Name: Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Impara la preparazione del mezzo condizionato osseo e il bioassay in vitro per studiare la biologia ossea. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica cellulare mediante PCR in tempo reale.

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Gli autori desiderano ringraziare Catherine Solioz per la sua abile assistenza.

1. BCM Preparazione <ol><li> Ottenere mandibole maiale dal macellaio locale più fresco possibile. Mettere le mandibole su una superficie stabile e rilasciare un lembo a spessore completo con particolare attenzione a non lasciare alcuna tessuti molli o periostio attaccato all&#39;osso. Lavorare in un ambiente pulito senza la necessità di lavorare sotto cappa a flusso. </li><li> Una volta che un lembo a spessore completo viene rilasciato, utilizzare un raschietto osso per raccogliere i frammenti ossei dal lato vestibolare. Si prega di notare che il raschietto osso deve essere forte. Maneggiare con forza il raschietto osso e con lunghi movimenti raccogliere l&#39;osso. Eliminare frammenti ossei più piccoli che 1 mm. <ol><li> Per mantenere frammenti ossei nativi, inserire direttamente i frammenti ossei in piatti di plastica di 10cm di diametro medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 1% antibiotici e antimicotici, non consentendo loro di asciugarsi. </li><li> Per valutare l&#39;impatto di trattamento termico, frammenti ossei soggette alla pastorizzazione per 30 minuti a 80 ° C oautoclave per 20 minuti a 121 ° C. </li><li> Per valutare l&#39;impatto di demineralizzazione, agitare frammenti ossei in 1 M HCl per 4-6 ore a 4 ° C e lavare ripetutamente con terreno di coltura fino a pH neutro. </li></ol></li><li> Inserire un totale di 5 g di schegge ossee per 10 ml DMEM fresco supplementato con 1% di antibiotici e antimicotici in un nuovo piatto di plastica. </li><li> Porre le capsule in plastica in atmosfera umidificata a 37 ° C per 24 ore. Poi, vendemmia BCM. Centrifugare il BCM a 200 g per 10 minuti per rimuovere i detriti, filtrarlo sterile (0,2 nm), e mantenere aliquote congelate a -80 ° C. </li><li> Scongelare il BCM azione immediatamente prima dell&#39;uso ed evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. </li><li> Per gli esperimenti indicati, immergere membrane di collagene con terreno BCM o privo di siero per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare vigorosamente le membrane con PBS e metterli in piastre da 96 pozzetti. Le membrane Wet sono seminati con le cellule. </li><li> Processo di preparazione BCM è riassunto in Figura 1. </li&gt; </ol> 2. Bioassays Sulla base di cellule mesenchimali <ol><li> Cellule mesenchimali umane seme (per esempio cellule ossee, gengivale e fibroblasti legamento periodontale) in un 12-pozzetti con una concentrazione di 30.000 cellule / cm 2. Per seminare le cellule utilizzano terreno di coltura costituito da DMEM, siero fetale bovino al 10% e antibiotici. Lasciate che le cellule si attaccano alla piastra O / N. </li><li> Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS pre-riscaldato a 37 ° C. Stimolare le cellule aggiungendo pre-riscaldato terreno privo di siero coltura con e senza il 20% BCM. Collocare le celle in atmosfera umidificata a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Eliminare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldata ed estrarre l&#39;RNA secondo il vostro protocollo preferito. </li><li> Regolare la concentrazione di RNA in modo da avere la stessa quantità di RNA in ciascun campione. Preparare cDNA ed eseguire una qRT-PCR per analizzare i geni selezionati utilizzando i primers riportati in Tabella 1. NOTA: Queste sono le diluizioni di ogni componente: 2x SYBR verdi, 20x primer forward, 20x primer reverse, 5x acqua DD sterile, 5x cDNA. Il qRT-PCR viene eseguita in 40 cicli di 95 ° C 15 sec e 60 ° C 1 min. </li><li> Calcolare i livelli di espressione relativi normalizzando al gene housekeeping GAPDH utilizzando il metodo Δ (ΔCt) dove ΔCT è bersaglio CT - CT GAPDH e Δ (ΔCT) è ΔCT stimolata - ΔCT controllo. </li><li> Dopo questo controllo di qualità, aggiungere BCM al terreno di coltura per stimolare tutti i tipi di cellule, incluse le cellule mesenchimali, cellule ematopoietiche o cellule endoteliali. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Jordi Caballé-Serrano ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondazione of Dental Research and Education, Basilea, Svizzera.

Medio-Bone condizionata riflette l&#39;attività rilasciata di innesti ossei durante le prime fasi di rigenerazione ossea. Il protocollo qui descritto può essere adattato per studiare la risposta di diversi tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per preparare medium condizionato da riempitivi osso o osso trasformati. I metodi sono facili da eseguire e si basano su un concetto semplice: i fattori rilasciati da varie all&#39;osso autologo ed elaborati. Capire come ...

Osso autologo è ampiamente utilizzato per colmare difetti che si sono verificati in conseguenza di malformazioni, resezione chirurgica, chirurgia ricostruttiva trauma, e prima dell&#39;impianto posizionamento 1,2. Comprendere i principi biologici di come innesti ossei sostenere il processo di consolidamento del trapianto non è solo la chiave per capire il motivo per cui autologhi sono considerati il gold standard in chirurgia ricostruttiva, è anche bionico per la migliore progettazione di sostituti ossei 3. Eppure, il consolidamento del trapianto è più veloce con osso autologo rispetto alle sostituti ossei 4,5. Pertanto, è imperativo rivelare i meccanismi cellulari e molecolari che rendono osso autologo in modo efficace per sostenere la rigenerazione ossea. Tre sono le caratteristiche da manuale di autoinnesti che sono considerati a sostenere il processo di consolidamento 6,7. In primo luogo, osso autologo è osteoconduttivo, fornendo una guida per l&#39;osso neoformato di crescerenel difetto. In secondo luogo, osso autologo è osteogenico, il che significa che contiene cellule mesenchimali che possono differenziarsi in osteoblasti 8. In terzo luogo, osso autologo è osteoinduttiva come fattori di crescita come le proteine ​​morfogenetiche ossee sepolti nella matrice possono avviare il processo di endocondrale o addirittura la formazione di osso intramembranosa 9. C&#39;è un altro aspetto: frammenti ossei preparati al momento in possesso di una funzione paracrina sulla base delle osservazioni in vitro con &quot;medio-bone condizionata&quot; 10-15. Inoltre l&#39;impatto di mielopoiesi va detto 16. Un termine simile &quot;medio-matrice ossea demineralizzata condizionata&quot; è già coniato nel 1996 e sostiene il concetto generale di una funzione paracrina di osso, anche se elaborati da demineralizzazione 17. Per i nostri scopi, BCM può essere preparato da maiale fresca mandibole 10,11. Analisi proteomica di BCM ha rivelato la composizione complessa, tra cui effetti di crescitaors e componenti della matrice extracellulare 10, estendendo anche la conoscenza esistente sulla proteasoma di osso intero 18,19. Così, BCM dovrebbe riflettere l&#39;attività rilasciata di varie modifiche di innesti ossei in vitro. Cosa accade quando le cellule mesenchimali, per esempio quelli isolati da frammenti ossei o da tessuto molle orale, sono esposti a BCM? In vitro, BCM riduce osteogenico e differenziazione adipogenico, e provoca un forte aumento di espressione IL11 11. Genomica microarray rivelato più geni da esprimere differenziale in cellule mesenchimali in risposta a BCM. Tra questi geni sono adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH ossidasi 4 (NOX4), proteoglicani 4 (PRG4, o lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM ottenuto da frammenti ossei autoclave riuscito a cambiare l&#39;espressione dei rispettivi geni 14. BCM da frammenti ossei sottoposti a pastorizzazione e di congelamento è stato in grado dimodificare l&#39;espressione genica 14. Mezzo anche condizionata di matrice ossea demineralizzata (DBM-CM) cambia l&#39;espressione di TGF-β-regolati geni 20. È interessante notare che, membrane barriera di collagene usato per schermare i frammenti ossei dal tessuto molle circostante 21,22, assorbiti dalle parti del BCM che sono responsabili per i cambiamenti nell&#39;espressione genica 23. Ricerca BCM può essere estesa ad altri tipi di cellule coinvolte nella rigenerazione ossea come osteoclasti riassorbono l&#39;osso e le cellule endoteliali, per citarne alcuni. Nel complesso, i dati di accumulo in vitro forniscono la base scientifica per la progettazione di uno studio preclinico. Il presente protocollo è duplice: in primo luogo, si mostra come preparare BCM. In secondo luogo, mostra come testare la sua attività biologica a base di cellule mesenchimali in vitro.

<table><tbody><tr><td>Mandibole di maiale</td><td>Bucher</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Raschietto per ossa</td><td>Hu-Friedy</td><td>PPBUSE2/36</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici & Antimicotici</td><td>All life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Membrane di collagene (Bio-Gide)</td><td>Geistlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero di vitello</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>16030074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td> Kit di isolamento dell'RNA puro</td><td>Roche</td><td></td> 11828665001 <td></td></tr><tr><td>Transcriptor First Kit di sintesi di cDNA a filamento</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Primer Microsynth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Verde (per Q-RT-PCR)</td><td>Roche</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche 11666789001</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bone mezzo condizionato: preparazione e bioassay

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Innesti ossei autologhi sono ampiamente utilizzati in chirurgia orale e maxillofacciale, ortopedia, traumatologia e. Innesti ossei autologhi non solo sostituire l&#39;osso mancante, ma anche sostenere il complesso processo di rigenerazione ossea. Questo comportamento favorevole autoinnesti è attribuita a tre caratteristiche: osteoconduttività, osteogenicity e osteoinduttività. Tuttavia, c&#39;è un altro aspetto: Bone Innesti rilasciare una miriade di molecole, tra cui i fattori di crescita, che può indirizzare le cellule mesenchimali coinvolte nella rigenerazione ossea. Le proprietà paracrini di innesti ossei possono essere studiati in vitro con l&#39;uso del mezzo-bone condizionata (BCM). Qui vi presentiamo un protocollo su come preparare medie osso condizionata da nativo corticale maiale osso, e l&#39;osso che ha subito trattamenti termici o demineralizzazione. Le celle possono essere direttamente esposti alla BCM o seminate su biomateriali, come membrane di collagene, precedentemente ammollati con BCM. Noi diamo esempi in vitro bioassays con cellule mesenchimali sull&#39;espressione di TGF-β geni regolati. I protocolli presentati dovrebbero incoraggiare a rivelare ulteriormente gli effetti paracrini di innesti ossei durante la rigenerazione ossea e aprire un percorso per la ricerca traslazionale nel vasto campo della chirurgia ricostruttiva.

Bone media condizionata è preparato da freschi frammenti ossei suina. Panoramica generale del processo per preparare BCM e utilizzare biomateriali in combinazione con BCM è mostrato in Figura 1 e Figura 2 rispettivamente. Durante la preparazione BCM, è importante ottenere grandi frammenti ossei con movimenti lunghi come brevi movimenti o molto piccoli frammenti ossei può influenzare la qualità del BCM finale. Qualità di BCM può essere controllata analizzando l&#39;espressione genica di ...

Descriviamo qui come preparare a medio-bone condizionata (BCM) e testare la sua attività in vitro.

Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

L'obiettivo generale di questo video è descrivere come preparare il terreno condizionato osseo e testarne l'attività in vitro. Ciò si ottiene raccogliendo prima i frammenti di osso da una mandibola di maiale utilizzando un raschietto per ossa. Il secondo passo consiste nel trattare termicamente, demineralizzare o non fare nulla ai frammenti ossei prima di incubarli in terreno di coltura per 24 ore.Successivamente, viene raccolto il terreno condizionato osseo contenente tutti i fattori rilasciati dai frammenti ossei. La fase finale consiste nello stimolare le cellule con il terreno condizionato all'osso o nel preincubare un biomateriale con il terreno condizionato all'osso e le cellule seme su di esso dopo il periodo di incubazione. In definitiva, la PCR quantitativa in tempo reale viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule dopo il trattamento.L'utilizzo di innesti ossei autologhi da soli o in combinazione con altri biomateriali stimola la rigenerazione ossea nei difetti ossei perimplantari, garantendo così buoni risultati a lungo termine. Questo video presenta un biotest in vitro, utile per determinare la risposta genetica delle cellule massali alle biomolecole in condizioni ossee. Il medium può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei traumi maxillo-facciali e dentali, come ad esempio il motivo per cui l'osso autologo è l'obiettivo dell'innesto standard nella rigenerazione ossea.La preparazione del terreno condizionale da osso lavorato, come l'autoinnesto osseo trattato termicamente o la matrice ossea izzata, può essere difficile da standardizzare. Pertanto, è importante essere precisi. Per iniziare, procuratevi delle mandibole di maiale fresche da un macellaio locale e posizionatele su una superficie solida.Successivamente, utilizzare un periostio per rilasciare un lembo di periostio a tutto spessore, prestando particolare attenzione a non lasciare alcun tessuto molle attaccato all'osso. Una volta rimosso il periostio, afferrare saldamente il raschietto osseo e utilizzare movimenti lunghi per raccogliere i frammenti ossei dal lato vestibolare della mandibola. Scartare tutti i frammenti di osso di lunghezza inferiore a un millimetro.Evitare che i frammenti di ossa si secchino coprendoli rapidamente con terreno di coltura in una capsula di Petri di 10 centimetri. Dopo aver raccolto un numero sufficiente di frammenti di ossa, preparare un lotto di controllo termico pastorizzando cinque grammi di frammenti di ossa. Pastorizzare le patatine scaldandole per 30 minuti a 80 gradi Celsius o sterilizzarle in autoclave per 20 minuti a 121 gradi Celsius.Successivamente, preparare un controllo demineralizzato aggiungendo cinque grammi di frammenti di osso in una soluzione monomolare di acido cloridrico e posizionandoli su uno shaker per quattro-sei ore a quattro gradi Celsius. Quindi lavare ripetutamente i frammenti di osso con terreno di coltura fino a raggiungere un pH neutro. Mettere cinque grammi di chips di ossa fresche e cinque grammi di ciascuna delle preparazioni di controllo in piatti separati e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura fresco a ciascun piatto.Quindi incubare i campioni in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius per 24 ore al fine di creare il terreno condizionato il giorno successivo. Rimuovere il supporto da ogni piatto e metterlo in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il terreno condizionato con osso a 200 volte la gravità per 10 minuti per rimuovere eventuali detriti.Quindi rimuovere il surnatante e passarlo attraverso un filtro sterile da 0,2 micron, conservare i quad di Ali congelati a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari. Inizia seminando cellule mesenchimali umane come cellule ossee o fibroblasti dei legamenti gengivali e parodontali in una piastra da 12 balene a una concentrazione di 30.000 cellule per centimetro quadrato. Copri le cellule con il terreno di coltura e lascia che le cellule si attacchino alla piastra durante la notte del mattino successivo.Scartare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Quindi stimolare le cellule aggiungendo un terreno di coltura privo di siero preriscaldato con e senza il 20% di terreno condizionato con osso. Se si verifica anche la capacità di assorbimento di un biomateriale, aggiungere il terreno condizionato all'osso, compresi eventuali controlli, alle provette contenenti il biomateriale di interesse, e incubare le provette a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi sciacquare energicamente il biomateriale con PBS preriscaldato e seminare cellule mesenchimali umane a una concentrazione di 30.000 cellule per centimetro quadrato sul materiale. Incubare le cellule da sole o quelle seminate sui biomateriali in un'atmosfera umidificata a 37 gradi CS per 24 ore. Quindi scartare il terreno di coltura.Sciacquare le cellule con PBS preriscaldato ed estrarre l'RNA delle cellule utilizzando un protocollo standard di isolamento dell'RNA. Una volta isolato l'RNA, preparare i campioni di CD NA di ciascun gruppo di trattamento iniziando con concentrazioni uguali dell'RNA estratto ed eseguendo una reazione di trascrittasi inversa su ciascun campione. Quindi eseguire la PCR quantitativa in tempo reale sui campioni per cercare i livelli dei geni selezionati utilizzando i primer e le condizioni elencate nel protocollo di testo allegato.Infine, calcolare la qualità del terreno condizionato osseo in base ai livelli di espressione genica relativa normalizzando i livelli di soglia del ciclo dei geni al gene di housekeeping Gabb dh utilizzando il metodo delta delta CT. Ecco alcuni risultati tipici che mostrano i cambiamenti nell'espressione genica dei fibroblasti orali esposti a terreno condizionato osseo per 24 ore. Due geni, adrenalina e pent trax e tre, sono stati entrambi significativamente sottoregolati al 40% dei livelli originali, mentre le interleuchine 11 e 33, insieme alla N-A-D-P-H ossidasi quattro e al proteglicano quattro, sono stati tutti sovraregolati fino a 200 volte.È interessante notare che le membrane barriera al collagene utilizzate per proteggere i frammenti ossei dai tessuti molli circostanti assorbono gran parte del mezzo condizionato osseo che è responsabile dei cambiamenti nell'espressione genica. Le membrane di collagene, tuttavia, non sono riuscite ad assorbire i fattori che controllano l'espressione dell'interleuchina 33. Pertanto, l'espressione dell'interleuchina 33 non è regolata in questo contesto.Il protocollo qui descritto può essere adattato per studiare la risposta di diversi tipi di cellule che coinvolgono la rigenerazione ossea. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per preparare il terreno di coltura dall'osso di processo e da altri riempitivi ossei. La rilevanza clinica di questo biotest rimane poco chiara.La risposta cellulare al BCM in vivo è probabilmente più complessa e include un ampio spettro di geni e diverse cellule bersaglio che estendono quelle qui presentate. Tuttavia, il nostro biotest fornisce le prime informazioni sulla composizione presumibilmente complessa delle molecole di RAF ossee e sulla risposta cellulare in vitro.

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Questo video dimostra la valutazione delle attivazioni multiple delle caspasi nei macrofagi derivati dal midollo osseo attraverso la stimolazione con il virus dell'influenza. Dopo la lisi dei macrofagi, l'inattivazione termica del lisato e la centrifugazione, le caspasi intracellulari vengono raccolte per la successiva analisi immunologica.

Valutazione dell'attivazione di caspasi multiple nei macrofagi

Questo video dimostra la produzione di terreno condizionato con oligodendrociti (OCM) da cellule di lignaggio di oligodendrociti stressandole per migliorare il loro rilascio molecolare nel terreno. Questo terreno, ricco di fattori di crescita, citochine e altre molecole bioattive, può essere aggiunto alle colture di neuroni per ottenere informazioni sull'impatto dei fattori secreti dagli oligodendrociti sulla fisiologia e sulla connettività neuronale.

Un metodo per la generazione di terreno condizionato con oligodendrociti

La piastra è una struttura fondamentale delle sviluppo del midollo spinale, che forniscono segnali diffusibili di progenitori e differenziazione dei neuroni. Descriviamo un metodo per produrre pavimento piatto mezzo condizionato, per applicarla al tessuto del midollo spinale fresco, e di valutare le conseguenze sulle proteine ​​di interesse da biochimica.

Cultura della Isolato Piastra di tessuti e la produzione di mezzo condizionato per valutare le proprietà funzionali del pavimento segnali piastra rilasciato

Questo manoscritto descrive un sistema modello ex vivo composto da terreni condizionati da organi derivati dal linfonodo, dalle ossa, dai polmoni e dal cervello dei topi. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e studiare fattori solubili derivati da organi e i loro effetti sul tropismo degli organi e sul comportamento metastatico delle cellule tumorali.

Generazione di Media e Applicazioni organo condizionata per lo studio Influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico Comportamento

Il numero di nuovi biomateriali ingegnerizzati per la riparazione di lesioni dell'osso grande è in continua espansione con l'obiettivo di migliorare la guarigione ossea e superare le complicazioni connesse con trapianto osseo. Qui, presentiamo una strategia multidisciplinare per test di biocompatibilità pre-clinico di biomateriali per riparazione ossea.

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.

Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Presentiamo un protocollo in due fasi per l'isolamento dei mitocondri di alta qualità che è compatibile con la scoperta e la quantificazione delle proteine su scala proteoma. Il nostro protocollo non richiede ingegneria genetica ed è quindi adatto per studiare i mitocondri da qualsiasi cellula e tessuto primario.

Isolamento dei mitocondri senza tag in due fasi per migliorare la scoperta e la quantificazione delle proteine

Questo video descrive un metodo per purificare Wolbachia pipientis da una linea di cellule Anopheles gambiae e poi la coltura endosymbiont nella cella senza medium. Un test per la vitalità del batterio è dimostrata.

Il mantenimento di Wolbachia in Cell-free medio

Impara la preparazione del mezzo condizionato osseo e il bioassay in vitro per studiare la biologia ossea. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica cellulare mediante PCR in tempo reale.

Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

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