Name: Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Scopri come costruire i CNiFERs per il monitoraggio ottico dei neurotrasmettitori in vivo utilizzando cellule HEK293. Questo metodo versatile permette di studiare la dinamica dei neuromodulatori nel cervello in tempo reale.

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Ringraziamo B. Conklin (University of California, San Francisco) per fornire i qi5 G e G QS5 cDNA, A. Schweitzer per l&#39;assistenza con l&#39;elettronica, N. Taylor per l&#39;assistenza con lo screening di cloni, Ian Glaaser e Robert Rifkin per correzione di bozze , e Olivier Griesbeck per TN-XXL. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca attraverso l&#39;Istituto nazionale degli Stati Uniti on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), l&#39;Istituto Nazionale di Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) e il &quot;Neuroscience correlati alla droga di concessione di abuso &quot;formazione attraverso NIDA (DA007315).

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<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La creazione di CNiFERs fornisce una strategia innovativa e unica per misurare otticamente rilascio di neurotrasmettitori nel cervello in vivo. CNiFERs sono ideali per misurare il rilascio extrasinaptica, vale a dire, il volume di conduzione, per neurotrasmettitori. È importante sottolineare che ogni CNiFER possiede le proprietà del GPCR nativa, fornendo una misurazione ottica fisiologica dei cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitori nel cervello. Fino ad oggi, sono stati creati per la rilevazione ...

Per comprendere appieno come i neuroni comunicano nel cervello, è necessario disporre di un metodo per misurare il rilascio di neurotrasmettitori in vivo. Ci sono diverse tecniche consolidate per la misurazione neurotrasmettitori in vivo. Una tecnica comunemente usata è microdialisi, in cui una cannula viene inserita nel cervello e un piccolo volume di liquido cerebrospinale viene raccolto ed analizzato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni e rilevazione elettrochimica 1. Microdialisi ha una risoluzione spaziale dell&#39;ordine di pochi diametri della sonda, ad esempio, ~ 0,5 mm per una microsonda 200 micron di diametro. La risoluzione temporale di questa tecnica, tuttavia, è lento a causa di intervalli di campionamento che tipicamente durano ~ 5 minuti o più 1. Inoltre, le analisi non sono fatti in tempo reale. Un&#39;altra tecnica è scansione veloce voltammetria ciclica (FSCV), che utilizza una sonda in fibra di carbonio che viene inserito nel cervello. FSCV ha eccellenti temperaturaRisoluzione orale (in frazioni), alta sensibilità (nanomolari), e la risoluzione spaziale con diametri della sonda da 5 a 30 micron. Tuttavia, FSCV è limitato ai trasmettitori che producono ossidazione caratteristico profilo riduzione con tensione su una sonda potenziometrica carbonio 2. Una terza tecnica per misurare neurotrasmettitori è direttamente attraverso neurotrasmettitori geneticamente codificato biosensori (NT) 3. Con questo metodo, una proteina di fusione viene creato che contiene un dominio ligando vincolante per un trasmettitore accoppiato ad un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) accoppiamento sede di fluorofori 4 o un GFP permutati 5. A differenza delle precedenti due metodi, questi biosensori sono geneticamente codificati ed espressi sulla superficie di una cellula ospite, come un neurone, attraverso la produzione di animali transgenici o acutamente con l&#39;uso di agenti virali per infettare le cellule. Fino ad oggi, biosensori geneticamente codificati sono stati sviluppati solo per detecting glutammato e GABA 3-5. Limitazioni con queste tecniche sono la bassa sensibilità, nell&#39;intervallo nM, e l&#39;incapacità di espandere il rilevamento del gran numero di trasmettitori, ad esempio, neurotrasmettitori classici, neuropeptidi e neuromodulatori, che segnalano attraverso recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). In realtà, ci sono quasi 800 GPCR nel genoma umano. Per far fronte a queste carenze, abbiamo sviluppato uno strumento innovativo per misura rilascio otticamente di qualsiasi neurotrasmettitore che segnala attraverso un GPCR. CNiFERs (neurotrasmettitore fluorescenti a base di cellule reporter ingegnerizzati) sono cellule HEK293 clonali ingegnerizzate per esprimere un GPCR specifico che, quando stimolato, provoca un aumento intracellulare [Ca 2+] che viene rilevata da un sensore geneticamente codificato FRET-based Ca 2+, TN-XXL. Così, CNiFERs trasformare recettore neurotrasmettitore vincolante in un cambiamento della fluorescenza, fornendo un r ottica tempo reale diretta eead-out di attività neurotrasmettitore locale. Utilizzando il recettore nativo per un determinato neurotrasmettitore, CNiFERs conservano la specificità chimica, affinità e dinamiche temporali dei recettori endogenamente espressi. Ad oggi, abbiamo creato tre tipi di CNiFERs, uno per rilevare acetilcolina usando il recettore M1, uno per rilevare dopamina utilizzando il recettore D2, e uno per rilevare noradrenalina usando l&#39;6,7 recettore tipo a1A. La tecnologia CNiFER è facilmente espandibile e scalabile, rendendolo suscettibile a qualsiasi tipo di GPCR. In questo articolo Giove, descriviamo e illustrare la metodologia per la progettazione, la realizzazione, e la prova CNiFERs vivo per qualsiasi applicazione.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Clonazione: per la generazione di lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon Provetta a fondo tondo in polipropilene ad alta chiarezza</td><td>BD Biosciences 352063</td><td></td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Filtri cellulari Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Piastra Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>a 96 pozzetti, fondo piatto, trasparente</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>piastre per colture cellulari FACS</td></tr><tr><td>a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux fondo trasparente nero&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation puntali per pipette</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Acetilcolina cloruro&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Noradrenalina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopamina cloridrato&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Istamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamma&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinefrina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatina&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc. &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc. &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Sostanza P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Lettore di piastre a fluorescenza e software</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (glucosio alto) con Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Penna/Streptococco antibiotici</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Punomicina&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>CoolCell LX Scatola di congelamento cellulare a tasso controllato senza alcool</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td>Colla cianoacrilica <td>per colture tissutali</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite n. 495</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>film di paraffina plastica&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Elettrodi di vetro</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>trapano portatile</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Frese per trapano</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>chirurgia e iniezione</td></tr> <tr><td>stereotassicaBagno sterilizzante</td><td>FST</td><td>18000-45, chirurgia sterilizzatrice a microsfere calde</td> e camera/maschera di <td>isoflurano per iniezione stereotassica</td></tr><tr><td></td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, macchina per anestesia da tavolo HME 109 con vaporizzatore di isoflurano, flussometro O2, valvola Gang; 564-0852, camera di induzione 16X7X7,5 cm</td><td>per chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Cannocchiale 3D con braccio</td> Chirurgia <td>Zeiss</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>chirurgia della luce</td><td></td><td></td> a fibre ottiche <td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>70 % (v/v) alcol</td><td></td><td></td> isopropilico <td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Povidone-Iodio Prep Pads</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% (iniezione, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>CICLOSPORINA (INIEZIONE, USP)</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Buprenex (iniezione) buprenorfina (0,03 &mu; g per g roditore)</td><td>Chirurgia Sigma-Aldrich</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Chirurgia Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Grip cemento dentale</td><td>Dentsply</td><td>#675571, chirurgia 675572</td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& Chirurgia B</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>n. 0 vetro di copertura</td><td></td><td></td> Fisher <td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>telaio stereotassico.</td><td>Chirurgia Kopf</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Sonda rettale e termoforo</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, regolatore di temperatura CC, 40-90-2-06, 6,5X9,5 cm Termoforo 40-90-5D-02, termistore rettale Chirurgia della sonda</td><td>e breadboard ottica per iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>per imaging</td><td>Chirurgia Thorlabs</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (elastomero siliconico)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Sutura&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Emostatici Halsted-Mosquito per studenti</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>91308-12</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Kit cauterizzatore per piccoli vasi</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18000-00</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Sterilizzatori per perline calde</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18000-45</td><td>chirurgia e iniezione</td></tr> <tr><td>stereotassicaCustodia per strumenti con tappetino in silicone</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Contenitori per sterilizzazione in plastica con tappetino in silicone</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>per chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Oscilloscopio a fluorescenza a stadio fisso 2P per imaging in vivo</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>Laser multifotone</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>Green Laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laser</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>xy base traslazionale</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>FRET filter cube per YFP e CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>10x e 40x obiettivi ad immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td></td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>tavolo d'aria</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo imaging</td></tr> a <tr><td>tenuta di luce con gabbia a tenuta di luce costruita su misura</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo</td></tr></tbody></table>

costruzione di cell-based neurotrasmettitore fluorescenti engineered reporters (cnifers) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Basate sulle cellule neurotrasmettitore fluorescenti reporter ingegnerizzati (CNiFERs) fornire un nuovo strumento per i neuroscienziati di rilevare visivamente il rilascio di neurotrasmettitori nel cervello in vivo. Una specifica CNiFER è creata da una cellula embrionali renali umane che esprime stabilmente uno specifico recettore accoppiato alla proteina G, che le coppie di G q / 11 proteine ​​G, e un FRET-based Ca 2+ -detector, TN-XXL. L&#39;attivazione del recettore porta ad un aumento nel segnale FRET. CNiFERs hanno una sensibilità nm e una risposta temporale di secondi perché un clone CNiFER utilizza il recettore nativo per un particolare neurotrasmettitore, ad esempio, D2R per la dopamina. CNiFERs sono direttamente impiantati nel cervello, consentendo loro di percepire il rilascio di neurotrasmettitore con una risoluzione spaziale di meno di cento micron, che li rende ideali per misurare il volume di trasmissione in vivo. CNiFERs può anche essere usata per selezionare altri farmaci per il potenziale reattività incrociata in vivo. Recentemente abbiamo ampliato la famiglia di CNiFERs per includere GPCR quella coppia a G I / O G proteine. CNiFERs sono disponibili per rilevare acetilcolina (ACh), dopamina (DA) e noradrenalina (NE). Dato che ogni GPCR può essere utilizzato per creare un romanzo CNiFER e che ci sono circa 800 GPCR nel genoma umano, che descriviamo qui la procedura generale per progettare, realizzare e testare qualsiasi tipo di CNiFER.

Un CNiFER è derivato da una cellula umana embrionali renali (HEK293) che è progettato per esprimere stabilmente almeno due proteine: una specifica proteina G recettori accoppiati (GPCR) e geneticamente codificato sensore [Ca 2+], TN-XXL. TN-XXL subisce Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) tra il ciano e giallo fluorescenti proteine, rispettivamente ECFP e citrino,, in risposta a Ca 2+ ioni 6,15. Attivazione GPCRs che coppia a endogeno G q</s...

Vi presentiamo un protocollo per creare celle a base di neurotrasmettitore fluorescenti reporter ingegnerizzati (CNiFERs) per la rilevazione ottica del rilascio di neurotrasmettitore volumetrico.

Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

L'obiettivo generale di questo video è descrivere la metodologia per la costruzione e il collaudo di sensori fluorescenti basati su cellule per neurotrasmettitori, o CNiFERs, che possono essere utilizzati per monitorare otticamente il rilascio di specifici neurotrasmettitori in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella neuroscienza riguardo al momento e al rilascio di neuromodulatori nel cervello. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere adattata per qualsiasi tipo di neurotrasmettitore o neuromodulatore che segnala attraverso GPCR.La dimostrazione regionale di questo metodo è utile. L'iniezione in vivo e la successiva acquisizione di immagini dei CNiFERs sono tecnicamente complesse. Per iniziare questa procedura, osservare le cellule HEK293 che contengono il sensore di calcio basato sul fronte e la proteina G chimerica in una fiasca T-25.Quindi, coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2, fino a raggiungere una confluenza del 50%. Successivamente, aspirare il mezzo dal flacone T-25. Aggiungere due millilitri della miscela di mezzo virale lentivirale e incubare il flacone T-25 a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2.Il giorno successivo, raccogliere le cellule HEK293 infette aggiungendo un millilitro di tripsina. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di crescita per HEK293. Seminare un millilitro di cellule in una fiasca T-75 per la congelazione e conservazione, e 1,5 millilitri di cellule in una fiasca T-25 per l'analisi FACS.Per la curva dose-risposta a 10 punti con agonista, per testare le cellule infette, seminare le prime due file di una piastra da 96 pozzetti rivestita con fibronectina con 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Successivamente, incubare le cellule HEK293 in crescita in una fiasca T-25, una fiasca T-75 e in una piastra da 96 pozzetti fino a raggiungere una confluenza del 90% a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 per uno o due giorni. Prima dell'analisi FACS, determinare l'espressione funzionale del GPCR preparando una piastra farmacologica con 10 diverse concentrazioni di agonista che racchiudano la prevista EC 50.Preparare diverse concentrazioni di agonista utilizzando un metodo di diluizione seriale e creare un modello per tenere traccia delle concentrazioni del farmaco. Successivamente, impostare la temperatura del lettore di piastre a 37 gradi Celsius. Quindi, programmare il lettore fluorometrico a 96 pozzetti per misurare il FRET ed eseguire i trasferimenti di soluzione.Per misurare il fret con un sensore genetico di calcio basato sul fret, TNXXL, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 436 più o meno 4,5 nanometri. Successivamente, impostare i filtri di emissione e i filtri taglia-alto per ECFP e citrina. Quindi, programmare il lettore di piastre per misurare le emissioni ogni quattro secondi, per un totale di 180 secondi.Scegliere le opzioni per un volume della piastra di 100 microleader, un'altezza della pipetta di 150 microlitri e la somministrazione di 50 microlitri di farmaco dalla piastra del composto triplicato. Impostare il punto temporale per la somministrazione del farmaco a 30 secondi. Successivamente, aspirare il mezzo dalle righe A e B e aggiungere 100 microlitri di ACSF alla piastra sniffatrice a 96 pozzetti, che è circa al 90% confluenti.Quindi, caricare la piastra con il farmaco triplicato e la piastra sniffer da 96 pozzetti nel lettore di piastre. Attendere 30 minuti per permettere l'equilibrazione delle piastre a 37 gradi Celsius, prima di avviare il programma. Al termine della lettura della piastra, esportare i valori di fluorescenza in un file di testo.Quindi, importare questo file in un modello di foglio di calcolo precedentemente creato che normalizza le intensità di fluorescenza rispetto alle linee di base pre-stimolo, calcola il rapporto massimo FRET per ciascuna concentrazione dell'agonista e genera una curva dose-risposta. Preparare la pipetta per l'iniezione di CNiFER posizionando una capillare di vetro su un estrattore verticale di elettrodi. Utilizzare una pinzetta per rompere la punta dell'elettrodo fino a un diametro di circa 40 micrometri.Posizionare una spugna inumidita con ACSF su una finestra cranica sottile di due per tre millimetri precedentemente creata in un topo anestetizzato, per mantenerla umida durante la preparazione delle cellule per l'iniezione. Successivamente, raccogliere la linea cellulare CNiFER coltivata in un flask T-75 fino a una confluenza di circa l'80%. Aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule con PBS sterile.Rimuovere il PBS e utilizzare 10 millilitri di ACFS per staccare le cellule dal fondo della fiasca. Successivamente, pipettare ripetutamente le cellule per dissociare gli aggregati cellulari. Centrifugare per due minuti in una centrifuga per colture cellulari.Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di ACSF. Successivamente, centrifugare per 30 secondi a 1400 ×g e rimuovere il soprannatante, lasciando il pellet ricoperto di ACSF. In seguito, riempire il retro della pipetta di iniezione con olio minerale.Caricare la pipetta su un nano-iniettore. Depositare cinque microlitri di sospensione cellulare di CNiFER su una striscia di pellicola di paraffina plastica vicino al preparato del topo. Aspirare le cellule CNiFER nella pipetta prelevata.Ora, spostare la pipetta sulle coordinate x e y di destinazione. Abbassare le pipette e perforare il cranio precedentemente assottigliato. Continuare fino a circa 200-400 micrometri sotto la superficie del cranio, nei livelli due e tre della corteccia.Iniettare 4,6 nanolitri di cellule CNiFER nel sito più profondo utilizzando l'injector nano. Osservare il movimento all'interfaccia tra olio e cellule. Attendere quindi cinque minuti affinché le cellule si distribuiscano.Ritirare la pipetta di circa 100 micrometri ed iniettare altri 4,6 nanolitri di cellule CNiFER, quindi attendere nuovamente cinque minuti. Successivamente, ritirare lentamente e delicatamente la pipetta per evitare il reflusso delle cellule CNiFER. In questa procedura, posizionare la piattaforma di imaging con il mouse dal capo immobilizzato sotto un obiettivo ad immersione in acqua 10x in un microscopio di imaging a due fotoni.Inserire il cubo filtro per l'immagine FRET che ha uno specchio dicromatico a 505 nanometri e filtri a banda passante che vanno da 460 nanometri a 500 nanometri per la misurazione di ECFP e da 520 nanometri a 560 nanometri per la misurazione della citrina. Successivamente, aggiungere ACSF nel pozzetto, contenente la finestra di cranio sottile, e abbassare l'obiettivo a immersione in acqua da 10x nell'ACSF. Utilizzare l'oculare in combinazione con la lampada a mercurio e il cubo filtro GFP per localizzare i CNiFERs.Ora, passare all'obiettivo a immersione in acqua 40x. Successivamente, selezionare il percorso ottico appropriato per l'immagine a due fotoni. Accendere il laser a impulsi femtosecondi nell'infrarosso vicino.Selezionare la lunghezza d'onda di 820 nanometri e un'impostazione di potenza compresa tra il 5 e il 15%. Impostare la tensione del pmt uno e del pmt due a un valore submassimale, tipicamente tra 500 e 1000 volt, a seconda del pmt. Successivamente, impostare il guadagno a uno per ogni canale e azzerare la posizione z dell'obiettivo. Abbassare l'obiettivo di circa 100-200 micrometri rispetto alla superficie corticale e avviare la scansione xy.Regolare la potenza del laser, il guadagno e il voltaggio del PMT per ogni canale al fine di ottimizzare il rapporto segnale-rumore della fluorescenza dei CNiFER. Successivamente, utilizzare il software per limitare l'acquisizione a una regione contenente le cellule CNiFER e a una regione di fondo. Selezionare la linea Cowman con media pari a due per ottenere un rapporto segnale-rumore adeguato e utilizzare una velocità di scansione compresa tra 3 e 1 hertz con quattro microsecondi per pixel.In seguito, disegnare un'area di interesse (ROI) attorno alle cellule CNiFER, includendo circa tre o quattro cellule per piano. Configurare l'analisi in tempo reale delle intensità medie dell'ROI.Quindi, avviare l'acquisizione per monitorare nel tempo la fluorescenza dei CNiFER ed iniziare la stimolazione elettrica o l'esperimento comportamentale, monitorando nel contempo il trasferimento di risonanza energetica (fret). In questo esempio, la risposta fret dei CNiFER per il recettore D2 (D2R) è stata misurata mediante un lettore di piastre dotato di un sistema di somministrazione della soluzione. Questo grafico mostra la risposta fret durante l'applicazione della dopamina ai CNiFER D2.Si noti che l'emissione di ECFP diminuisce mentre aumenta l'emissione di citrina in presenza di dopamina. Ecco un grafico del corrispondente rapporto FRET. Sono mostrate qui le curve di dose-risposta alla dopamina e alla noradrenalina per i D2 CNiFERs.Inoltre, vengono presentati i CNiFERs di controllo responsivi privi del recettore D2R. Questo grafico a barre mostra la risposta del rapporto FRET ad altri neurotrasmettitori e modulatori a 50 nanomolari e un micromolare. Qui, la stimolazione elettrica dei neuroni dopaminergici nella sostanza nera induce un ampio cambiamento nel rapporto FRET nei CNiFERs D2.Si noti come l'ampiezza della risposta aumenti con l'intensità crescente della stimolazione elettrica. L'accoppiamento della stimolazione con l'iniezione di cocaina potenzia la risposta del CNiFER. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare, testare e utilizzare i CNiFER per l'imaging in vivo.Durante lo sviluppo dei CNiFERs, è essenziale mantenere una tecnica sterile, poiché queste cellule verranno infine impiantate in topi vivi. La realizzazione dei CNiFERs fornisce uno strumento importante per la ricerca nel campo delle neuroscienze, consentendo di misurare otticamente il rilascio di qualsiasi neurotrasmettitore o neuromodulatore che agisce tramite un recettore accoppiato a proteina G. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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