Name: Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri l'arricchimento automatizzato di linfociti T specifici per Citomegalovirus mediante sistema di cattura delle citochine. Questo metodo produce cellule di grado clinico senza richiedere strutture GMP.

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Ringraziamo Miltenyi Biotec, Germania per aver fornito i reagenti e l'attrezzatura CliniMACS Prodigy per gli studi di valutazione. Ringraziamo George T. McNamara (Dipartimento di Pediatria, MD Anderson Cancer Center) per la correzione delle bozze del manoscritto. Sovvenzione: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Fondo Burroughs Wellcome; Istituto di prevenzione e ricerca sul cancro del Texas; Fondazione per la ricerca globale CLL; Tenuta di Noelan L. Bibler; Fondazione Gillson Longenbaugh; Harry T. Mangurian, Jr., Fondo per l'immunoterapia della leucemia; Istituto di Terapia Oncologica Personalizzata; Società per la Leucemia e il Linfoma; Fondazione per la ricerca sui linfomi; il Fondo di rete delle istituzioni sorelle di MDACC; Fondazione Miller; il signor Herb Simons; il signore e la signora Joe H. Scales; il signor Thomas Scott; Fondazione nazionale per la ricerca sul cancro; Fondazione per la ricerca sul cancro pediatrico; Fondazione per bambini William Lawrence e Blanche Hughes.

1. Preparazione dei materiali in condizioni sterili (vedi Materiali e attrezzature Table) <ol><li> Preparare 3 L di tampone PBS / EDTA supplementato con albumina sierica umana (HSA) a una concentrazione finale di 0,5% (w / v). </li><li> Preparare 1 L sacchetto di soluzione clinica grade 0,9% di cloruro di sodio (NaCl) e 2 L di grado GMP terreno di coltura cellulare. </li><li> Preparare 60 nmol di specifici antigeni CMV peptide cocktail ricostituendo un flaconcino di CMV pp65 con 8 ml di acqua sterile. </li><li> Trasferire CMV pp65 peptide cocktail in un sacchetto di congelamento di 50 volumi ml utilizzando un Luer / Spike interconnessione e pinza con bloccaggio pinze per evitare la successiva distribuzione del cocktail nel set di tubi. Aperto cella set di tubi di arricchimento (TS 500) in condizioni di sterilità. </li><li> Utilizzando sterili tubi saldatore, collegare borsa congelamento peptide cocktail in collegamento tubo per valvola 2 del set di tubi TS 500. Non aprire il morsetto per sacco peptide cocktail in questo momento. </li><li> Rimuovere 1 x 10 9 TNC avvio prodotto cellulare e sospendere in tampone PBS / EDTA contenente 2,5% HSA ad un volume totale di 50 ml. Iniettare il prodotto cellulare in una sacca di trasferimento 150 ml. </li></ol> 2. Preparazione e utilizzo delle cellule automatizzato di arricchimento del sistema (vedi Materiali e attrezzature Table) <ol><li> Accendere il sistema di arricchimento di cellule (Figura 1B) e selezionare il programma &quot;CCS_IFN-γ arricchimento&quot;. Osservare una interfaccia utente che mostra schermi con le istruzioni e le immagini che guidano l&#39;operatore attraverso la procedura. </li><li> Inserire il parametro &quot;Operatore&quot; e &quot;Set di tubi P / N No&quot;. Successivamente, installare il Set di tubi da 500 ad un arricchimento delle cellule automatizzato dispositivo secondo le istruzioni visualizzate sullo schermo del monitor interattivo. </li><li> Seguire le istruzioni passo passo visualizzate sullo schermo per collegare il medio e buffer per il dispositivo. Record numero di catalogo e il numero di lotto dei reagenti prima connecting allo strumento. </li><li> Dopo il controllo finale del set di tubi, aprire il morsetto della borsa peptide cocktail. Aprire la busta medio e avviare innesco automatico del set di tubi. </li><li> Dopo la fase di caricamento è completato, integrare HSA (2,5%) in tampone NaCl nel sacchetto serbatoio (200 ml) con l&#39;aiuto del tubo saldatore sterile. Trasferire il prodotto di partenza cellulare nella &quot;borsa Applicazione&quot; utilizzando il tubo saldatore sterile. </li><li> Collegare CCS (IFNγ) reagenti in rispettivo tubo tramite adattatori. Inserisci orario preferito per raccogliere una frazione del materiale cellulare prima di processo di arricchimento. Review e verificare l&#39;esattezza di tutti i dati / parametri inseriti. Avviare il processo. </li><li> Prima dell&#39;inizio del processo di arricchimento delle cellule automatizzato, rimuovere il sacchetto di Controllo Qualità (QCB, frazione originale (ori) contiene circa 1,3 ml su 100 ml di contenuto camera diluito con tampone PBS / EDTA). Sigillare il QCB, pesare, e conservare a 4 ° C. </li><li> Avviare il enrichmeprocesso nt. Alla fine del processo, cellule bersaglio vengono eluite con un volume di circa tampone di eluizione dal sacchetto serbatoio. </li><li> Sigillare il cellulare Sacchetto non Target (NTCB, frazione negativo = neg) e Cell obiettivo Bag (TCB, frazione positiva = pos) e pesare ogni sacchetto. I pesi saranno utilizzati successivamente per il calcolo del numero di cellule. </li><li> Immediatamente dopo la procedura di arricchimento raccogliere due aliquote per frazione per citometria a flusso, e memorizzare il resto dei campioni a 4 ° C. Utilizzare un&#39;aliquota campione per la determinazione numero di celle e l&#39;altra un&#39;aliquota del campione per l&#39;analisi delle prestazioni arricchimento (Tabella 1). </li><li> Rimuovere il set di tubi dallo strumento di arricchimento delle cellule. Trasferire il file di log di un drive USB per un utilizzo futuro. NOTA: Tutti i reagenti devono essere preparati in condizioni sterili. Si consiglia vivamente l&#39;uso di un biosicurezza tipo II cofano. Utilizzare aferesi prodotto cellulare di stato stazionario (non mobilitati) isolato da un sanoCMV-sieropositivi donatore per arricchire specifiche cellule T antigene CMV. Solo la FDA licenza HSA deve essere utilizzato. Il buffer per la preparazione delle cellule deve essere conservato a 19 ° C a +25 ° C, temperature ambiente inferiori o superiori si tradurrà in purezza ridotta e una resa ridotta delle cellule bersaglio. </li></ol> 3. Determinazione delle cellule Conte <ol><li> Prendete le aliquote di QCB, NTCB e TCB per la conta delle cellule, come indicato nella tabella 1. Aggiungere CD45-VoBlue a ciascuna aliquota (titolo 1,11) e incubare al buio per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di soluzione di lisi dei globuli rossi preparata di fresco (1x) alla frazione originale e la frazione negativo, 450 microlitri soluzione appena preparata di lisi dei globuli rossi alla frazione positiva, e incubare tutte le frazioni per 15 minuti a RT. </li><li> Appena prima dell&#39;analisi, aggiungere ioduro di propidio ad una concentrazione finale di 1 mg / ml (1: 100 di 100 mg di diluizione / ml). Utilizzare contatore di cellule automatico per determinare conteggio e vi cellacapacità. Utilizzare dispositivo contatore di cellule software consigliato per analisi di citometria a flusso. Determinare i conteggi assoluti di leucociti per frazioni originali, negativi e positivi. NOTA: Il numero di celle di leucociti vitali per ml dei campioni prelevati per l&#39;analisi conta delle cellule è determinata con il software analizzatore di cellule consigliato. </li><li> Impostare la regione come mostrato nella Figura 2 (regione 5, leucociti vitali). Utilizzare la seguente strategia di gating per determinare il conteggio delle cellule. Un leucociti vitali in frazione originale è mostrato in Figura 2. </li><li> Le regioni indicate (Figura 2, 1-6) sono gerarchicamente come segue: 1: Il tempo porta → 2: Singole cellule → 3: CD45 + cellule → 4: leucociti (detriti esclusa) → 5: leucociti vitali → 6: linfociti vitali </li><li> Ripetere gli stessi passaggi per determinare il conteggio delle cellule per le frazioni negativi e positivi. Calcolare il numero di cellule di tutta la frazioneconsiderando il fattore di diluente del campione e del volume totale della frazione (Tabella 2). </li></ol> 4. Esame della Performance separazione <ol><li> Lavare le aliquote di QCB, NTCB e cellule frazione TCB con pre-refrigerati tampone PBS / EDTA / siero AB 0,5%. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in miscela colorazione 100 l anticorpi fluorocromo contenente: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue e anti-IFNγ-PE (titolo 1:11) e incubare al buio per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di lisi dei globuli rossi preparata di fresco (1x) e incubare per 15 minuti a RT. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in un adeguato volume di PBS / EDTA Buffer / 0,5% AB Serum. </li><li> Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 mg / ml appena prima dell&#39;analisi (1: 100 dilutisu 100 mcg / ml). Eseguire analisi citofluorimetrica per valutare la purezza del campione. </li><li> Utilizzare la seguente strategia di gating per calcolare le cellule T CD3 + in percorribile strategia di gating leucociti per la determinazione delle cellule T CD3 + è mostrato nella frazione positiva dopo il processo di CCS arricchimento. Le regioni indicate (figura 3A e 3B, 1-6) sono gerarchicamente collegati come segue: 1: Tempo di cancello → 2: Singole cellule → 3: CD45 + cellule → 4: Cells (detriti esclusa) → 5: leucociti vitali → 6: CD3 + cellule vitali di popolazione </li><li> Determinare le frequenze di CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + IFN-γ + cellule T dopo processo di arricchimento CCS (Tabella 2). </li><li> Utilizzare la strategia di gating per determinare le frequenze di CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + cellule T IFN-γ + indicati di seguito fo (catturati) frazione positiva originale e arricchito dopo il processo di CCS. Le regioni indicate sono gerarchicamente collegati e denominati come segue: 1: Tempo di cancello → 2: Singole cellule → 3: CD45 + cellule → 4: Cells (detriti esclusa) → 5: I leucociti vitali → 6: CD3 + cellule vitali → 7: cellule CD4 + → 7a: CD4 + IFN-γ + celle (scatola) → 8: CD8 + cellule → 8a: + cellule CD8 + IFN-g (scatola) </li></ol> NOTA: I primi 6 regioni dei collegamenti gerarchia indicate sono le stesse di figura 3, (1-6) e l&#39;ultima 2 regioni sono mostrati in Figura 4 (6-8a).

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<li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li>
</ol>

Entrambi MD Anderson Cancer Center e il dottor Cooper hanno un interesse finanziario in ZIOPHARM Oncology, Inc., e Intrexon Corporation. Il 7 maggio 2015, il dottor Cooper è stato nominato Chief Executive Officer di ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper è ora un Visiting Scientist al MD Anderson. Dottor Cooper ha fondato e possiede InCellerate, Inc. Ha brevetti con Sangamo BioSciences con nucleasi artificiali. Svolge attività di consulenza con Targazyme, Inc. (cellule staminali precedentemente americane, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, e Bristol-Myers Squibb. Fa parte del comitato consultivo di Cellectis Scientifico. Egli riceve onorari da Miltenyi Biotec.

La terapia delle cellule T adottiva è emersa come una valida opzione per il trattamento di tumori a cellule B 4. Il suo potenziale terapeutico dipende infondendo il numero desiderato di specifiche cellule T antigene bersaglio privi replicativa senescenza 2. Ciò può essere ottenuto da sistemare una popolazione pura di cellule T specifiche antigene da cellule T espanse le vigenti buona fabbricazione. Due procedure di smistamento sono ampiamente utilizzati, vale a dire, la fluorescenza delle cellule a...

Il trapianto di cellule emopoietiche staminali (HSCT) 1 può essere combinato con la terapia delle cellule T adottiva per migliorare effetto graft-versus-tumorale e per fornire l&#39;immunità alle infezioni opportunistiche 2. Generazione di linfociti T del donatore-derivato antigene-specifiche per infusione è storicamente richiesto personale specializzato e l&#39;uso di strutture specializzate che sono GMP. La consegna di tali cellule T ha portato alla risoluzione di infezioni opportunistiche 3 e trattare il tumore di base 4. Recentemente, i ricercatori hanno dimostrato che il trasferimento adottivo di solo poche migliaia di cellule T virus-specifici (~ 1 x 10 4-2,5 x 10 5 cellule / kg di peso corporeo destinatario) in grado di trattare con successo le infezioni opportunistiche da CMV dopo HSCT allogenico 5-9. Un numero limitato di strutture GMP con relative esigenze produttive qualificati e gli alti costi associati con la produzione delle cellule ha, tuttavia, Restrl&#39;accesso dei pazienti alle itto promettenti terapie delle cellule T 10. Un approccio per isolare le cellule T antigene-specifiche è basata su CCS utilizzando un reagente specifico bi-riconoscere CD45 e IFN-γ. Come mostrato, questa metodologia può essere utilizzato per generare uso clinico cellule T specifiche per CMV impiegano un dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato CCS (Figura 1B). Cellule T specifiche per CMV sono generate incubando peptidi sovrapposti da pp65 CMV con le cellule leucoaferesi totale nucleari (TNC) da donatori CMV positivi. Questi peptidi, visualizzate nel contesto di leucociti antigene umano (HLA), attivare le cellule T specifiche CMV-PP65 nel TNC a secernere IFN-γ. Queste cellule T possono essere &quot;catturati&quot; e magneticamente separati. Il funzionamento del dispositivo di arricchimento delle cellule prima generazione (Figura 1A) richiesto personale specializzato in coltura in condizioni di GMP e coordinamento del personale di intraprendere le molteplici sTeps necessario generare un prodotto &quot;catturato&quot;. La procedura di richiesta tipicamente 10-12 ore di funzionamento continuo, e quindi il personale probabilmente bisogno di lavorare su due turni nella struttura GMP. Questi vincoli sono ora ovviato con l&#39;attuazione di un dispositivo di seconda generazione (Figura 1B). Questo dispositivo si impegna arricchimento magnetico, simile al dispositivo di prima generazione, ma automatizza altri aspetti delle CCS in un approccio unbreached. Questo riduce notevolmente l&#39;onere per la squadra GMP come la maggior parte delle fasi può essere realizzato senza sorveglianza da parte del personale. Inoltre, poiché il dispositivo opera come un sistema chiuso, le cellule T antigene-specifiche possono essere acquisiti e processati sul banco tranne le fasi isolatamente leucaferesi e preparazione dei materiali prima di avviare lo strumento. Dettagli della strumentazione completa e la funzionalità del dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione sono stati pubtuito 11. Qui, descriviamo la procedura per arricchire le cellule T specifiche per PP65 CMV da un prodotto aferesi steady-state utilizzando il sistema automatizzato CCS arricchimento delle cellule. Una volta isolato, queste cellule T specifiche per CMV possono essere immediatamente infuso in un paziente.

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L sacco</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr><tr><td>5 L sacchetto per rifiuti</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (umana) 25%&nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Interconnettore Luer/Spike</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Soluzione di NaCl (1 L)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per preparazioni iniettabili</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante MILLEX GV 0,22 &mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Medium 2 L sacca</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>Sacca di trasferimento, 150 ml (per materiale di partenza cellulare)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS Sacca di congelamento 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Siringhe, sterili</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Belgio</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Prodotto per aferesi sieropositiva CMV</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Materials</td><td>Manufacturer</td><td>Numero di catalogo</td><td></td></tr><tr><td>AB Serum, GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&gamma;-PE, umano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio (100 &micro; g/ml)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Manufacturer</td><td>Numero di catalogo</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo Prodigy CliniMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>Software V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Software 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5415R&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>Saldatrice per tubi sterile SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

arricchimento cellulare automatizzata di citomegalovirus specifici linfociti t per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Il trasferimento adottivo di cellule T specifiche per patogeno può essere usato per prevenire e curare le infezioni opportunistiche come il citomegalovirus (CMV) che si verificano dopo il trapianto allogenico di cellule staminali. Cellule T specifiche virali-da donatori allogenici, compresi donatori di terze parti, possono essere propagati ex vivo in conformità con le attuali buone prassi di fabbricazione (cGMP), impiegando ripetuti cicli di stimolazione antigenica-driven per propagare selettivamente le cellule T desiderate. L&#39;identificazione e l&#39;isolamento di cellule T antigene-specifiche possono essere effettuati anche in base al sistema di acquisizione di citochine di cellule T che sono state attivate a secernere gamma-interferone (IFN-γ). Tuttavia, diffusa applicazione umana del sistema di cattura di citochine (CCS) contribuire a ripristinare l&#39;immunità è stata limitata come il processo di produzione richiede tempo e richiede un operatore esperto. Lo sviluppo di un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione come CliniMACS Prodigy oraconsente agli investigatori di generare cellule T specifiche virali-con un sistema ad alta intensità di manodopera automatizzato, meno. Questo dispositivo separa magneticamente etichettati cellule dalle cellule senza etichetta utilizzando la tecnologia magnetica ordinamento delle cellule attivate per generare prodotti ad uso clinico, è stato progettato come un sistema chiuso e si può accedere e gestito sul banco. Abbiamo dimostrato il funzionamento di questo nuovo dispositivo arricchimento delle cellule automatizzato per la fabbricazione di cellule T specifiche per CMV pp65 ottenute da un prodotto aferesi stato stazionario ottenuto da un donatore sieropositivo CMV. Queste cellule T isolate possono essere infuse direttamente in un paziente sotto la supervisione regolamentare istituzionale e federale. Tutte le fasi bio-trattamento compresi rimozione dei globuli rossi, la stimolazione di cellule T, la separazione delle cellule T antigene-specifiche, purificazione e lavaggio sono completamente automatizzati. Dispositivi come questo sollevano la possibilità che le cellule T per applicazioni sull&#39;uomo possono essere realizzati al di fuori di buone pratiche di fabbricazione dedicato (GMP) Strutture e invece essere prodotti in sangue servizi bancari in cui il personale può supervisionare protocolli automatizzati per la produzione di più prodotti.

In questo studio, una cella automatizzata arricchimento sistema CCS è stato utilizzato per la produzione automatica di cellule T specifiche per CMV pp65. Cellule T specifiche per CMV sono stati arricchiti da tre prodotti di cellule aferesi. Il prodotto aferesi steady-state è stato raccolto più di 2 ore da un donatore CMV-sieropositivi e ha generato 10 10 cellule nucleari totali (TNC). 10 9 TNC sono stati poi attivati ​​con CMV pp65 peptidi derivati ​​dal (60 nmol) per 4 ore e l&#39;IFN-γ secernenti...

L'obiettivo di questo protocollo è produrre cellule T di grado clinico specifiche per i patogeni utilizzando un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione automatizzato da banco che incorpora un sistema chiuso di cattura delle citochine e non richiede personale dedicato o l'uso di una struttura GMP. Le cellule T specifiche per il citomegalovirus pp65 generate possono essere somministrate direttamente ai pazienti.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

L'obiettivo di questa procedura è isolare linfociti T specifici per l'antigene di grado clinico per l'immunoterapia adottiva, utilizzando un sistema di cattura delle citochine. Ciò si ottiene innanzitutto incubando cellule mononucleate ottenute da un donatore positivo per CMV con un'ampia serie di peptidi sovrapposti derivati dalla proteina PP65 del CMV, al fine di attivare i linfociti T. Successivamente, i linfociti T attivati, specifici per l'antigene, positivi per CD45 ed esprimenti IFN-gamma, vengono isolati mediante cattura della citochina.Il numero e la purezza delle cellule T specifiche per il CMV vengono quindi valutati mediante citometria a flusso. In definitiva, un'alta percentuale di cellule T specifiche per il CMV positive per CD4 e CD8 ed esprimenti IFN-gamma può essere ottenuta utilizzando questo sistema di cattura delle citochine. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono che essa è completamente automatizzata e che non è richiesta una struttura operante in conformità con le buone pratiche di produzione per isolare le cellule T di grado clinico catturate.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.

Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l'utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'isolamento e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche derivate dalle cellule citochine- indotte CD3-CD56- cellule killer e illustrare il loro effetto di citotossicità contro le cellule tumorali ematologiche e solide utilizzando un sistema di citometria di flusso di diagnosi invitro.

Isolamento ed espansione delle cellule T Killer citotokine indotte da citokine per il trattamento del cancro

Il chip microfluidico clinico è un'importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.

Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per lo studio della progressione e delle metastasi del cancro. Questo articolo presenta un protocollo integrato ad alta produttività per l'arricchimento di CTC e il sequenziamento di CTC singolo, migliorando l'efficienza di cattura e la purezza delle CTC riducendo al contempo i costi di contaminazione e sequenziamento, facendo progredire la ricerca oncologica di precisione e le applicazioni cliniche.

Tecnologia di selezione delle cellule tumorali circolanti ad alto rendimento e sequenziamento di singole cellule basata sulla microfluidica

Questo protocollo descrive un metodo scalabile per l'espansione dei prodotti Adoptive Cell Therapies (ACT), ovvero le cellule Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T e le cellule Cytokine-Induced Killer (CIK), utilizzando dispositivi di espansione rapida permeabile ai gas (G-Rex), dimostrando una crescita efficiente e robusta in un contesto clinicamente rilevante.

Generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da CAR-T e citochine in dispositivi scalabili GMP

Vi presentiamo un protocollo per la produzione antigene-specifica topo le cellule T mediante trasduzione...

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

Scopri l'arricchimento automatizzato di linfociti T specifici per Citomegalovirus mediante sistema di cattura delle citochine. Questo metodo produce cellule di grado clinico senza richiedere strutture GMP.

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Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

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