Name: Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da Sporosarcina pasteurii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri la precipitazione di calcite indotta microbiologicamente con Sporosarcina pasteurii per la biomineralizzazione. Questo metodo standardizzato migliora la resistenza compressiva dei materiali e facilita la ricerca in ingegneria ambientale.

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Desideriamo ringraziare i partner dell'Iniziativa Helmholtz-Alberta, l'Associazione Helmholtz e l'Università di Alberta, per il supporto derivante dalla partecipazione a questa collaborazione. Il finanziamento della ricerca è fornito dall'Iniziativa e dal Fondo di Networking dell'Associazione Helmholtz, dai Centri Helmholtz partecipanti e dal governo dell'Alberta attraverso il programma ecoTrust dell'Alberta Environment.
La dottoressa Tanushree Ghosh è grata per i suoi input critici in una serie di fasi cruciali.

NOTA: Eseguire i protocolli sperimentali nell&#39;ordine descritto di seguito. Il protocollo di coltura batterica è discusso nella sezione 1 (vedi anche figura 1). Sezione 2 descrive il protocollo per arricchire il terreno di coltura utilizzando additivi esterni. La sezione 3 descrive i protocolli per la microscopia multi-mode. I pesi di tutti i singoli componenti possono essere misurati con una bilancia analitica. Volume di ogni soluzione può essere misurata utilizzando un cilindro tarato. NOTA: i protocolli di biosicurezza adeguato devono essere seguite per le sezioni 1 - 2. Consultare l&#39;ufficio di sicurezza istituzionale per i dettagli. 1. coltura batterica <ol><li> Batteri Cultura - Agar piastra Media Preparazione <ol><li> Assemblare attrezzature e gli ingredienti, come piastre di Petri, fiasco, Tris-base, HCl, agar, Millipore acqua, pH-metro etc.Sterilize tutti i contenitori in autoclave a 121 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare 1 L di 0,13 soluzione acquosa M di Tris-buffer mescolando 15.75 g Tris-base con 1 L di acqua Millipore. Per abbassare il pH della soluzione originale (pH 10,4) aggiungere 2.800 ml di HCl (concentrazione 50%). Controllare continuamente con un pH-metro per impostare pH = 9. </li><li> Dividere la soluzione tampone 1 L in due parti: <ol><li> Prendere 800 ml di questa soluzione. Dividerlo equamente in due parti di 400 ml ciascuna. Sciogliere 8 g (NH 4) 2 SO 4 con una soluzione e 16 g estratto di lievito per l&#39;altra soluzione. </li><li> Dai rimanenti (200 ml) soluzione e dividerla nuovamente in due parti di 100 ml ciascuna. Mescolare 2 g (NH 4) 2 SO 4 a uno. Aggiungere 4 g di estratto di lievito e 4 g di agar all&#39;altro. </li></ol></li><li> Autoclave le 4 soluzioni separatamente, dopo aver terminato i rispettivi palloni in foglio di alluminio e attaccare nastri autoclave. NOTA: Se viene utilizzato un apparecchio da banco autoclave, il volume deve essere impostato a 500 ml (temperatura e pressione automatcamente specificato in funzione del volume). </li><li> Dopo averli tolti dal autoclave, impostare i due 400 ml di soluzioni da parte per passo 1.3.1 (qui di seguito). Mescolare le due soluzioni 100 ml di una soluzione di 200 ml. Versare il composto in 10 - 12 capsule di Petri. </li></ol></li><li> Batteri Cultura - piastra di agar Preparazione del campione <ol><li> Rimuovere il magazzino batterica dal congelatore (-80 ° C) e lasciarlo scongelare. Dopo lo scongelamento correttamente, posizionare il magazzino batterica e la piastra di agar all&#39;interno di una cappa di biosicurezza. </li><li> Selezionare la micropipetta di piccola dimensione disponibili (0,5-10 ml è una buona scelta) ad infestare la punta con il brodo pasteurii Sporosarcina. Streak una piastra di agar con la punta micropipetta. Posizionare la piastra di agar striato all&#39;interno di un incubatore non agitazione a 31 ° C per 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore, rimuovere la piastra dal termostato di esaminare visivamente l&#39;esistenza di singole colonie. Se non ci sono singole colonie, poi posto in tegli incubatrice per un altro 24 ore. </li><li> Ripetere il processo fino a quando vengono rilevati singole colonie. Non superare i 7 giorni di prova. NOTA: Se singole colonie non appaiono anche dopo una settimana, poi si conclude che le misure non sono state seguite correttamente e l&#39;intero processo deve essere ripetuto dal punto 1. </li></ol></li><li> Batteri Cultura - campione finale Preparazione <ol><li> Mescolare le due soluzioni 400 ml (tampone Tris + (NH 4) 2 SO 4 e tampone Tris + estratto di lievito (1.5.1) insieme per ottenere una soluzione di 800 ml. Trasferire 125 ml di questa soluzione in un pallone. </li><li> Eseguire un esame visivo della superficie della piastra di agar per identificare le regioni ad alta concentrazione di singole colonie. Delicatamente spingere e rompere una delle colonie con una punta micropipetta. </li><li> Immergere la stessa punta micropipetta nel pallone 125 ml e mescolare accuratamente per garantire che il numero sufficiente di cellule per la moltiplicazione robusta vengono trasferite. Porre il pallone in un incubatore agitazione a 150 rpm, 30 ° C per 2 - 3 giorni. Dopo 2 - 3 giorni, togliere il pallone dal termostato. </li></ol></li><li> Batteri Cultura - Finale Cell Count <ol><li> Eseguire diluizioni seriali della soluzione di coltura non diluito con PBS per ottenere una diluizione di almeno dieci milioni (10 -7) garantire appaiono singole colonie numerabili. Disegnare sette linee equidistanti parallele su una delle agar-piastre. <ol><li> Eseguire questa disegnando linee in grassetto sulla superficie inferiore del piatto Petri, abbastanza importante per essere visibile dall&#39;alto. Goccia 3 piccole gocce di soluzione non diluita in un segmento. Aggiungere 1 ml di soluzione non diluita a 9 ml di tampone fosfato (PBS) per ottenere una diluizione 1:10. </li></ol></li><li> Prendere una piccola aliquota (~ 0,1 ml) di questa nuova soluzione diluita con una pipetta e rilasciare 3 più piccole gocce sul segmento successivo. Trasferire la nuova soluzione diluita in un pallone e ulteriormente diluita dieci volte (10x) byaggiungendo PBS. Questo fa scendere la diluizione di 10 -2 o 1: 100. <ol><li> Utilizzare questo 1: soluzione 100 nel segmento successivo. Ripetere questo si elabora con piccoli volumi di soluzioni diluite appena trasferendoli successivamente a nuovi flaconi e diluendo continuamente dieci volte (10x) in tandem con PBS per ottenere campioni sempre più diluite da 10 -3 o 1: 1.000 fino fino a 10 -7 o 1:10 milioni nell&#39;ultimo segmento. </li></ol></li><li> Eseguire Colony-Forming count Unit (CFU) piastra per contare il numero di cellule presenti nella piastra di agar dopo incubazione la piastra per 1 - 2 giorni a 31 ° C. Questo dà una misura quantitativa della carica batterica nel campione non diluito. NOTA: Il valore CFU viene misurata in base alla capacità del sistema di dare origine a colonie nelle condizioni specifiche di mezzo nutriente, temperatura e tempo supponendo che ogni colonia è separata e fondata da una singola cellula microbica vitali. </li><li> Focale piastre di Petri con autosigillante pellicola e conservare rimanendo elementi in frigorifero per un utilizzo futuro. </li></ol></li></ol> 2. Il protocollo per l&#39;arricchimento di nutrienti per accelerare Precipitazioni <ol><li> Transfer 9 ml della coltura liquida preparata (cellule + medium) in diverse provette per centrifuga sterilizzati, ciascuno di 10 ml di volume. </li><li> Preparare una soluzione stock di arricchimento esterno costituito da quattro componenti nelle seguenti concentrazioni in mezzo fresco 100 ml: Urea: 2 g / L, cloruro di ammonio: 1 g / L, bicarbonato di sodio: 212 mg / L, cloruro di calcio: 280 mg / L. Misurare attentamente tutti gli ingredienti con una bilancia analitica e mescolare tutto, ma l&#39;urea con terreno fresco in un bicchiere e posto in autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min). <ol><li> Dopo autoclave, mescolare la quantità necessaria di urea (2 mg) con 1 ml di mezzo fresco e passare attraverso una siringa con filtro a siringa da 0,22 micron per completare il processo di arricchimento. </li><li> Aggiungere 1ml di questo terreno di arricchimento con additivi per le provette da centrifuga sterili contenenti 9 ml di coltura liquida preparata (cellule + media) (vedi punto 2.1). NOTA: Di tutti questi componenti, urea essendo degradabile a temperature elevate, non può essere sterilizzato in autoclave. Quindi, dopo gli altri componenti sono stati autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), l&#39;urea viene aggiunto per ultimo attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron. </li></ol></li><li> Vortex ogni provetta accuratamente con un vortex meccanico. Posizionare i liquidi arricchiti (cellule + additivi medie +) in un incubatore non agitazione a 30 ° C. Monitorare tutte le unità regolarmente per l&#39;inizio di precipitazioni. Utilizzando un microscopio ottico, iniziare osservazioni al microscopio volta insorgenza di precipitazione viene rilevata ad occhio nudo. Questo è di solito tra 30 - 36 ore dopo l&#39;inizio degli esperimenti. </li></ol> 3. Protocollo per Multi-mode Microscopia <ol><li> Trasferire un piccolo volume (~ 1 ml) di fluido ad un alto magnificatione del sistema di microscopia coprioggetti-camerata per eseguire le osservazioni iniziali con modalità campo chiaro. Per cominciare, avviare tutte le osservazioni con l&#39;ingrandimento più basso (4X). che fornisce un&#39;ampia area di copertura e informazioni quindi globale sulla distribuzione di precipitati. </li><li> Selezionare aree particolari con volumi significativi di precipitazioni e zoom (20X, 40X, 60X) aumentando progressivamente l&#39;ingrandimento. NOTA: Dal momento che è impossibile risolvere correttamente le cellule dalla sostanza extracellulare polimerico (EPS) in campo chiaro (a causa di molto vicino indici di rifrazione), attivare la modalità a contrasto di fase in caso di necessità. In questo modo, solo i contorni delle membrane cellulari (essendo una fase differente rispetto alla cella bulk) sono visibili, permettendo così differenziazione visiva. </li><li> Infine, macchiare alcune camere con Live macchia / Morto che tinge selettivamente le componenti in tensione, come verde, mentre la colorazione dei componenti morti in rosso. Fare riferimento a protocolli standard 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Attivare la modalità fluorescente di distinguere correttamente tra le regioni rosse e verdi. Red (cubo filtro rosso con eccitazione lunghezza d&#39;onda di 540-580 nm, dicroico specchio di 595 nm e Barriera filtro di 600-660 nm) e passaggio lungo verde (GFP cubo filtro verde con eccitazione lunghezza d&#39;onda di 440-480 nm, dicroico specchio 505 filtro nm e Barriera di 510 cubi nm) di filtro sono utilizzati per facilitare il microscopio a fluorescenza. </li><li> Una volta che sono stati raccolti tutti i dati multi-mode, selezionare le migliori immagini e sovrapposizione manualmente (individuale campo chiaro, contrasto di fase e le immagini fluorescenti) per ottenere il miglior contrasto possibile e chiarezza. </li><li> Eseguire SEM sui campioni solidi secchi di capire strutture cristalline. Questa è una procedura ben consolidata e standard. 22 Eseguire XPS per identificare le firme chimiche dei gruppi funzionali (carbonati). Questa è una procedura ben consolidata e standard pure. 23 </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Passi critici: Questo manoscritto descrive in dettaglio i protocolli per la coltura di un campione vitale di S. pasteurii. Una volta che la coltura è stato preparato, deve essere opportunamente arricchito. Questo è un passo chiave fondamentale per il successo dell&#39;esperimento, perché un fallimento per fornire l&#39;ambiente chimico adeguato porta a uno scale temporali molto lunghi di precipitazioni o di una completa mancanza della stessa. S. pasteurii è molto sensibile a diverse az...

Sporosarcina pasteurii è un batterio gram-positivo in grado di sopravvivere in ambienti fortemente alcaline (pH ~ 10) 1 ed è una delle specie batteriche che possono diventare un agente causativo di un fenomeno chiamato Microbiologicamente Induced Calcite Precipitation (MICP) 2-4. MICP è un processo in cui la precipitazione di carbonato di calcio è indotta da certi microbi in condizioni ambientali idonee. S. pasteurii ha assunto importanza negli ultimi anni a causa della sua identificazione come possibile agente per indurre un significativo volume di MICP in determinate condizioni. Questa possibilità deriva dal fatto che S. pasteurii ha la capacità unica di secernere grandi quantità di ureasi. Questo enzima agisce come un catalizzatore, promuovendo una lisi accelerata di urea (un composto biochimico naturale con fornitura diffusa e abbondante) in presenza di molecole di acqua. Attraverso una cascata di reazioni, questo processo finalely porta alla generazione di ioni carbonato carica negativa. Questi ioni, a sua volta, reagire con ioni metallici positivi come calcio per formare infine precipitati di carbonato di calcio (calcite); da qui l&#39;etichetta MICP 5-9. Il processo di MICP è stato conosciuto e studiato per diversi decenni 10,11. Nel corso degli ultimi anni, MICP è stato studiato per un&#39;ampia gamma di applicazioni tecniche e ambientali, compresa bottom-up costruzione verde 12, il miglioramento delle strutture di grandi dimensioni 13,14 e il sequestro del carbonio e lo stoccaggio 15,16. Ad esempio, Cunnigham 17 et. Al progettato un reattore a flusso temperatura moderata ad alta pressione contenente un nucleo di arenaria Berea. Il reattore è stato inoculato con il batterio S. fridgidimarina e in condizioni di alta pressione carbonica supercritica iniezione anidride, un massiccio accumulo di biomassa all&#39;interno del poro volUmes stato osservato, che ha portato ad una riduzione superiore al 95% in permeabilità. Jonkers e Schlangen 18 hanno studiato l&#39;effetto di alcuni ceppi di batteri speciali sul processo di auto-guarigione in calcestruzzo. acqua esterna trasportata nella rete dei pori che entra attraverso i pori della superficie si prevede di attivare i batteri dormienti che a loro volta aiutano resistenza strutturale tramite MICP. Tobler 19 et al. hanno confrontato l&#39;attività ureolytic di S. pasteurii con una falda indigena ureolytic microcosmo in condizioni che favoriscono MCIP su larga scala e ha scoperto che S. pasteurii ha una capacità costante di migliorare la calcite precipitazioni anche quando le comunità indigene mancava attività ureasica prima. Mortensen 20 et.al hanno studiato gli effetti di fattori esterni come il tipo di suolo, la concentrazione di cloruro di ammonio, salinità, concentrazione di ossigeno e lisi delle cellule su MICP. La loro dimostrazione che il processo di trattamento biologico è molto robusto con respect ad un&#39;ampia variazione nella spazio dei parametri sostanzia l&#39;idoneità di questo processo per varie applicazioni di bonifica su larga scala di cui un processo di arricchimento adeguato per rinforzare i batteri è intrapresa. Phillips 21 et. al progettato esperimenti per studiare i cambiamenti nella permeabilità e la forza di una colonna di sabbia ed un nucleo di arenaria dopo l&#39;iniezione con S. culture pasteurii. Essi hanno scoperto che, mentre la permeabilità diminuita 2 - 4 volte mentre la resistenza alla frattura è aumentato tre volte. S. pasteurii e il suo ruolo nella MICP sono argomenti di ricerca attiva e di diverse questioni relative al meccanismo di precipitazione chimica non sono ancora pienamente compresi. Alla luce di questo, è molto importante avere un set di protocolli standardizzati coerenti con precisione la cultura un magazzino opportunamente arricchito di S. pasteurii per raggiungere MICP. Qui, descriviamo un protocollo rigoroso che assicuri ripetibilità e la riproducibilità. Questo manuscript descrive i protocolli dettagliati per la coltura di S. pasteurii ed opportunamente arricchendo il terreno di coltura per indurre la precipitazione. Il processo è indagato attraverso varie tecniche microscopiche, come ottica e microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettrone Spectroscopy (XPS). Il focus del manoscritto è sul processo di MICP. Procedure come SEM e SIMS, essendo protocolli standard consolidati, non sono descritte separatamente.

<table><tbody><tr><td>Petridish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Petridish utilizzati come piastre di agar</td></tr><tr><td>Fiasche in pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>utilizzato per produrre</td></tr><tr><td>acido cloridrico</td> Tris-Buffer <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1.0 N, bioreagente, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Polvere di agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>testato per microbiologia, testato per colture cellulari vegetali, testato per colture cellulari,</td></tr><tr><td>polvere Solfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Estratto di lievito in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cole-Parmer Classe A Cilindro graduato con Cal Cert,TC; 1.000 ml,1/confezione</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>utilizzata per misurare il peso dei reagenti</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Nastro per autoclave</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>foglio di alluminio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>utilizzata per sigillare il pallone prima di metterlo in autoclave Batterico</td></tr><tr><td>Stock</td><td>Cedarlane</td><td>11859</td><td>-80 &deg; C stock di S. pasteurii, ATCC No. è menzionato contro Cat. No.</td></tr><tr><td>Pipettatori meccanici a canale singolo Mline, volume variabile</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Commercializzato da VWR con il numero di catalogo 14005976</td></tr><tr><td>Punta per micropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Utilizzato per graffiare le piastre di agar</td></tr><tr><td>Legante per incubatori</td><td></td><td>80079098</td><td>Incubatore per microbiologia,</td></tr><tr><td>incubatore con agitazione</td> serie BF <td>VWR</td><td>14004300</td><td>VWR Signature Benchtop Shaking Incubatori</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)&nbsp;</td>Dispositivo di pipettaggio <td>Pipet-Aid Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Express</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Commercializzato da VWR con il numero di catalogo 53106220</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Utilizzato per sigillare le piastre Agar</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Arricchimento per mezzo nutritivo</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Arricchimento per terreno nutritivo</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Arricchimento per terreno nutritivo</td></tr></tbody></table>

microbiologicamente indotta calcite precipitazioni mediata da<em&gt; sporosarcina pasteurii</em

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

La particolare batterio sotto inchiesta qui (S. pasteurii) è unico nella sua capacità, nelle giuste condizioni, di indurre l&#39;idrolisi di urea (ureolysis) in ambienti presenti in natura attraverso la secrezione di un ureasi. Questo processo di ureolysis, attraverso una catena di reazioni chimiche, porta alla formazione di precipitati di carbonato di calcio. Questo è noto come Microbiologicamente Induced Calcite Precipitazioni (MICP). I protocolli di coltura adeguate per MICP sono descritti qui. Infine, esperimenti di visualizzazione in diverse modalità di microscopia sono state effettuate per capire i vari aspetti del processo di precipitazione. Tecniche come la microscopia ottica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettroni Spectroscopy (XPS) sono stati impiegati per caratterizzare chimicamente il prodotto finale. Inoltre, la capacità di questi precipitati ad ostruire i pori all&#39;interno di un mezzo poroso naturale è stato dimostrato attraverso un esperimento qualitativa dove spugnabarre sono stati usati per simulare un poro-rete con una gamma di scale di lunghezza. Una barra spugna imbevuta nel terreno di coltura contenente le cellule batteriche indurisce l&#39;intasamento dei suoi pori risultanti dal processo continuo di precipitazione chimica. Questa barra spugna indurito presenta una resistenza superiore rispetto a un bar spugna controllo che si comprime e spremuto sotto l&#39;azione di un carico esterno applicato, mentre la barra indurito è in grado di sostenere lo stesso peso con poca deformazione.

S. pasteurii essere un alkaliphile 24 possono sopravvivere in condizioni relativamente difficili. Quando il protocollo cultura di cui sopra è seguita, e S. pasteurii è cresciuto all&#39;interno di una camera, i batteri porta alla precipitazione di carbonato di calcio nel tempo (Figura 2A). Figura 2 (b) mostra un contrasto di fase ottica dell&#39;immagine microscopica della popolazione cellulare batterica nel terreno di coltur...

Qui vengono presentati i protocolli per la precipitazione microbiologicamente indotta della calcite (MICP) utilizzando il batterio Sporosarcina pasteurii. Il carbonato di calcio precipitato è stato caratterizzato mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a scansione (SEM). È inoltre dimostrato che l'esposizione a MICP aumenta la resistenza alla compressione della spugna.

Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è indurre la precipitazione di calcite in una coltura stagnante di Sporosarcina pasteurii. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali di tipo biofisico sulla precipitazione di calcite mediata da Sporosarcina pasteurii, come le scale di lunghezza e di tempo pertinenti. Il principale vantaggio di questa tecnica risiede nel fatto che standardizza i passaggi complessi coinvolti nella coltivazione e nell'arricchimento adeguato di Sporosarcina pasteurii, garantendo una precipitazione affidabile di calcite.Per iniziare, preparare piastre di Petri, fiaschi, base di Tris, HCl, agar, acqua Millipore e un pHmetro. Sterilizzare tutti i contenitori mediante autoclave a 121 gradi Celsius prima dell'uso. Preparare un litro di una soluzione acquosa 0,13 molare di buffer Tris mescolando 15,75 grammi di base di Tris con un litro di acqua Millipore.Aggiungere circa 2,8 millilitri di HCl al 50% per regolare il tampone a un pH di nove. Una volta che la coltura è pronta, deve essere opportunamente arricchita con il tampone appropriato. Questo passaggio è fondamentale per il successo dell'esperimento, poiché l'incapacità di fornire l'ambiente chimico corretto può portare a scale temporali molto lunghe di precipitazione o addirittura all'assenza totale della stessa.Successivamente, dividere il litro di tampone in due parti come segue. In un'aliquote di 400 millilitri, sciogliere otto grammi di solfato di ammonio. In una seconda aliquote di 400 millilitri, sciogliere 16 grammi di estratto di lievito.In 100 millilitri di tampone, mescolare due grammi di solfato di ammonio e negli ultimi 100 millilitri di tampone aggiungere quattro grammi di estratto di lievito e quattro grammi di agar. Dopo aver avvolto i flaconi in foglio di alluminio, sterilizzare le quattro soluzioni in autoclave. Immediatamente dopo la sterilizzazione in autoclave, mettere da parte le due soluzioni da 400 millilitri.Unire le due soluzioni da 100 millilitri, mescolare bene e suddividere in 10-12 piastre di Petri. Per coltivare i campioni batterici, rimuovere la riserva batterica dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e lasciarla scongelare completamente. Successivamente, posizionarla insieme a una piastra di agar nella cappa a sicurezza biologica.Selezionare una micropipetta con il volume più basso possibile e immergere la punta della micropipetta nel ceppo di Sporosarcina pasteurii prima di utilizzarla per effettuare lo streaking su una piastra di agar. Incubare la piastra a 31 gradi Celsius per 48 ore, quindi esaminare visivamente la presenza di colonie singole. Se non sono presenti, proseguire l'incubazione per ulteriori 24 ore.Ripetere il controllo e le incubazioni fino al rilevamento di colonie singole. Per preparare i campioni finali di coltura batterica, mescolare insieme le due soluzioni di 400 millilitri sterilizzate in precedenza in un becher sterile e trasferire 125 millilitri in un matraccio. Effettuare un'esame visivo della piastra di agar per identificare le regioni con elevate concentrazioni di colonie singole.Con la punta di una micropipetta, spingere delicatamente e rompere una delle colonie. Successivamente immergere la stessa punta nel matraccio da 125 millilitri e mescolare accuratamente per assicurare il trasferimento di un numero sufficiente di cellule. Posizionare il matraccio in un incubatore agitato a 30 gradi Celsius e 150 rpm per due o tre giorni.Per determinare il conteggio finale delle cellule, tracciare sette linee parallele equidistanti e marcate sul fondo di una delle piastre in agar in modo che siano visibili dalla parte superiore. Posizionare tre piccole gocce di circa dieci microlitri di coltura non diluita in un singolo settore. Aggiungere un millilitro di coltura non diluita a nove millilitri di PBS sterilizzato per ottenere un diluizione uno a dieci.Quindi posizionare tre piccole gocce del campione diluito su un secondo segmento della piastra. Trasferire la coltura diluita in un nuovo flacone e utilizzare PBS per effettuare un'ulteriore diluizione di dieci volte, fino a 10 alla meno due. Ripetere il processo di semina e diluizione fino a ottenere una diluizione di almeno 10 alla meno sette, per garantire l'ottenimento di colonie singole.Incubare la piastra a 31 gradi Celsius per uno o due giorni prima di contare le colonie in ciascuna sezione della piastra. Trasferire nove millilitri della coltura liquida preparata in diversi tubi da centrifuga sterili da dieci millilitri. Preparare 100 millilitri di soluzione stock di arricchimento esterno utilizzando una bilancia analitica per misurare con attenzione due grammi per litro di urea, un grammo per litro di cloruro di ammonio, 212 milligrammi per litro di bicarbonato di sodio e 280 milligrammi per litro di cloruro di calcio.In un becher con mezzo fresco, unire tutti gli ingredienti tranne l'urea e sterilizzare in autoclave. Dopo la sterilizzazione in autoclave, mescolare l'urea con un millilitro di mezzo fresco e filtrare la soluzione attraverso una siringa dotata di un filtro da 0,2 micrometri prima di aggiungerla al mezzo di arricchimento. Aggiungere un millilitro di mezzo di arricchimento con additivi ai tubi da centrifuga sterilizzati contenenti nove millilitri della coltura preparata.Vortexare ogni provetta e incubare in un incubatore senza agitazione a 30 gradi Celsius. Monitorare regolarmente tutte le unità per verificare l'inizio della precipitazione. Una volta rilevata la precipitazione ad occhio nudo, trasferire un piccolo volume di liquido in un sistema microscopico con camera di osservazione ad alta ingrandimento.Osservare inizialmente con un ingrandimento 4X per esaminare un'ampia area prima di aumentare progressivamente l'ingrandimento. Eseguire le colorazioni e gli esperimenti al SEM seguendo il protocollo descritto nel testo. Quando S.pasteurii viene coltivato seguendo il protocollo illustrato in questo video, i batteri inducono la precipitazione di carbonato di calcio che, col tempo, si deposita sul fondo del tubo.Questa figura mostra immagini a contrasto di fase di una popolazione batterica chiaramente distinguibile, di forma bastoncellare, all'interno del mezzo. In questo caso, si possono osservare le linee di scissione ben definite, caratteristica distintiva della cristallinità. Questo grafico di spettroscopia fotoelettronica a raggi X per lo stesso campione contiene picchi corrispondenti a gruppi carbonatici che indicano la presenza di carbonato di calcio.Mostrato in questo pannello vi è una spugna non trattata che si comprime facilmente quando sottoposta a un peso di un chilogrammo. Quando una spugna è stata immersa per sette giorni in una soluzione precipitante di calcite con S.pasteurii e successivamente essiccata, si è indurita e ha mostrato una maggiore resistenza alla compressione a causa dell'occlusione dei pori dovuta alla precipitazione della calcite. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in poche ore se tutti i passaggi vengono eseguiti correttamente.Tuttavia, anche se i singoli passaggi richiedono solo pochi minuti ciascuno, ci sono periodi di inattività più lunghi tra un passaggio e l'altro in cui il campione deve essere incubato per ore o persino giorni. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire diverse altre tecniche, come ulteriori caratterizzazioni, per rispondere ad altre domande, ad esempio sulla distribuzione statistica delle forme polimorfe nel carbonato di calcio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione adeguata e chiara di come coltivare in modo appropriato Sporosarcina pasteurii per arricchirla correttamente, garantendo la precipitazione della calcite, e anche di come osservare il processo mediante microscopia multimodale.Non dimenticare che lavorare con autoclavi ad alta pressione può essere estremamente pericoloso e, pertanto, tutte le precauzioni, come lo sfiato completo della camera e l'uso dei DPI, devono essere garantite prima di eseguire questa procedura.

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Fonte: Bhaduri, S., et al., Precipitazione di calcite microbiologicamente indotta mediata da Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra il metodo di arricchimento di Sporosarcina pasteurii con urea e cloruro di calcio per innescare l'attività dell'ureasi, portando alla formazione di cristalli di calcite visibili attraverso la precipitazione di calcite microbiologicamente indotta, o MICP.

Precipitazione di calcite indotta microbiologicamente da Sporosarcina pasteurii

È stato sviluppato un metodo per individuare endospore batteriche da comunità microbiche complesse per eseguire colture su misura o studi molecolari di questo gruppo di batteri.

Isolamento fisico di Endospore da campioni ambientali da mirata Lisi di cellule vegetative

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L'isolamento di microbi resistenti ai metalli pesanti dalle sorgenti geotermiche è un argomento caldo per lo sviluppo di biosistemi di biorisanamento e monitoraggio ambientale. Questo studio fornisce un approccio metodologico per isolare e identificare i batteri tolleranti ai metalli pesanti dalle sorgenti termali.

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Produzione e analisi di mattoni in biocemento Sporosarcina pasteurii utilizzando stampi personalizzati stampati in 3D per prove di compressione non confinate

Abbiamo sintetizzato nanostars oro a forma di stella d'argento con un metodo semi mediata della crescita. Il diametro del nanostars varia da 200 a 300 nm e il numero di punte variano da 7 a 10. Le nanoparticelle hanno una vasta modalità di risonanza plasmonica di superficie centrato nel vicino infrarosso.

Sintesi Nanostar oro con un metodo d&#39;argento crescita Seed Mediated

Scopri la precipitazione di calcite indotta microbiologicamente con Sporosarcina pasteurii per la biomineralizzazione. Questo metodo standardizzato migliora la resistenza compressiva dei materiali e facilita la ricerca in ingegneria ambientale.

Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da

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