Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori In Vivo

L'obiettivo generale di questo video è quello di descrivere la metodologia per la costruzione e il test di Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Reporters, o CNiFER, che possono essere utilizzati per monitorare otticamente il rilascio di specifici neurotrasmettitori in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze riguardanti i tempi e il rilascio di neuromodulatori nel cervello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere adattata a qualsiasi tipo di neurotrasmettitore o neuromodulatore, che segnala attraverso GPCS.

La dimostrazione regionale di questo metodo è utile. Si tratta dell'iniezione in vivo e il successivo imaging dei CNiFER è tecnicamente impegnativo. Per iniziare questa procedura, vedere le cellule HEK293 che contengono il rivelatore di calcio a base frontale e la proteina g chimerica in un pallone T-25.

Quindi, far crescere le cellule in un incubatore umidificato, a 37 gradi Celsius, con il cinque percento di CO2, fino a circa il 50% di conflussi. Successivamente, aspirare il materiale dalla fiaschetta T-25. Aggiungere due millilitri della miscela di terreno del virus lenta e incubare il pallone T-25 a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2.

Il giorno successivo, raccogliere le cellule HEK293 infette aggiungendo un millilitro di tripsina. Quindi, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno di coltura HEK293. Seminare un millilitro di cellule in un pallone T-75 per il congelamento e la conservazione e 1,5 millilitri di cellule in un pallone T-25 per l'analisi FACS.

Per la curva agonista a 10 punti, per testare le cellule infette, seminare le prime due file di una piastra da 96 pozzetti rivestita di fibronectina con 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Quindi, incubare le cellule HEK293 che crescono in un pallone T-25, un pallone T-75 e una piastra a 96 pozzetti fino a circa il 90% di confluenza a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per uno o due giorni. Prima dell'analisi FACS, determinare l'espressione funzionale del GPCR preparando una piastra di farmaco con 10 diverse concentrazioni di agonisti che si collocano tra parentesi dell'EC 50 previsto.

Prepara diverse concentrazioni di agonista utilizzando un metodo di diluizione seriale e crea un modello per tenere traccia delle concentrazioni del farmaco. Quindi, impostare la temperatura del lettore di piastre su 37 gradi Celsius. Quindi, programmare il lettore di piastre fluorimetriche a 96 pozzetti per misurare il fret, ed eseguire trasferimenti di soluzioni.

Per misurare i tasti con un sensore di calcio basato su tasti geneticamente codificato, TNXXL, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 436 più o meno 4,5 nanometri. Quindi, impostare i filtri di emissione e i filtri di intercettazione per ECFP e citrino. Successivamente, programmare il lettore di piastre per misurare le emissioni ogni quattro secondi, per un totale di 180 secondi.

Scegli le opzioni per il volume della piastra di 100 microleader, l'altezza della pipetta di 150 microlitri e l'erogazione di 50 microlitri di farmaco dalla triplice piastra composta. Impostare il punto temporale per la somministrazione del farmaco a 30 secondi. Successivamente, aspirare il terreno dalle file A e B e aggiungere 100 microlitri di ACSF alla piastra sniffer a 96 pozzetti, che è circa il 90% confluente.

Quindi, caricare la piastra per farmaci a tre vasche e la piastra sniffer a 96 pozzetti nel lettore di piastre. Attendere 30 minuti per equilibrare le piastre a 37 gradi Celsius, prima di iniziare il programma. Dopo l'esecuzione del lettore di piastre, esportare i valori del lettore di fluorescenza in un file di testo.

Quindi, importa questo file in un modello di foglio di calcolo precedentemente creato che normalizza le intensità della florescenza alle linee di base pre-stimolo, calcola il rapporto di fret di picco per ciascuna concentrazione di agonista e genera una curva dose-risposta. Preparare la pipetta per iniezione CNiFER inserendo un capillare di vetro su un estrattore di elettrodi verticale. Utilizzare un paio di pinze per rompere la punta dell'elettrodo a un diametro di circa 40 micrometri.

Posizionare una spugna imbevuta di ACSF su una finestra del cranio di due per tre millimetri di spessore precedentemente formata di un topo anestetizzato, per mantenerla umida mentre si preparano le cellule per l'iniezione. Successivamente, raccogli il clone CNiFER che è stato coltivato in un pallone T-75 a circa l'80% di confluenza. Aspirare il terreno e lavare le cellule con PBS sterile.

Rimuovere il PBS e utilizzare 10 millilitri di ACFS per rimuovere le cellule dal fondo del pallone. Quindi, tritcherare le cellule per dissociare i grumi cellulari. Centrifugare per due minuti in una centrifuga per colture cellulari.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di ACSF. Successivamente, centrifugare per 30 secondi a 1400 volte G, e rimuovere il surnatante, lasciando un pellet, coperto di ACSF. Successivamente, riempire nuovamente la pipetta di iniezione con olio minerale.

Caricare la pipetta su un nano iniettore. Mettere cinque microlitri di sospensione cellulare CNiFER su una striscia di pellicola di plastica di paraffina vicino alla preparazione del topo. Aspirare le cellule CNiFER nella pipetta estratta.

A questo punto, spostare la pipetta sulle coordinate x e y di destinazione. Abbassare le pipette, e forare il cranio assottigliato, preparato in precedenza. Continuare a circa 200-400 micrometri sotto la superficie del cranio, negli strati due e tre della corteccia.

Iniettare 4,6 nanolitri di cellule CNiFER nel sito più profondo con il nano iniettore. Notare il movimento nell'interfaccia dell'olio e della cella. Quindi, attendi cinque minuti affinché le celle vengano erogate.

Estrarre la pipetta a circa 100 micrometri e iniettare altri 4,6 nanolitri di cellule CNiFER e di nuovo, attendere cinque minuti. Successivamente, estrarre la pipetta lentamente e delicatamente per evitare il riflusso dei CNiFER. In questa procedura, posizionare la piattaforma di imaging con il mouse trattenuto sotto un obiettivo a immersione in acqua 10x in un microscopio per imaging a due fotoni.

Inserire il cubo filtrante per l'imaging dei tasti che ha uno specchio dicroico a 505 nanometri e filtri passa-banda che vanno da 460 nanometri a 500 nanometri per misurare l'ECFP e da 520 nanometri a 560 nanometri per misurare il citrino. Quindi, aggiungere l'ACSF al pozzetto, contenente la finestra del cranio assottigliata e abbassare l'obiettivo di immersione in acqua 10x nell'ACSF. Utilizzare l'oculare in combinazione con la lampada al mercurio e il cubo del filtro GFP per localizzare i CNiFER.

Ora passa all'obiettivo a immersione in acqua 40x. Quindi, selezionare il percorso della luce appropriato per l'imaging a due fotoni. Accendere il laser a impulsi a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Selezionare la lunghezza d'onda di 820 nanometri e un'impostazione di potenza compresa tra il 5 e il 15%Impostare la tensione pmt uno e pmt due su un valore submassimale, in genere 500-1000 volt, a seconda del pmt. Quindi, impostare il guadagno su uno per ogni canale e azzerare la posizione z per l'obiettivo. Abbassare l'obiettivo a circa 100-200 micrometri dalla superficie corticale e avviare la scansione xy.

Regola la potenza, il guadagno e la tensione pmt del laser per ciascun canale per ottimizzare il rapporto segnale/rumore della fioritura del CNiFER. Quindi, utilizzare il software per limitare l'imaging a una regione che contiene le celle CNiFER e a una regione di sfondo. Selezionare la linea del cowman, con una media di due, per un rapporto segnale/rumore adeguato, e utilizzare una velocità di scansione di 3 a un hertz a quattro microsecondi per pixel.

Successivamente, disegna un ROI attorno alle celle CNiFER. Circonda circa tre o quattro celle per piano. Imposta l'analisi in tempo reale delle intensità medie del ROI.

Quindi, avviare l'acquisizione per monitorare la florescenza CNiFER nel tempo e iniziare la stimolazione elettrica o l'esperimento comportamentale, monitorando il fret. In questo esempio, la risposta del tasto D2R CNiFER è stata misurata su un lettore di piastre con un sistema di somministrazione della soluzione. Questo grafico mostra la risposta ai tasti durante l'applicazione della dopamina ai CNiFER D2.

Si noti che l'emissione di ECFP diminuisce mentre l'emissione di citrino aumenta con la dopamina. Ed ecco un grafico del rapporto dei tasti corrispondente. Di seguito sono mostrate le curve dose-risposta per la risposta dei CNiFER D2 alla dopamina e alla noradrenalina.

Inoltre, vengono presentati i CNiFER di controllo reattivi privi del D2R. Questo grafico a barre mostra la risposta del rapporto di fret per altri neurotrasmettitori e modulatori a 50 nanomolari e un micro molare. Qui, la stimolazione elettrica dei neuroni DA nella substantia nigra, provoca un grande cambiamento nel rapporto di fret per i CNiFER D2.

Si noti come l'ampiezza della risposta aumenti con l'aumentare dell'intensità della stimolazione elettrica. L'accoppiamento della stimolazione con l'iniezione di cocaina aumenta la risposta CNiFER. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare, testare e utilizzare i CNiFER per l'imaging in vivo.

Durante lo sviluppo dei CNiFER, è essenziale mantenere la tecnica sterile, perché queste cellule saranno infine impiantate in topi vivi. La realizzazione dei CNiFERs fornisce uno strumento importante per le ricerche nel campo delle neuroscienze per misurare otticamente il rilascio di qualsiasi neurotrasmettitore, o neuromodulatore, che segnala attraverso un recettore accoppiato a proteine G. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.