Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da Sporosarcina pasteurii

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di indurre la precipitazione di calcite in una coltura stagnante di Sporosarcina pasteurii. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande biofisiche chiave sulla precipitazione di calcite mediata da Sporosarcina pasteurii, come la lunghezza e le scale temporali pertinenti. Il vantaggio principale di questa tecnica è il fatto che standardizza i passaggi complessi coinvolti nella coltura e nell'arricchimento adeguati di Sporosarcina pasteurii che garantisce una precipitazione affidabile della calcite.

Per iniziare, assembla piastre di Petri, fiasche, base Tris, HCl, agar, acqua Millipore e un pHmetro. Sterilizzare tutti i contenitori in autoclave a 121 gradi Celsius prima dell'uso. Preparare un litro di una soluzione acquosa 0,13 molare di tampone Tris mescolando 15,75 grammi di base Tris con un litro di acqua Millipore.

Aggiungere circa 2,8 millilitri di HCl al 50% per regolare il tampone a un pH di nove. Una volta che la coltura è pronta, deve essere adeguatamente arricchita con il buffer appropriato. Questo passaggio è fondamentale per il successo dell'esperimento, perché l'incapacità di fornire l'ambiente chimico adeguato può portare a scale temporali molto lunghe di precipitazione o addirittura alla loro completa mancanza.

Quindi, dividi il litro di tampone in due parti come segue. In un'aliquota da 400 millilitri, sciogliere otto grammi di solfato di ammonio. In una seconda aliquota da 400 millilitri, sciogliere 16 grammi di estratto di lievito.

In 100 millilitri di tampone, mescolare due grammi di solfato di ammonio e negli ultimi 100 millilitri di tampone, aggiungere quattro grammi di estratto di lievito e quattro grammi di agar. Dopo aver avvolto i palloni in un foglio di alluminio, sterilizzare in autoclave le quattro soluzioni. Subito dopo la sterilizzazione in autoclave, mettere da parte le due soluzioni da 400 millilitri.

Unire le due soluzioni da 100 millilitri, mescolare bene e dividere da 10 a 12 piastre di Petri. Per coltivare campioni batterici, rimuovere il brodo batterico dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e lasciarlo scongelare correttamente. Quindi posizionarlo insieme a una piastra di agar nella cappa di biosicurezza.

Selezionare una micropipetta del volume più basso possibile e immergere un puntale per micropipetta nel brodo di Sporosarcina pasteurii prima di utilizzare il puntale per striare una piastra di agar. Incubare la piastra a 31 gradi Celsius per 48 ore, quindi esaminare visivamente la presenza di singole colonie. Se non sono presenti, incubare per altre 24 ore.

Ripetere il controllo e le incubazioni fino a quando non vengono rilevate singole colonie. Per preparare i campioni finali di coltura batterica, mescolare insieme le due soluzioni da 400 millilitri precedentemente sterilizzate in un becher sterilizzato e trasferire 125 millilitri in un pallone. Eseguire un esame visivo della piastra di agar per identificare le regioni con alte concentrazioni di singole colonie.

Con la punta di una micropipetta, spingere delicatamente e rompere una delle colonie. Quindi immergere la stessa punta nel pallone da 125 millilitri e mescolarla accuratamente per garantire il trasferimento di un numero sufficiente di cellule. Mettere il pallone in un'incubatrice agitata a 30 gradi Celsius e 150 giri/min per due o tre giorni.

Per determinare il conteggio finale delle cellule, disegna sette linee parallele equidistanti in grassetto sul fondo di una delle piastre di agar in modo che siano visibili dall'alto. Mettere tre piccole gocce di circa dieci microlitri di coltura non diluita in un segmento. Aggiungere un millilitro di coltura non diluita a nove millilitri di PBS sterilizzato per ottenere una diluizione da uno a dieci.

Quindi posizionare tre piccole gocce di diluizione su un secondo segmento della piastra. Trasferire la coltura diluita in un nuovo pallone e utilizzare il PBS per diluire altre dieci volte fino a dieci fino a meno due. Ripetere il processo di placcatura e diluizione fino a generare una diluizione di almeno dieci a meno sette per garantire l'ottenimento di singole colonie.

Incubare la piastra a 31 gradi Celsius per uno o due giorni prima di contare le colonie in ciascuna sezione della piastra. Trasferire nove millilitri della coltura liquida preparata in diverse provette da centrifuga sterilizzate da dieci millilitri. Preparare 100 millilitri della soluzione madre di arricchimento esterno utilizzando una bilancia analitica per misurare attentamente due grammi per litro di urea, un grammo per litro di cloruro di ammonio, 212 milligrammi per litro di bicarbonato di sodio e 280 milligrammi per litro di cloruro di calcio.

In un becher con terreno fresco, unire tutti gli ingredienti tranne l'urea e l'autoclave. Dopo la sterilizzazione in autoclave, mescolare l'urea con un millilitro di terreno fresco e passare la soluzione attraverso una siringa dotata di un filtro da 0,2 micrometri prima di aggiungerla al terreno di arricchimento. Aggiungere un millilitro del terreno di arricchimento con additivi alle provette da centrifuga sterilizzate contenenti nove millilitri della coltura preparata.

Agitare ogni provetta e incubare in un'incubatrice non agitante a 30 gradi Celsius. Monitorare regolarmente tutte le unità per l'inizio delle precipitazioni. Una volta rilevata la precipitazione a occhio nudo, trasferire un piccolo volume di fluido in un sistema di vetro di copertura con camera di microscopia ad alto ingrandimento.

Inizialmente visualizza con un ingrandimento 4X per osservare un'ampia area di copertura prima di aumentare progressivamente l'ingrandimento. Eseguire esperimenti di colorazione e SEM secondo il protocollo di testo. Quando S.pasteurii viene coltivato seguendo il protocollo dimostrato in questo video, i batteri portano alla precipitazione di carbonato di calcio che si deposita sul fondo della provetta nel tempo.

Questa figura mostra le immagini a contrasto di fase di una popolazione batterica a bastoncino chiaramente distinta all'interno del mezzo. Qui si notano le linee di scollatura ben definite, segno distintivo della cristallinità. Questo grafico di spettroscopia fotoelettronica a raggi X per lo stesso campione contiene picchi corrispondenti a gruppi carbonato che individuano l'esistenza di carbonato di calcio.

In questo pannello è mostrata una spugna non trattata che si comprime facilmente se sottoposta a un peso di un chilogrammo. Quando una spugna è stata immersa in una soluzione di precipitante di calcite con S. pasteurii per sette giorni e poi asciugata, si è indurita e ha mostrato una maggiore resistenza alla compressione a causa dell'ostruzione dei pori dovuta alla precipitazione della calcite. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in poche ore se tutti i passaggi sono eseguiti correttamente.

Tuttavia, sebbene le singole fasi richiedano solo pochi minuti ciascuna, ci sono periodi di inattività più lunghi tra i quali il campione deve essere incubato per ore o addirittura giorni. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire diverse altre tecniche come la caratterizzazione aggiuntiva per rispondere ad altre domande, ad esempio, sulla distribuzione statistica delle forme polimorfe nel carbonato di calcio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione adeguata e chiara di come coltivare adeguatamente la Sporosarcina pasteurii per arricchirla correttamente che garantisca la precipitazione della calcite e anche di come osservare il processo attraverso la microscopia multimodale.

Non dimenticare che lavorare con autoclavi ad alta pressione può essere estremamente pericoloso e quindi tutte le precauzioni come lo sfiato completo della camera e l'uso di DPI devono essere garantite prima di eseguire questa procedura.