Name: Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Scopri come costruire i CNiFERs per il monitoraggio ottico dei neurotrasmettitori in vivo utilizzando cellule HEK293. Questo metodo versatile permette di studiare la dinamica dei neuromodulatori nel cervello in tempo reale.

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Ringraziamo B. Conklin (University of California, San Francisco) per fornire i qi5 G e G QS5 cDNA, A. Schweitzer per l&#39;assistenza con l&#39;elettronica, N. Taylor per l&#39;assistenza con lo screening di cloni, Ian Glaaser e Robert Rifkin per correzione di bozze , e Olivier Griesbeck per TN-XXL. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca attraverso l&#39;Istituto nazionale degli Stati Uniti on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), l&#39;Istituto Nazionale di Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) e il &quot;Neuroscience correlati alla droga di concessione di abuso &quot;formazione attraverso NIDA (DA007315).

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La creazione di CNiFERs fornisce una strategia innovativa e unica per misurare otticamente rilascio di neurotrasmettitori nel cervello in vivo. CNiFERs sono ideali per misurare il rilascio extrasinaptica, vale a dire, il volume di conduzione, per neurotrasmettitori. È importante sottolineare che ogni CNiFER possiede le proprietà del GPCR nativa, fornendo una misurazione ottica fisiologica dei cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitori nel cervello. Fino ad oggi, sono stati creati per la rilevazione ...

Per comprendere appieno come i neuroni comunicano nel cervello, è necessario disporre di un metodo per misurare il rilascio di neurotrasmettitori in vivo. Ci sono diverse tecniche consolidate per la misurazione neurotrasmettitori in vivo. Una tecnica comunemente usata è microdialisi, in cui una cannula viene inserita nel cervello e un piccolo volume di liquido cerebrospinale viene raccolto ed analizzato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni e rilevazione elettrochimica 1. Microdialisi ha una risoluzione spaziale dell&#39;ordine di pochi diametri della sonda, ad esempio, ~ 0,5 mm per una microsonda 200 micron di diametro. La risoluzione temporale di questa tecnica, tuttavia, è lento a causa di intervalli di campionamento che tipicamente durano ~ 5 minuti o più 1. Inoltre, le analisi non sono fatti in tempo reale. Un&#39;altra tecnica è scansione veloce voltammetria ciclica (FSCV), che utilizza una sonda in fibra di carbonio che viene inserito nel cervello. FSCV ha eccellenti temperaturaRisoluzione orale (in frazioni), alta sensibilità (nanomolari), e la risoluzione spaziale con diametri della sonda da 5 a 30 micron. Tuttavia, FSCV è limitato ai trasmettitori che producono ossidazione caratteristico profilo riduzione con tensione su una sonda potenziometrica carbonio 2. Una terza tecnica per misurare neurotrasmettitori è direttamente attraverso neurotrasmettitori geneticamente codificato biosensori (NT) 3. Con questo metodo, una proteina di fusione viene creato che contiene un dominio ligando vincolante per un trasmettitore accoppiato ad un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) accoppiamento sede di fluorofori 4 o un GFP permutati 5. A differenza delle precedenti due metodi, questi biosensori sono geneticamente codificati ed espressi sulla superficie di una cellula ospite, come un neurone, attraverso la produzione di animali transgenici o acutamente con l&#39;uso di agenti virali per infettare le cellule. Fino ad oggi, biosensori geneticamente codificati sono stati sviluppati solo per detecting glutammato e GABA 3-5. Limitazioni con queste tecniche sono la bassa sensibilità, nell&#39;intervallo nM, e l&#39;incapacità di espandere il rilevamento del gran numero di trasmettitori, ad esempio, neurotrasmettitori classici, neuropeptidi e neuromodulatori, che segnalano attraverso recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). In realtà, ci sono quasi 800 GPCR nel genoma umano. Per far fronte a queste carenze, abbiamo sviluppato uno strumento innovativo per misura rilascio otticamente di qualsiasi neurotrasmettitore che segnala attraverso un GPCR. CNiFERs (neurotrasmettitore fluorescenti a base di cellule reporter ingegnerizzati) sono cellule HEK293 clonali ingegnerizzate per esprimere un GPCR specifico che, quando stimolato, provoca un aumento intracellulare [Ca 2+] che viene rilevata da un sensore geneticamente codificato FRET-based Ca 2+, TN-XXL. Così, CNiFERs trasformare recettore neurotrasmettitore vincolante in un cambiamento della fluorescenza, fornendo un r ottica tempo reale diretta eead-out di attività neurotrasmettitore locale. Utilizzando il recettore nativo per un determinato neurotrasmettitore, CNiFERs conservano la specificità chimica, affinità e dinamiche temporali dei recettori endogenamente espressi. Ad oggi, abbiamo creato tre tipi di CNiFERs, uno per rilevare acetilcolina usando il recettore M1, uno per rilevare dopamina utilizzando il recettore D2, e uno per rilevare noradrenalina usando l&#39;6,7 recettore tipo a1A. La tecnologia CNiFER è facilmente espandibile e scalabile, rendendolo suscettibile a qualsiasi tipo di GPCR. In questo articolo Giove, descriviamo e illustrare la metodologia per la progettazione, la realizzazione, e la prova CNiFERs vivo per qualsiasi applicazione.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Clonazione: per la generazione di lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon Provetta a fondo tondo in polipropilene ad alta chiarezza</td><td>BD Biosciences 352063</td><td></td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Filtri cellulari Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Piastra Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>a 96 pozzetti, fondo piatto, trasparente</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>piastre per colture cellulari FACS</td></tr><tr><td>a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux fondo trasparente nero&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation puntali per pipette</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Acetilcolina cloruro&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Noradrenalina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopamina cloridrato&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Istamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamma&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinefrina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatina&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc. &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc. &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Sostanza P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Lettore di piastre a fluorescenza e software</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (glucosio alto) con Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Penna/Streptococco antibiotici</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Punomicina&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Coltura tissutale</td></tr><tr><td>CoolCell LX Scatola di congelamento cellulare a tasso controllato senza alcool</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td>Colla cianoacrilica <td>per colture tissutali</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite n. 495</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>film di paraffina plastica&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Elettrodi di vetro</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>trapano portatile</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Frese per trapano</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>chirurgia e iniezione</td></tr> <tr><td>stereotassicaBagno sterilizzante</td><td>FST</td><td>18000-45, chirurgia sterilizzatrice a microsfere calde</td> e camera/maschera di <td>isoflurano per iniezione stereotassica</td></tr><tr><td></td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, macchina per anestesia da tavolo HME 109 con vaporizzatore di isoflurano, flussometro O2, valvola Gang; 564-0852, camera di induzione 16X7X7,5 cm</td><td>per chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Cannocchiale 3D con braccio</td> Chirurgia <td>Zeiss</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>chirurgia della luce</td><td></td><td></td> a fibre ottiche <td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>70 % (v/v) alcol</td><td></td><td></td> isopropilico <td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Povidone-Iodio Prep Pads</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% (iniezione, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>CICLOSPORINA (INIEZIONE, USP)</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Buprenex (iniezione) buprenorfina (0,03 &mu; g per g roditore)</td><td>Chirurgia Sigma-Aldrich</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Chirurgia Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Grip cemento dentale</td><td>Dentsply</td><td>#675571, chirurgia 675572</td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& Chirurgia B</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>n. 0 vetro di copertura</td><td></td><td></td> Fisher <td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>telaio stereotassico.</td><td>Chirurgia Kopf</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Sonda rettale e termoforo</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, regolatore di temperatura CC, 40-90-2-06, 6,5X9,5 cm Termoforo 40-90-5D-02, termistore rettale Chirurgia della sonda</td><td>e breadboard ottica per iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>per imaging</td><td>Chirurgia Thorlabs</td><td></td><td>e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (elastomero siliconico)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Sutura&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Emostatici Halsted-Mosquito per studenti</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>91308-12</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Kit cauterizzatore per piccoli vasi</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18000-00</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Sterilizzatori per perline calde</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18000-45</td><td>chirurgia e iniezione</td></tr> <tr><td>stereotassicaCustodia per strumenti con tappetino in silicone</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Contenitori per sterilizzazione in plastica con tappetino in silicone</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>per chirurgia e iniezione stereotassica</td></tr><tr><td>Oscilloscopio a fluorescenza a stadio fisso 2P per imaging in vivo</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>Laser multifotone</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>Green Laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laser</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>xy base traslazionale</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>FRET filter cube per YFP e CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>10x e 40x obiettivi ad immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td></td><td>imaging in vivo</td></tr><tr><td>tavolo d'aria</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo imaging</td></tr> a <tr><td>tenuta di luce con gabbia a tenuta di luce costruita su misura</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo</td></tr></tbody></table>

costruzione di cell-based neurotrasmettitore fluorescenti engineered reporters (cnifers) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Basate sulle cellule neurotrasmettitore fluorescenti reporter ingegnerizzati (CNiFERs) fornire un nuovo strumento per i neuroscienziati di rilevare visivamente il rilascio di neurotrasmettitori nel cervello in vivo. Una specifica CNiFER è creata da una cellula embrionali renali umane che esprime stabilmente uno specifico recettore accoppiato alla proteina G, che le coppie di G q / 11 proteine ​​G, e un FRET-based Ca 2+ -detector, TN-XXL. L&#39;attivazione del recettore porta ad un aumento nel segnale FRET. CNiFERs hanno una sensibilità nm e una risposta temporale di secondi perché un clone CNiFER utilizza il recettore nativo per un particolare neurotrasmettitore, ad esempio, D2R per la dopamina. CNiFERs sono direttamente impiantati nel cervello, consentendo loro di percepire il rilascio di neurotrasmettitore con una risoluzione spaziale di meno di cento micron, che li rende ideali per misurare il volume di trasmissione in vivo. CNiFERs può anche essere usata per selezionare altri farmaci per il potenziale reattività incrociata in vivo. Recentemente abbiamo ampliato la famiglia di CNiFERs per includere GPCR quella coppia a G I / O G proteine. CNiFERs sono disponibili per rilevare acetilcolina (ACh), dopamina (DA) e noradrenalina (NE). Dato che ogni GPCR può essere utilizzato per creare un romanzo CNiFER e che ci sono circa 800 GPCR nel genoma umano, che descriviamo qui la procedura generale per progettare, realizzare e testare qualsiasi tipo di CNiFER.

Un CNiFER è derivato da una cellula umana embrionali renali (HEK293) che è progettato per esprimere stabilmente almeno due proteine: una specifica proteina G recettori accoppiati (GPCR) e geneticamente codificato sensore [Ca 2+], TN-XXL. TN-XXL subisce Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) tra il ciano e giallo fluorescenti proteine, rispettivamente ECFP e citrino,, in risposta a Ca 2+ ioni 6,15. Attivazione GPCRs che coppia a endogeno G q</s...

Vi presentiamo un protocollo per creare celle a base di neurotrasmettitore fluorescenti reporter ingegnerizzati (CNiFERs) per la rilevazione ottica del rilascio di neurotrasmettitore volumetrico.

Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

L'obiettivo generale di questo video è descrivere la metodologia per la costruzione e il collaudo di sensori fluorescenti basati su cellule per neurotrasmettitori, o CNiFERs, che possono essere utilizzati per monitorare otticamente il rilascio di specifici neurotrasmettitori in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella neuroscienza riguardo al momento e al rilascio di neuromodulatori nel cervello. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere adattata per qualsiasi tipo di neurotrasmettitore o neuromodulatore che segnala attraverso GPCR.La dimostrazione regionale di questo metodo è utile. L'iniezione in vivo e la successiva acquisizione di immagini dei CNiFERs sono tecnicamente complesse. Per iniziare questa procedura, osservare le cellule HEK293 che contengono il sensore di calcio basato sul fronte e la proteina G chimerica in una fiasca T-25.Quindi, coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2, fino a raggiungere una confluenza del 50%. Successivamente, aspirare il mezzo dal flacone T-25. Aggiungere due millilitri della miscela di mezzo virale lentivirale e incubare il flacone T-25 a 37 gra

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Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina cambiamenti all'interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

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Fonte: Lacin, E., et al. Costruzione di reporter ingegnerizzati fluorescenti per neurotrasmettitori cellulari (CNiFER) per il rilevamento ottico di neurotrasmettitori in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una tecnica per l'imaging del rilascio di neurotrasmettitori in vivo utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti di neurotrasmettitori basati su cellule (CNiFER), cellule reporter specializzate pre-iniettate nella corteccia del topo. Posizionato sotto un microscopio a due...

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Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e...

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Questa nuova tecnologia basata sulla fluorescenza consente il monitoraggio a lungo termine della trascrizione dei geni dell'orologio circadiano nel nucleo soprachiasmatico (SCN) di topi liberi di muoversi in tempo reale e ad alta risoluzione temporale.

In Vivo Monitoraggio dell'espressione genica orologio circadiano nel nucleo soprachiasmatico Mouse mediante fluorescenza reporter

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Scopri come costruire i CNiFERs per il monitoraggio ottico dei neurotrasmettitori in vivo utilizzando cellule HEK293. Questo metodo versatile permette di studiare la dinamica dei neuromodulatori nel cervello in tempo reale.

Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori In Vivo (Video) | JoVE Journal

Costruzione di Cell-based neurotrasmettitore fluorescenti Engineered Reporters (CNiFERs) per il rilevamento ottico dei neurotrasmettitori

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