Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

L'obiettivo generale di questo video è descrivere come preparare il terreno condizionato osseo e testarne l'attività in vitro. Ciò si ottiene raccogliendo prima i frammenti di osso da una mandibola di maiale utilizzando un raschietto per ossa. Il secondo passo consiste nel trattare termicamente, demineralizzare o non fare nulla ai frammenti ossei prima di incubarli in terreno di coltura per 24 ore.

Successivamente, viene raccolto il terreno condizionato osseo contenente tutti i fattori rilasciati dai frammenti ossei. La fase finale consiste nello stimolare le cellule con il terreno condizionato all'osso o nel preincubare un biomateriale con il terreno condizionato all'osso e le cellule seme su di esso dopo il periodo di incubazione. In definitiva, la PCR quantitativa in tempo reale viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule dopo il trattamento.

L'utilizzo di innesti ossei autologhi da soli o in combinazione con altri biomateriali stimola la rigenerazione ossea nei difetti ossei perimplantari, garantendo così buoni risultati a lungo termine. Questo video presenta un biotest in vitro, utile per determinare la risposta genetica delle cellule massali alle biomolecole in condizioni ossee. Il medium può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei traumi maxillo-facciali e dentali, come ad esempio il motivo per cui l'osso autologo è l'obiettivo dell'innesto standard nella rigenerazione ossea.

La preparazione del terreno condizionale da osso lavorato, come l'autoinnesto osseo trattato termicamente o la matrice ossea izzata, può essere difficile da standardizzare. Pertanto, è importante essere precisi. Per iniziare, procuratevi delle mandibole di maiale fresche da un macellaio locale e posizionatele su una superficie solida.

Successivamente, utilizzare un periostio per rilasciare un lembo di periostio a tutto spessore, prestando particolare attenzione a non lasciare alcun tessuto molle attaccato all'osso. Una volta rimosso il periostio, afferrare saldamente il raschietto osseo e utilizzare movimenti lunghi per raccogliere i frammenti ossei dal lato vestibolare della mandibola. Scartare tutti i frammenti di osso di lunghezza inferiore a un millimetro.

Evitare che i frammenti di ossa si secchino coprendoli rapidamente con terreno di coltura in una capsula di Petri di 10 centimetri. Dopo aver raccolto un numero sufficiente di frammenti di ossa, preparare un lotto di controllo termico pastorizzando cinque grammi di frammenti di ossa. Pastorizzare le patatine scaldandole per 30 minuti a 80 gradi Celsius o sterilizzarle in autoclave per 20 minuti a 121 gradi Celsius.

Successivamente, preparare un controllo demineralizzato aggiungendo cinque grammi di frammenti di osso in una soluzione monomolare di acido cloridrico e posizionandoli su uno shaker per quattro-sei ore a quattro gradi Celsius. Quindi lavare ripetutamente i frammenti di osso con terreno di coltura fino a raggiungere un pH neutro. Mettere cinque grammi di chips di ossa fresche e cinque grammi di ciascuna delle preparazioni di controllo in piatti separati e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura fresco a ciascun piatto.

Quindi incubare i campioni in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius per 24 ore al fine di creare il terreno condizionato il giorno successivo. Rimuovere il supporto da ogni piatto e metterlo in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il terreno condizionato con osso a 200 volte la gravità per 10 minuti per rimuovere eventuali detriti.

Quindi rimuovere il surnatante e passarlo attraverso un filtro sterile da 0,2 micron, conservare i quad di Ali congelati a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari. Inizia seminando cellule mesenchimali umane come cellule ossee o fibroblasti dei legamenti gengivali e parodontali in una piastra da 12 balene a una concentrazione di 30.000 cellule per centimetro quadrato. Copri le cellule con il terreno di coltura e lascia che le cellule si attacchino alla piastra durante la notte del mattino successivo.

Scartare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Quindi stimolare le cellule aggiungendo un terreno di coltura privo di siero preriscaldato con e senza il 20% di terreno condizionato con osso. Se si verifica anche la capacità di assorbimento di un biomateriale, aggiungere il terreno condizionato all'osso, compresi eventuali controlli, alle provette contenenti il biomateriale di interesse, e incubare le provette a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi sciacquare energicamente il biomateriale con PBS preriscaldato e seminare cellule mesenchimali umane a una concentrazione di 30.000 cellule per centimetro quadrato sul materiale. Incubare le cellule da sole o quelle seminate sui biomateriali in un'atmosfera umidificata a 37 gradi CS per 24 ore. Quindi scartare il terreno di coltura.

Sciacquare le cellule con PBS preriscaldato ed estrarre l'RNA delle cellule utilizzando un protocollo standard di isolamento dell'RNA. Una volta isolato l'RNA, preparare i campioni di CD NA di ciascun gruppo di trattamento iniziando con concentrazioni uguali dell'RNA estratto ed eseguendo una reazione di trascrittasi inversa su ciascun campione. Quindi eseguire la PCR quantitativa in tempo reale sui campioni per cercare i livelli dei geni selezionati utilizzando i primer e le condizioni elencate nel protocollo di testo allegato.

Infine, calcolare la qualità del terreno condizionato osseo in base ai livelli di espressione genica relativa normalizzando i livelli di soglia del ciclo dei geni al gene di housekeeping Gabb dh utilizzando il metodo delta delta CT. Ecco alcuni risultati tipici che mostrano i cambiamenti nell'espressione genica dei fibroblasti orali esposti a terreno condizionato osseo per 24 ore. Due geni, adrenalina e pent trax e tre, sono stati entrambi significativamente sottoregolati al 40% dei livelli originali, mentre le interleuchine 11 e 33, insieme alla N-A-D-P-H ossidasi quattro e al proteglicano quattro, sono stati tutti sovraregolati fino a 200 volte.

È interessante notare che le membrane barriera al collagene utilizzate per proteggere i frammenti ossei dai tessuti molli circostanti assorbono gran parte del mezzo condizionato osseo che è responsabile dei cambiamenti nell'espressione genica. Le membrane di collagene, tuttavia, non sono riuscite ad assorbire i fattori che controllano l'espressione dell'interleuchina 33. Pertanto, l'espressione dell'interleuchina 33 non è regolata in questo contesto.

Il protocollo qui descritto può essere adattato per studiare la risposta di diversi tipi di cellule che coinvolgono la rigenerazione ossea. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per preparare il terreno di coltura dall'osso di processo e da altri riempitivi ossei. La rilevanza clinica di questo biotest rimane poco chiara.

La risposta cellulare al BCM in vivo è probabilmente più complessa e include un ampio spettro di geni e diverse cellule bersaglio che estendono quelle qui presentate. Tuttavia, il nostro biotest fornisce le prime informazioni sulla composizione presumibilmente complessa delle molecole di RAF ossee e sulla risposta cellulare in vitro.