Multi-esone skipping Utilizzando oligonucleotidi antisenso Cocktail nella distrofia muscolare Canine X-linked

L'obiettivo generale di questo esperimento è esaminare l'efficacia e la tossicità del salto multiplo dell'esone utilizzando oligonucleotidi antisenso cocktail o AON in un modello canino di distrofia muscolare di Duchenne o DMD. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca traslazionale sulla terapia di salto dell'esone antisenso, ad esempio se gli oligonucleotidi antisenso possono indurre il salto multiplo dell'esone e distruggere l'espressione della distrofia in un modello animale di grandi dimensioni. Il vantaggio principale dell'utilizzo del modello canino in uno studio è che i risultati terapeutici negli animali più grandi possono essere estrapolati in modo più affidabile ai pazienti con DMD.

Sebbene il salto dell'esone sia una terapia molto promettente per la DMD, può essere applicato anche ad altre malattie genetiche, come la distrofia muscolare congenita e la distrofia muscolare dei cingoli. La dimostrazione degli esperimenti in vitro sarà fatta dal Dr.Yoshitsugu Aoki, il nostro capo laboratorio, e la dimostrazione degli esperimenti in vivo sarà fatta dal Dr.Mutsuki Kuraoka, un borsista post-dottorato del mio dipartimento. Dopo aver progettato gli AON secondo il protocollo di testo, utilizzare piastre a 6 pozzetti per seminare da uno a cinque volte 10 al terzo mioblasti CXMD per centimetro quadrato in tre millilitri di DMEM con il 10% di FBS e l'1% di pen-streptococco.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino al 60-80% confluente. Quando le cellule raggiungono la confluenza desiderata, utilizzare un terreno di sieroplastica ridotto per diluire un reagente di trasfezione dei liposomi cationici fino a un volume totale di 100 microlitri e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Quindi, con terreno sierico ridotto, diluire gli AON fino a un volume finale di 100 microlitri.

Combinare il reagente di trasfezione diluito con gli AON diluiti e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Nel frattempo, rimuovere il terreno dalle celle e utilizzare un terreno fresco per lavare le celle tre volte. Quindi, aggiungere 0,8 millilitri di terreno alla miscela di trasfezione, quindi aggiungere l'intera soluzione alle cellule appena lavate.

Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi, aggiungere il terreno di differenziazione, o DM, alle cellule e incubare per un massimo di 10 giorni affinché avvenga la differenziazione. A partire dal terzo giorno, controlla la differenziazione.

Per eseguire la trasfezione morfolino dei mioblasti del cane, coltivare i mioblasti CXMD come dimostrato in precedenza in questo video. Scaldare i morpholinos del cocktail a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere un reagente per la somministrazione di peptidi e regolare il morfolino a una concentrazione finale da tre a sei micromolari.

Successivamente, utilizzare DM per sostituire il terreno nei mioblasti e aggiungere il morpolino a ciascun pozzetto a una concentrazione finale di un micromolare. Incubare per 16-18 ore. Quindi, per raccogliere le cellule per l'estrazione dell'RNA, aggiungere un millilitro di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio alle cellule per staccarle dalla piastra.

Dopo aver incubato le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti, trasferire le cellule in provette da 1,5 millilitri. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio a ciascuna provetta e incubare a temperatura ambiente per due minuti fino a quando non si possono vedere tre strati separati, lo strato di RNA, lo strato proteico e lo strato di DNA. Centrifugare sulle provette a 12.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi, rimuovere lo strato superiore di surnatante e trasferirlo in un tubo contenente 500 microlitri di isopropanolo. Centrifugare le provette del surnatante prima di rimuovere il surnatante e salvare il pellet di RNA. Utilizzare l'etanolo per lavare il pellet e centrifugare a 8.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Capovolgere il tubo per 15 minuti per far evaporare l'etanolo residuo prima di aggiungere da 15 a 30 microlitri di acqua priva di RNasi. Quindi, utilizzare la spettroscopia UV-Vis a 260 nanometri per quantificare l'RNA. Per eseguire la RT-PCR, mescolare insieme i seguenti reagenti e aggiungere acqua fino a un volume finale di 25 microlitri.

Posizionare i campioni in un termociclatore ed eseguire il seguente programma. Al termine della corsa, conservare il prodotto a quattro gradi Celsius o 20 gradi Celsius. Per effettuare un'iniezione intramuscolare, dopo aver preparato l'animale per l'intervento chirurgico e averlo anestetizzato secondo il protocollo di testo, utilizzare un bisturi per tagliare la pelle di circa cinque centimetri longitudinalmente sopra il tibiale cranico, oppure contrassegnare CT.To siti di iniezione, utilizzare un ago chirurgico e un filo chirurgico per cucire la fascia profonda realizzando due marcatori di punti a intervalli di due centimetri.

È molto importante contrassegnare il sito di iniezione con un filo in quanto ciò consente una biopsia più accurata. Quindi, utilizzando un ago calibro 27, iniettare la concentrazione desiderata di AON nel muscolo e lasciare l'ago per un minuto. Quindi, per eseguire una biopsia muscolare aperta, utilizzare un bisturi chirurgico per rimuovere un pezzo di tessuto muscolare lungo circa due centimetri dal muscolo TC.

Appoggiare la fascia muscolare sul muscolo e utilizzare un filo riassorbibile 000 per chiudere il tessuto. Quindi, utilizzare il filo di nylon 000 per chiudere la pelle. Utilizzando un ago, somministrare un'iniezione intramuscolare di 0,02 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina cloridrato.

Per iniettare un cocktail contenente quantità uguali di ciascun AON in una vena dell'arto, tenendo l'animale secondo il protocollo di testo, inserire un ago venoso a permanenza in una vena dell'arto. Utilizzando una pompa per infusione o un driver per siringa, iniettare 50 millilitri in totale a 2,5 millilitri al minuto per 20 minuti, seguendo le istruzioni del produttore. Ripetere le iniezioni settimanalmente o bisettimanalmente, poiché l'espressione della distrofina si accumulerà con le iniezioni ripetute.

Per eseguire esami del sangue settimanali per esaminare la tossicità, utilizzare un ago per raccogliere tre millilitri di sangue da una delle vene sottocutanee dell'arto anteriore o posteriore. Seguendo le istruzioni del produttore, includere le seguenti valutazioni. Effettuare ulteriori analisi secondo il protocollo di testo.

I mioblasti sono stati trasfettati con varie condizioni di trattamento con 2'OMePS al fine di confrontare l'efficacia di ciascun AON. Il gel mostrato qui rappresenta campioni di RT-PCR da RNA raccolti quattro giorni dopo il trattamento. Le bande più alte sul gel rappresentano prodotti DMD fuori dal fotogramma e sono state osservate nei mioblasti trattati con Ex8A ed Ex8B non trattati.

Ex6A, Ex6B, Ex8A e i mioblasti trattati con cocktail hanno mostrato prodotti in-frame. Il sequenziamento del cDNA ha verificato che gli esoni da 6 a 9 erano stati saltati. Come si vede in questa figura, l'immunocitochimica ha rivelato che le cellule di cane trattate con AON avevano un aumento delle fibre positive alla distrofina rispetto ai campioni non trattati.

Per confrontare l'efficacia di varie condizioni di trattamento con AON, ai cani CXMD è stato iniettato Ex6A o un cocktail di Ex6A, Ex6B ed Ex8A a vari dosaggi. I campioni muscolari colorati per DYS1 mostrano un aumento dell'espressione della distrofina nei campioni trattati con cocktail e le fibre positive alla distrofina aumentano con il dosaggio della distrofina. Dopo iniezioni sistemiche, i cani CXMD trattati con cocktail hanno mostrato un aumento dell'espressione di distrofina rispetto ai cani NT CXMD, sia nei campioni TC che in quelli di muscolo cardiaco.

Tuttavia, i muscoli scheletrici trattati con AON hanno mostrato un'espressione molto più elevata di distrofina rispetto al muscolo cardiaco trattato. Inoltre, i cani CXMD trattati hanno mostrato un miglioramento dell'istopatologia con una significativa diminuzione delle fibre nucleate centralmente rispetto ai cani NT CXMD. Una volta padroneggiati, sia gli esperimenti in vitro che quelli in vivo possono essere eseguiti in un paio d'ore se eseguiti correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare attentamente le condizioni di salute del cane. Dopo il suo sviluppo, il salto sistemico dell'esone ha aperto la strada ai ricercatori in questo campo per avviare studi clinici sull'uomo in pazienti con DMD. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trattare i cani con oligonucleotidi antisenso.