastre di coltura a 12 pozzetti</td></tr><tr><td>Kit di supporto a 6 pozzetti in plastica</td><td>Netwell Corning</td><td>3521</td><td>per inserti a membrana in rete di poliestere da 24 mm</td></tr><tr><td>Kit di supporto a 12 pozzetti in plastica Netwell</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>per inserti a membrana in rete di poliestere da 15 mm</td>Kit</tr><tr><td>Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Diaminobenzidina tetracloridrato idrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>cancerogeno, sensibile alla luce</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; richiede il recupero dell'epitopo</td></tr><tr><td>Coniglio &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Sistemi sinaptici</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG di capra (H+L) &alpha;-GFP</td><td>Anticorpi Acris</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>IgG1 di topo &alfa;-nestina</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; richiede il recupero dell'epitopo</td></tr><tr><td>IgG di porcellino d'India (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG2a di ratto &alpha;- BrdU (ascite)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>per la rilevazione di BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Rat IgG2a &alpha;-BrdU (purificato)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>per il rilevamento di CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>IgG1 di topo &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG1 di topo&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Per il rilevamento di IdU; DAB 1:500/IF 1:350<</td></tr><tr>td colspan="4">Anticorpi secondari</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-cavia IgG (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-ratto IgG (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-topo IgG (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra &alfa;-ratto IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-capra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-topo IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-topo IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-porcellino d'India IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-ratto IgG (H+L)-Rosso Rodamina-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-coniglio IgG (H+L)-Rosso Rodamina-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Asino &alfa;-porcellino d'India IgG (H+L)-Rosso Rodamina-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidina-rodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra &alpha;-coniglio IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, funziona solo con coniglio &alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sonde molecolari</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonde molecolari</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Blocking </td></tr><tr><td>Fab-fragment d'asino &alpha;-topo IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-fragment d'asino &alpha;-coniglio IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Siero normale di coniglio</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero normale di capra</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>sostituto non tossico dello xilene</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>mezzo</td></tr> <tr>di montaggio permanente<td colspan="4">Microscopia</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td> Microscopia <td></td><td></td><td>Carl Zeiss</td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Microscopia Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo studio adulti ippocampale neurogenesi

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Neurogenesi adulta è altamente regolamentato, processo a più stadi, in cui nuovi neuroni sono generati da una cellula staminale neurale attivato via sempre più impegnati sottotipi progenitrici intermedi. Ciascuno di questi sottotipi esprime un insieme di marcatori molecolari specifici, nonché criteri morfologici specifici, possono essere utilizzati per la loro identificazione. In genere, vengono applicate le tecniche di immunofluorescenza coinvolge anticorpi specifici del sottotipo in combinazione con indicatori di proliferazione exo- o endogeni. Siamo qui descriviamo immunomarcatura metodi per il rilevamento e la quantificazione di tutte le fasi di adulti neurogenesi ippocampale. Questi comprendono l&#39;applicazione di analoghi della timidina, perfusione transcardial, lavorazione dei tessuti, calore indotta recupero epitopi, ABC immunoistochimica, multiple immunofluorescenza indiretta, microscopia confocale e quantificazione delle cellule. Inoltre, vi presentiamo un protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo che elude problemi usually derivanti dalla necessità di utilizzare anticorpi primari sollevati nella stessa specie ospite. Esso permette una accurata identificazione di tutti i sottotipi progenitrici ippocampali insieme con un marcatore di proliferazione all&#39;interno di una singola sezione. Queste tecniche sono un potente strumento per studiare la regolazione di diversi sottotipi progenitrici in parallelo, il loro coinvolgimento in patologie cerebrali e il loro ruolo nelle funzioni cerebrali specifiche.

Abbiamo applicato i metodi sopra descritti per quantificare e caratterizzare cellule neonate nei postnatale e adulta ippocampo. Pertanto, abbiamo utilizzato di tipo selvatico e neurogenesi-carente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 topi alloggiati in condizioni note per influenzare il tasso di neurogenesi (cioè, ambiente arricchito, EE) 13,14. La colorazione immunoistochimica DAB contro uno Ki67, BrdU, CldU o Idu costantemente rivelato differenze di numero di cellule neonati tra tipo selvatico ...

Questo articolo video illustra un protocollo completo per rilevare e quantificare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta all'interno della stessa sezione di tessuto. Abbiamo elaborato un metodo per superare i limiti dell'immunofluorescenza multipla indiretta che si verificano quando non sono disponibili anticorpi adatti da diverse specie ospiti.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

L'obiettivo generale di questa procedura è aggirare i limiti dell'immunofluorescenza indiretta nello studio delle cellule progenitrici neurali, quando anticorpi primari adatti provenienti da specie ospiti diverse non sono disponibili. Inizialmente, viene iniettato un analogo della timidina per etichettare le cellule in divisione, dopodiché il tessuto viene prelevato, processato e tagliato in sezioni crio.Quindi si inizia con l'immunofluorescenza multiplex sequenziale. Viene applicato un anticorpo primario non marcato, che viene successivamente riconosciuto da un anticorpo secondario marcato con un fluorocromo. Successivamente, i siti aperti del primo anticorpo secondario vengono bloccati con siero della specie dell'anticorpo primario, e tutte le immunoglobuline che potrebbero essere riconosciute dal secondo anticorpo secondario vengono saturate con frammenti Fab non coniugati.Questo consente di trattare il tessuto con un secondo anticorpo primario, che può essere marcato da un diverso anticorpo secondario. In definitiva, le immagini delle sezioni vengono utilizzate per studiare lo sviluppo e la regolazione delle cellule progenitrici neurali in risposta a stimoli specifici e il loro coinvolgimento in particolari funzioni cerebrali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza multipla simultanea, è che evita i problemi solitamente derivanti dalla necessità di utilizzare anticorpi primari prodotti nella stessa specie ospite.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurogenesi adulta, come la proliferazione di sottogruppi di progenitori ippocampali in risposta a stimoli fisiologici o farmacologici, patologie cerebrali o all'invecchiamento. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché l'etichettatura multipla con anticorpi primari provenienti dalla stessa specie ospite potrebbe causare attività incrociate indesiderate degli anticorpi in assenza di un blocco adeguato. Per prima cosa, pesare gli animali da iniettare e preparare una soluzione madre fresca di analogo della timidina a 10 milligrammi per millilitro per l'iniezione.Quando la soluzione è pronta, preparare una dose aggiustata in base al peso in una siringa per dosaggio preciso con ago da 30 gauge. Quindi immobilizzare il topo sollevandolo per la nuca e iniettare l'analogo della timidina per via intraperitoneale al tempo desiderato; anestetizzare profondamente il topo e praticare una perfusione transcardiale. Perfundere con 10 millilitri di PBS freddo ghiacciato, seguiti da 40 millilitri di soluzione fresca di formaldeide fredda ghiacciata.Quindi dissezionare il cervello e fissarlo nello stesso fissativo dopo la fissazione. Incubare i cervelli raccolti per 24 ore in saccarosio al 10% a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire i cervelli in saccarosio al 30% e incubare per ulteriori 48 ore.Con i cervelli pronti per la crioprotezione, congelarli nell'isopentano a meno 25 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare un criostato per tagliare sezioni coronali di 40 micron per la conservazione a lungo termine. Trasferire le sezioni in una soluzione antigelo e mantenerle a meno 20 gradi Celsius.Iniziare trasferendo i campioni dalla soluzione antigelo al TBS utilizzando un pennello fine. Lavare accuratamente i campioni, cominciando con un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, seguita da cinque lavaggi di 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Tutte queste incubazioni devono essere effettuate con agitazione delicata e continua.Se uno degli antigeni di interesse è un analogo della timidina, a questo punto è necessario eseguire un'incubazione con acido cloridrico per la denaturazione, seguita da un passaggio di neutralizzazione in buffer bore. Procedere quindi con la permeabilizzazione e il blocco dei siti di legame anticorpale non specifici in TBS plus. Lasciare incubare per un'ora a temperatura ambiente, quindi incubare nel primo anticorpo primario diluito in TBS plus durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.Lavare le sezioni tre volte in TBS e una volta in TBST. Lasciare ogni bagno per 10 minuti. Successivamente, incubare con il primo anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo per tre ore a temperatura ambiente.Da questo momento in poi, proteggere i preparati dall'esposizione alla luce. Dopo un ulteriore ciclo di lavaggi, trasferire i preparati in una soluzione di siero 10% della specie ospite in cui sono stati prodotti i due anticorpi primari. Incubare i preparati in questa soluzione per tre ore al fine di saturare i legami liberi sul primo anticorpo secondario.Risciacquare successivamente tre volte in TBS e una volta in TBST per rimuovere il siero. Preparare quindi una soluzione di TBS più 50 microgrammi per millilitro di frammenti Fab monovalenti non coniugati diretti contro la specie ospite dell'anticorpo primario. Questo copre gli epitopi che altrimenti potrebbero essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario.Trasferire i preparati in questa soluzione e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare i preparati almeno tre volte in TBS e una volta in TBST. Durante i trasferimenti, tamponare gli inserti a rete contenenti i preparati su un tovagliolo di carta per rimuovere i residui di fab.Ora incubare i preparati nel secondo anticorpo primario tutta la notte a quattro gradi Celsius. Dopo un'altra serie di lavaggi, applicare il secondo anticorpo secondario per tre ore a temperatura ambiente. Infine, lavare i preparati tre volte in TBS e procedere con il montaggio dei preparati su gelatina.Fare asciugare all'aria i vetrini e coprirli con un mezzo di montaggio ANTIFA. Osservare le sezioni marcate con fluorescenza al microscopio confocale a scansione laser. Acquisire stack di immagini in posizioni casuali lungo tutta l'estensione del giro dentato a un ingrandimento di 400 volte.Analizzare almeno 50 cellule di interesse selezionate casualmente per emisfero per la co-etichettatura dei diversi marcatori. Per calcolare i numeri assoluti di specifiche popolazioni di cellule neonate, moltiplicare le percentuali di cellule co-etichettate per il numero totale di cellule neonate stimato dall'analisi della colorazione con DAB. I metodi descritti sono stati utilizzati per quantificare e caratterizzare le cellule neonate nell'ippocampo postnatale e adulto di un ciclo con deficit di neurogenesi.Il modello murino knock-out per D, con colorazione DAB contro diversi marcatori di proliferazione come KI 67 o BRDU, ha rivelato in modo costante differenze nel numero di nuove cellule tra topi di tipo selvatico e topi knock-out. Le nuove cellule marcate con BRDU potevano essere fenotipizzate mediante un protocollo convenzionale di immunofluorescenza multipla, applicando simultaneamente anticorpi primari contro B-R-D-U, G-F-A-P, nestina in GFP e doublecortina. Ciò ha permesso l'identificazione con successo di nuove cellule progenitrici di tipo uno, tipo due A, tipo due B e tipo tre all'interno di un singolo campione.In alternativa, con intervalli di tempo più lunghi tra l'iniezione di BRDU e il sacrificio dell'animale, il numero finale di neuroni appena formati potrebbe essere analizzato mediante una colorazione immunoistochimica simultanea per BRDU e per nuovi marcatori. Il protocollo di marcatura immunoistochimica sequenziale ha funzionato perfettamente se le sezioni venivano prima incubate contemporaneamente con anticorpi anti-KI-67 da coniglio, anti-GFP da capra e anti-doublecortin da cavia, e successivamente con l'anticorpo anti-GFAP da coniglio, ma non viceversa. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare fino a quattro antigeni diversi in una singola sezione di tessuto utilizzando anticorpi primari prodotti nello stesso ospite.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di includere controlli appropriati per eliminare la possibilità di reazioni crociate dell'anticorpo o di falsi positivi. Si tenga presente che la sequenza delle incubazioni con l'anticorpo primario potrebbe influenzare notevolmente l'esito del protocollo.

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Il video illustra un metodo di colorazione in immunofluorescenza utilizzato per esaminare la neurogenesi nell'ippocampo adulto. Inizialmente, una sezione cerebrale di topo viene sottoposta a trattamento con anticorpi primari diretti contro le proteine marcatrici associate alla neurogenesi nelle cellule progenitrici neuronali. Successivamente, viene marcato con anticorpi secondari marcati con fluorofori. La sezione cerebrale viene quindi osservata al microscopio confocale per distinguere vari...

Una tecnica di colorazione in immunofluorescenza per rilevare la neurogenesi dell'ippocampo adulto

Questo video mostra la procedura per colorare le cellule staminali neurali appena proliferate in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando l'incorporazione di EdU, seguita dall'immunofluorescenza per visualizzare proteine specifiche, migliorando la comprensione della dinamica cellulare e della proliferazione.

Colorazione in immunofluorescenza per la visualizzazione di cellule staminali neurali proliferate in sezioni cerebrali di topo

La localizzazione e la distribuzione delle proteine ​​forniscono informazioni importanti per la comprensione delle loro funzioni cellulari. La superiore risoluzione spaziale di microscopia elettronica (EM) può essere utilizzato per determinare la localizzazione subcellulare di un dato antigene immunoistochimica seguito. Per tessuti del sistema nervoso centrale (CNS), preservando l'integrità strutturale mentre antigenicità mantenendo è stato particolarmente difficile in studi EM. Qui, si adotta...

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Durante la neurogenesi dell'ippocampo adulto, un insieme distinto di marcatori genetici viene espresso quando una cellula staminale neurale quiescente progredisce in sequenza e si sviluppa in un neurone funzionalmente integrato nel circuito. Utilizzando il recupero dell'antigene indotto dal calore, i tipi di cellule progenitrici che altrimenti sarebbero difficili da rilevare vengono identificati con maggiore efficacia.

Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare la colorazione immunoistochimica del cervello dei roditori, utilizzando come esempio marcatori per microglia ed elementi neuronali.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Descriviamo un protocollo immunoistochimica per studiare il profilo di attivazione dei neuroni dell'ippocampo seguito dell'esposizione ad un compito di apprendimento spaziale in un modello murino caratterizzato da deficit cognitivi di origine dello sviluppo neurologico. Questo protocollo può essere applicato a entrambi i modelli murini genetici o farmacologici caratterizzati da deficit cognitivi.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un approccio per l'analisi del comportamento delle cellule staminali/progenitrici neurali adulte in risposta alla manipolazione chemiogenetica di uno specifico circuito neurale locale.

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Questo articolo presenta quattro delle tecniche più comuni per visualizzare le cellule BrdU positive per misurare la neurogenesi adulta nei ratti. Questo lavoro include istruzioni per la preparazione del reagente, la somministrazione di analoghi della timidina, la perfusione transcardica, la preparazione dei tessuti, la reazione immunoistochimica della perossidasi, l'immunofluorescenza, l'amplificazione del segnale, la controcolorazione, l'imaging al microscopio e l'analisi cellulare.

Tecniche di immunoistochimica per analizzare la proliferazione cellulare e la neurogenesi nei ratti utilizzando l'analogo della timidina BrdU

Qui, il protocollo descrive come eseguire l'immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno. Inoltre, può includere il terzo anticorpo di un ospite diverso in questo protocollo. Questo approccio può essere fatto in qualsiasi tipo di cellula e agenti patogeni.

Immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi della stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Scopri un protocollo di immunoistochimica sequenziale per rilevare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta in una singola sezione tissutale, superando le limitazioni degli anticorpi della stessa specie ospite.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

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