Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

L'obiettivo di questa procedura è isolare le cellule T antigene specifiche di grado clinico per l'immunoterapia adottiva utilizzando un sistema di cattura delle citochine. Ciò si ottiene incubando prima le cellule mononucleate ottenute da un donatore positivo al CMV con un pannello di peptidi sovrapposti derivati dal CMV PP 65 per attivare le cellule T. Successivamente, le cellule T che esprimono IFN gamma positive all'antigene specifico CD 45 attivate vengono isolate mediante cattura di citochine.

Il numero e la purezza delle cellule T specifiche per CMV vengono quindi valutati mediante citometria a flusso. In definitiva, un'alta percentuale di cellule T specifiche per CMV che esprimono IFN gamma positive per CD quattro e CD otto può essere raccolta utilizzando questo sistema di cattura delle citochine. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono che è completamente automatizzata e che non è necessario isolare le cellule T di grado clinico catturate da una struttura che opera in conformità con le buone pratiche di fabbricazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia cellulare adottiva, come ad esempio come ridurre i costi associati alla produzione cellulare aumentando contemporaneamente l'accessibilità di queste cellule. Per un gran numero di pazienti, tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sull'isolamento delle cellule T specifiche dell'antigene della CMB. Può anche essere applicato alla risposta delle cellule T ad altri agenti patogeni intubando le cellule con antigeni pep derivati dagli specifici agenti infettivi di interesse.

Questo sistema automatizzato semplifica anche il processo di cattura delle citochine e consente di produrre i prodotti a base di cellule T catturate su richiesta senza la supervisione diretta degli operatori. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un interconnettore a punta per esca per trasferire il cocktail di peptidi C-M-V-P-P 65 appena ricostituito in una sacca di congelamento da 50 millilitri di volume quando tutto il peptide è stato trasferito. Bloccare la sacca con una pinza di bloccaggio e aprire il set di tubi di arricchimento delle celle in condizioni sterili, rimuovere l'adattatore per flaconcino ventilato e il filtro sterile dal set di tubi e collegare la sacca per cocktail di peptidi avvitando l'interconnettore della punta dell'esca sulla connessione dell'esca.

Quindi sospendere 1 miliardo di cellule nucleari totali in un volume totale di 50 millilitri di tampone P-B-S-E-D-T-A appena preparato e albumina sierica umana e iniettare il prodotto cellulare in una sacca di trasferimento da 150 millilitri. Ora accendi il sistema di arricchimento cellulare e seleziona il sistema di cattura delle citochine IFN Gamma Enrichment Program. Apparirà un'interfaccia utente che mostra schermate con istruzioni e immagini per la procedura.

Immettere l'operatore e la tubazione, impostare i parametri del numero di particella. Quindi, utilizzando le istruzioni visualizzate sullo schermo del monitor interattivo, installare il set di tubi prodigy sul dispositivo automatizzato di arricchimento cellulare. Dopo aver registrato il catalogo e i numeri di lotto dei reagenti, seguire le istruzioni dettagliate visualizzate sullo schermo per collegare il terreno e i tamponi al dispositivo.

Quindi, dopo un controllo finale del set di tubi, aprire il cocktail di peptidi e le sacche medie e avviare l'adescamento automatico del tubo. Al termine dell'adescamento, utilizzare una saldatrice per tubi sterile per aggiungere albumina sierica umana al tampone di cloruro di sodio nella sacca del serbatoio e per trasferire il prodotto cellulare iniziale nella sacca di applicazione. Quindi, utilizzare gli adattatori per collegare i reagenti del sistema di cattura delle citochine alle rispettive provette e inserire il tempo preferito per la fine del processo di arricchimento cellulare.

Rivedi e verifica l'accuratezza di tutti i dati e i parametri inseriti. Quindi rimuovere il sigillo del sacchetto di controllo qualità e pesare il sacchetto e conservarlo a quattro gradi Celsius. Ora inizia il processo di arricchimento.

Le cellule bersaglio saranno raccolte nel tampone di eluizione dalla sacca del serbatoio. Al termine dell'arricchimento, raccogliere due aliquote da ciascuna delle frazioni negative e positive per le cellule bersaglio non bersaglio. Quindi sigillare e pesare le sacche per le cellule non bersaglio e le sacche per le cellule bersaglio e conservarle a quattro gradi Celsius.

Infine, rimuovere il set di tubi dallo strumento per l'arricchimento cellulare e trasferire il file di registro su un'unità USB per un uso successivo. Per determinare il numero di cellule arricchite da ciascuno dei campioni, aggiungere CD 45 viola blu a una delle aliquote della cellula non bersaglio del controllo di qualità e della cellula bersaglio per 10 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione di lisi dei globuli rossi appena preparata al controllo qualità e alle frazioni negative e 450 microlitri alla frazione positiva per 15 minuti.

A temperatura ambiente, immediatamente prima dell'analisi, aggiungere ai campioni ioduro di propidio alla concentrazione finale di un microgrammo per millilitro e caricare i campioni su un contatore automatico di cellule. Per determinare il numero assoluto di celle di ciascun campione, utilizzare il campione di controllo qualità per impostare il time gate come dimostrato. Gate le singole cellule in un'altezza di dispersione diretta mediante grafico dell'area di dispersione in avanti, seguito da un cancello di monociti e linfociti sulle cellule positive CD 45, quindi escludere i detriti nel grafico di dispersione laterale in avanti per consentire l'identificazione delle cellule vitali.

Il numero di cellule vitali all'interno del campione originale di controllo qualità può quindi essere calcolato per valutare la qualità del lavaggio di arricchimento, le seconde aliquote dalle frazioni positive e negative originali con tampone P-B-S-E-D-T-A pre-refrigerato integrato con un siero B. Risospendere i pellet in 100 microlitri della miscela di colorazione fluorocromica anticorpale appropriata al buio a quattro gradi Celsius. Dopo 10 minuti, incubare i campioni in un millilitro di soluzione di lisi dei globuli rossi appena preparata per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi centrifugare nuovamente le cellule, sospendendo nuovamente i pellet in P-B-S-E-D-T-A fresco integrato con siero AB immediatamente prima dell'analisi, aggiungere ioduro di propidio come appena dimostrato. Quindi ha utilizzato una seguente strategia di gating per calcolare il numero di cellule T CD, tre positive vitali e la frazione positiva dopo l'arricchimento del sistema di cattura delle citochine, nonché le frequenze delle popolazioni di cellule T doppie positive CD quattro e CD otto, singole positive e CD quattro, IFN gamma e CD otto, IFN gamma, doppie positive. Una conta assoluta di cellule T positive all'interferone gamma è stata valutata prima e dopo il processo di arricchimento.

Il numero totale di cellule T positive all'interferone gamma prima dell'arricchimento era di 1.140.000 come derivato dal miliardo di cellule nucleari totali iniziali. Mentre dopo l'arricchimento sono state ottenute 309.000 cellule T positive all'interferone gamma, sono state identificate quattro cellule T positive al 16% di IFN gamma CD prima dell'elaborazione, che sono aumentate al 47,5% dopo l'arricchimento. Mentre la purezza delle cellule T gamma positive per otto IFN è stata arricchita dallo 0,47% al 90,3%, il recupero del campione e la frazione positiva catturata sono stati del 32,9% per le quattro cellule T CD positive e del 31,8% per le otto cellule T CD positive.

Sulla base della misurazione delle cellule T gamma positive all'IFN nella popolazione iniziale prese insieme, questi dati indicano che sia le cellule T specifiche per CMV PP 65 CD quattro positive che quelle CD otto positive possono essere raccolte automaticamente e in modo adeguato per la loro applicazione nell'uomo. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri test come i test dell'endotossina e del micoplasma per rispondere a ulteriori domande sulla sterilità del prodotto finale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia cellulare adottiva per esplorare l'uso terapeutico di cellule T specifiche multiantigene per il controllo di varie infezioni opportunistiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come le cellule T di grado clinico possono essere isolate utilizzando un sistema automatizzato. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale adeguati.