Name: Multi-esone skipping Utilizzando oligonucleotidi antisenso Cocktail nella distrofia muscolare Canine X-linked (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Scopri il salto multi-esone con oligonucleotidi antisenso cocktail nel modello canino di distrofia muscolare di Duchenne. Questo metodo permette il recupero sistemico della distrofina senza tossicità significativa.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Facoltà di Medicina e Odontoiatria dell'Università di Alberta, dal Fondo per la Cattedra di Ricerca Amici di Garrett Cumming, dal Fondo per la Cattedra di Ricerca sulle Scienze Neurologiche di HM Toupin, dalla Distrofia Muscolare Canada, dalla Fondazione per l'Innovazione (CFI) del Canada, dall'Alberta Advanced Education and Technology (AET), dagli Istituti Canadesi di Ricerca Sanitaria (CIHR), dal Viaggio di Jesse - La Fondazione per la Terapia Genica e Cellulare, e l'Istituto di ricerca sulla salute delle donne e dei bambini (WCHRI).

Le tariffe di accesso aperto per questo articolo sono state fornite da Gene Tools, LLC.

Exon skipping è una tecnica terapeutica promettente per il trattamento della DMD. Sia in vitro ed in vivo hanno dimostrato che il multi-esone skipping è fattibile. Qui, l&#39;uso del modello del cane CXMD è discusso. In primo luogo, AONs sono stati progettati utilizzando i programmi di salvataggio-ESE e ESEfinder di indirizzare gli esoni distrofina 6 - 8. La chimica 2&#39;OMePS AON è stato utilizzato per CXMD mioblasti trasfezione e la spina dorsale chimica morfolino AON è stato scelto per gli esperimenti in vivo. vPMOs sono più efficienti di PMOs non modificati, ma a causa della loro maggiore tossicità non sono adatti per iniezioni sistemiche. estrazione di RNA, RT-PCR, e cDNA sequenziamento sono state effettuate su mioblasti CXMD. I cani iniettati con il cocktail PMO erano clinicamente graduata per valutare un miglioramento dei sintomi clinici. Dopo che i cani sono stati umanamente eutanasia, campioni di muscolo sono stati prelevati e preparati per crio-sezionamento. L&#39;emivita della proteina distrofina indotta da AOn è creduto di essere di circa 1 - 2 mesi. cani giovani adulti sono stati utilizzati in questo studio, anche se questi esperimenti può essere fatto con i cani neonatali e cani anziani (&gt; 5 anni). Sezioni muscolari preparati sono stati utilizzati per valutare l&#39;istopatologia e valutare salvataggio della proteina distrofina attraverso Western blotting ed immunoistochimica 48. È importante garantire che il volume della soluzione PMO sia corretto prima iniezione; non riuscendo a farlo avrà effetti significativi sui risultati. Durante iniezioni intramuscolari, pressione sufficiente è necessario per entrare nelle fibre muscolari. Monitoraggio della salute del cane e l&#39;ispezione del sito chirurgico sono importanti per la risoluzione dei problemi. Per monitorare la salute degli animali, gli esami del sangue settimanali e la pesatura devono essere eseguiti. Dopo euthanization dell&#39;animale e preparazione dei campioni di muscolo, un passaggio critico per assicurare sensibilità nella rilevazione distrofina è di utilizzare sia il gel Tris-acetato e il metodo blotting semi-drydurante la procedura Western blotting. Come mostrato nei risultati rappresentativi, mioblasti trattati con Ex6A, Ex6B, Ex8A, e il cocktail (contenente Ex6A, Ex6B, Ex8A, e Ex8B) prodotto in-frame DMD prodotti. Dal momento che Ex8B prodotto prodotti esone-saltato, non è stato utilizzato nei successivi esperimenti in vivo. cDNA sequenziamento ha dimostrato che esoni 6-9 salto si è verificato e immunocitochimica con DYS-2 ha mostrato colorazione restaurato espressione della distrofina nei campioni trattati. cani AON-trattati hanno mostrato un aumento significativo fibre distrofina-positive. Ciò indica che esoni 6-8 venivano saltati e una proteina accorciata è stato prodotto. La quantità di fibre distrofina-positive aumentata quando è stato usato un cocktail di AONs ed era proporzionale AON dosaggio. Immunoblot hanno mostrato un aumento dell&#39;espressione della distrofina nei cani trattati con morpholino sistemici. Il muscolo scheletrico aveva livelli variabili di fibre distrofina; tuttavia, il tessuto cardiaco morfolino-trattati hanno mostrato pocomiglioramento dell&#39;espressione della distrofina. Poiché distrofina ha un alto peso molecolare (427 kDa), rilevamento di piccole quantità di distrofina può essere difficile. Per i migliori risultati, sono stati usati gel Tris-acetato e il metodo di trasferimento semi-dry. HE macchiatura ha mostrato migliorato istopatologia nei cani morpholino-trattata. fibre in posizione centrale-nucleate (CNFs) sono un segno di muscolo malsano e rappresentano cicli di degenerazione muscolare e la rigenerazione. cani CXMD morfolino-trattati hanno mostrato una diminuzione della percentuale di CNFs rispetto ai cani CXMD non trattati. classificazione clinica ha rivelato un miglioramento dei sintomi, come l&#39;aumento camminare e correre capacità, negli animali trattati con morpholino. La durezza dei muscoli è creduto per riflettere atrofia muscolare, in tal modo, è stato incluso nello schema di classificazione 59. La durezza della coscia (arti posteriori) dei muscoli è stata valutata; tuttavia, abbiamo escluso muscolo sartorio cranici perché tendono a mostrare l&#39;ipertrofia piuttosto che l&#39;atrofia in CXMD. cani trattati mostranocato punteggi più bassi di classificazione e aveva volte più veloce nel test di funzionamento 15 m. Volte migliorato il 15 m di prova sono indicativi di un miglioramento della funzione muscolare 40. Più alti punteggi complessivi di classificazione indicano cattive condizioni di salute e una maggiore atrofia muscolare. Anche se questi risultati sono promettenti, multi-exon skipping presenta ancora molte sfide che dovranno essere superati prima che la tecnica ha applicabilità clinica. tessuto cardiaco mostra ancora ridotto assorbimento di AONs, probabilmente a causa della differenza di traffico cellulare tra tessuto cardiaco e scheletrico. Nessun effetto tossico è stato osservato negli animali sotto i regimi di dosaggio in corso; tuttavia, più lavoro deve essere fatto per valutare la tossicità a lungo termine prima che l&#39;uso di cocktail AON può muoversi alla sperimentazione clinica. E &#39;difficile ottenere l&#39;approvazione per AON farmaci cocktail perché le agenzie di regolamentazione definiscono ogni sequenza AON come farmaco unico. Ciò significa che ogni sequenza in un cocktail dovrebbe essere testato singolarmente per safety, che richiede più tempo e più soldi. Un&#39;altra barriera all&#39;utilizzo di multi-esone skipping in un ambiente clinico è una grande quantità di prodotti proteici intermedi prodotti con funzioni incognite. Queste proteine ​​possono potenzialmente portare ad imprevedibili effetti collaterali, a seconda dell&#39;individuo mutazione 22. Inoltre, i modelli di mutazione disponibili negli attuali modelli di cani distrofici sono limitati. Ci sono alcuni mutazioni in natura, e non tutte le mutazioni sono utili per studiare multi-esone skipping. Il modello suino distrofico promette di essere una buona alternativa per il futuro DMD exon skipping studi 33, 34. I modelli cane DMD hanno alcuni vantaggi rispetto ad altri modelli DMD. Essendo un grande modello animale, classificazione clinica e la RM sono possibili, consentendo un&#39;analisi più dettagliata. Poiché i cani sono grandi animali sono anche più adatti per studi tossicologici e più strettamente rappresentano la malattia umana rispetto al modello di topo. Cane modelli hanno anche sequenze geniche DMD che sono più simili agli esseri umani 23, 34, 45. Anche se tecnicamente impegnativo, l&#39;approccio multi-skipping esone potrebbe infine beneficiare&gt; 90% dei pazienti DMD 24. Questo lo rende una migliore alternativa al single-exon skipping, come single-exon skipping è applicabile solo a un piccolo sottogruppo di pazienti. Inoltre, multi-exon skipping ci permetterà di selezionare i modelli di eliminazione che ottimizzano la funzionalità delle proteine ​​distrofina accorciati. Ad esempio, la cancellazione di DMD esoni 45 - 55 è associata a sintomi lievi o eccezionalmente soggetti asintomatici 14,19,60-63. Il salto multi-esone di esoni 45 - 55 è già stata dimostrata in un modello murino di DMD con una esone 52 delezione (mdx52) utilizzando iniezioni sistemici di vPMOs 22,26. L&#39;uso di vPMOs cocktail è stata dimostrata anche in altre forme di distrofia muscolare, qualicome Fukuyama distrofia muscolare congenita (FCMD). FCMD è causata da esone trapping, in cui aberranti splicing mRNA è causata da inserimento retrotrasposone. vPMOs hanno dimostrato di salvare il modello di splicing sia in un modello di FCMD mouse e in linee cellulari umane 64. Di prossima generazione chimiche AON espositrici maggiore efficacia e minore tossicità faciliterebbero la traduzione efficace dell&#39;approccio multi-skipping esone in applicazioni cliniche. Inoltre, multi-esone skipping potrebbe potenzialmente essere applicata ad altre malattie genetiche, come la dysferlinopathies 24, 65.

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia muscolare recessiva X-linked caratterizzata da debolezza muscolare progressiva, in primo luogo descritto dal Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD è una malattia genetica comune che colpisce circa 1 bambino su 3500 in tutto il mondo, con circa 20.000 bambini affetti nati ogni anno 2,3. Lo sviluppo del motore è in ritardo e disturbi dell&#39;andatura sono visti nella prima infanzia 4, seguita da dipendenza sedia a rotelle sui primi anni dell&#39;adolescenza. La morte si verifica in genere tra i 20 e 30 a causa di insufficienza respiratoria o cardiaca 5-8 tra. Non vi è attualmente alcuna cura per la DMD. Il trattamento con glucocorticoidi può rallentare la progressione della degenerazione muscolare in una certa misura, ma è associato a significativi effetti collaterali, tra cui obesità e diabete mellito 2,7,8. DMD deriva da mutazioni nel gene della distrofina (DMD), portando ad una perdita di Protei distrofina funzionalen. DMD è estremamente un grande gene con oltre 2 milioni di coppie di basi e 79 esoni 9,10. La cancellazione, senza senso, e duplicazione mutazioni che portano alla out-of-frame mutazioni sono la causa più comune del fenotipo DMD. Le regioni di esoni 3 - 9 e esoni 45 - 55 sono denominate &quot;mutazione hotspots&quot;, come la maggior parte dei pazienti hanno mutazioni per delezione all&#39;interno di queste porzioni del gene, portando a distrofina non funzionale in pazienti DMD 3,9,11-16. funzioni distrofina all&#39;interno del complesso distrofina-glicoproteina (DGC), che ha un ruolo importante nella stabilizzazione della membrana muscolare. La N- e C-terminali sono i domini più importanti per la funzione, mentre il dominio asta centrale svolge un ruolo meno importante 3,9,17. L&#39;osservanza di un fenotipo lieve associato con distrofia muscolare di Becker (BMD), che si traduce per lo più da mutazioni in-frame all&#39;interno del gene DMD, ha ispirato l&#39;applicazione di esone skipping per il trattamento di DMD. pazienti BMD hanno un ridotto, ma functional, la proteina distrofina che mantiene sia termini 3,6,18. Exon skipping, in teoria, in grado di ripristinare il quadro di lettura, con conseguente proteine ​​distrofina funzionali accorciato, ma-simili a quelli visti in BMD 3,19. Diversi tipi di oligonucleotidi antisenso (AONs) sono stati testati in studi clinici, tra cui fosforotioati 2&#39;O-metilata (2&#39;OMePS) e oligomeri phosphorodiamidate morpholino (PMO). Saltare esoni 51 e 53 che utilizzano questi AONs è stato esaminato e mentre i risultati sono promettenti, single-exon skipping ha limitato l&#39;applicabilità, in quanto è di 3, 19, 20,21, 22-26 specifiche mutazione. Le domande rimangono anche sulla stabilità delle proteine ​​distrofina accorciati derivanti prodotte da single-esone skipping 22,23. Inoltre, alcuni pazienti richiedono più di un singolo esone da saltare per ripristinare il quadro di lettura 3. Anche se tecnicamente più difficile, multi-exon skipping è un metodo chepotrebbe affrontare questi problemi 3,19. Multi-exon skipping è stato precedentemente dimostrato nel cane distrofici e linee di cellule umane in vitro. Inoltre, mdx52 X-linked modelli cane topo e canino distrofia muscolare (CXMD) sono stati utilizzati per studi in vivo 22, 24-27. Canine distrofia muscolare legata al cromosoma X Japan (CXMD J) beagle sono stati utilizzati qui, come il quadro di lettura di CXMD J può essere ripristinato da Multi-exon skipping degli esoni 6 e 8, o esoni aggiuntivi (ad esempio, esoni 3-9) (Figura 1). Beagle-based CXMD condivide lo stesso schema mutazione come il modello Golden Retriever distrofia muscolare (GRMD), ma beagles sono più piccoli e meno costosi da mantenere a causa della loro dimensione del corpo, fornendo così un utile modello per DMD 28,29. Cani CXMD più da vicino imitare il fenotipo DMD umana rispetto ai modelli animali più piccoli, come roditori, e sono più affidabili per le valutazioni tossicologiche 3,22,30,31 </sup&gt; (Figura 2). cani CXMD mostrano progressivo decadimento muscolare, disturbi della deambulazione, e problemi cardiaci e respiratori simili a quelli osservati in DMD. Rispetto al singolo-exon skipping, multi-exon skipping è applicabile a una percentuale molto maggiore di pazienti. Tra i tre tipi di mutazioni più comuni (delezioni, senza senso, e duplicazioni), 80-98% dei pazienti potrebbe essere trattata con multi-esone skipping 14,32,33, mentre il 45% di tutti i pazienti DMD potrebbe trarre vantaggio da esoni specificamente saltare 45 - 55 3,19,22,34. Con lo sviluppo della morpholinos modificati, l&#39;efficienza di cocktail AON a facilitare skipping esone è migliorata. Arginina-ricchi PMOs peptide coniugato cellule penetrante (PPMOs), e vivo-Morpholinos (vPMOs) sono chimiche AON che hanno notevolmente migliorato la capacità e la stabilità 3,35-38 cellula-penetrante. Le preoccupazioni rimangono circa la tossicità AON a lungo termine; Tuttavia, i progressi significativiè stato fatto. Modificazioni chimiche apportate al Morpholinos ridurre notevolmente gli effetti off-target e studi pre-clinici hanno riportato effetti tossici significativi 3,22,39,40. Una sfida rimanente per multi-esone skipping è il requisito corrente per ogni singolo AON da testare per la tossicità da solo, come un singolo farmaco, anziché insieme come un cocktail 3,19,22,41,42. In studi DMD che coinvolgono sia singolo e multi-esone skipping mirato al cuore, c&#39;è stato un piccolo miglioramento nel tessuto cardiaco distrofici. L&#39;efficacia di Morpholinos nel cuore è pensato per essere bassa a causa della scarsa capacità delle cellule-penetrante. PPMOs peptide coniugato hanno migliorato la capacità di AONs di penetrare cellule cardiache, aumentando la quantità di proteina distrofina funzionale salvato nel cuore 3,19,38. Qui, il nostro approccio cocktail AON è discusso a lungo, compresa la progettazione di sequenze AON utilizzando il software ESEfinder 43. ProtoCOLS per esperimenti di cani con multi-exon skipping sono anche descritti. CXMD J beagles sono stati utilizzati per esoni 6 e 8 esperimenti saltare. Multi-esone skipping nel modello cane CXMD mostra risultati promettenti, ma le sfide restano che devono essere superate prima che siano clinicamente applicabile.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Trasfezione dei mioblasti del cane&nbsp; </td></tr><tr><td>3 ml piastre a 6 pozzetti</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopectina&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Volume totale di 100 ml in terreni opti-MEM con un rapporto di 2:1 per lipofectin. 10 ml di lipopectina per 5 mg di RNA.</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) e Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero di cavallo&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr> <tr><td>di streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956; g/ml</td></tr> di <tr><td>albumina sierica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Trasfezione morfolino dei mioblasti del cane 
Tutto il materiale proviene dalla trasfezione MePS dei mioblasti del cane per la coltura di</td></tr><tr><td>morfolini antisenso.</td><td>Strumenti genetici</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Diluire fino a un volume finale di 100 L in terreni opti-MEM. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg di morfolini a 32 mg/ml in soluzione salina</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/plate</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Estrazione e Reazione a Catena della Polimerasi a Trascrizione Inversa (RT-PCR)</td></tr><tr><td>guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/piastra</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubi da 1,5 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Etanolo&nbsp;</td><td>Spettrometro UV Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer diretto nell'esone 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>Innesco inverso nell'esone 10&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Kit RT-PCR a un passaggio&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sequenziamento del DNA complementare (cDNA)&nbsp; Kit di estrazione </td></tr><tr><td>Gel&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di sequenziamento del ciclo Terminator v3.1</td><td>Biosistemi applicati&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Iniezioni intramuscolari o biopsia muscolare aperta</td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td>Forbici, bisturi, ago, filo chirurgico&nbsp;</td></tr><tr><td>Unguento veterinario&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodofori&nbsp;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>clorexidina</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>Teli chirurgici&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scrubs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschera Facciale&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copertura della testa&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiopentale di sodio&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma</td><td></td><td>20 mg/kg</td></tr><tr><td>Laboratori Abbott di isoflurano</td><td>&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Morfolini antisenso&nbsp;</td><td>Strumenti genetici</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Diluire fino a un volume finale di 100 L in terreni opti-MEM. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg di morfolini a 32 mg/ml in soluzione fisiologica</td></tr><tr><td>27&nbsp; Aghi</td><td>G TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina cloridrato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abbassalingua&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cefalexina</td><td></td><td>da 15 a 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cefazolina</td><td></td><td>da 15 a 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina&nbsp;</td><td></td><td>0,01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>di buprenorfina cloridrato&nbsp;</td><td>0.02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Iniezioni sistemiche</td></tr><tr><td>Pompa per infusione a siringa&nbsp;</td><td>Muromachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp; G Aghi a permanenza</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp; G Aghi&nbsp;</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Classificazione clinica dei cani</td></tr><tr><td>Videocamera&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronometro&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Risonanza magnetica (MRI)&nbsp; </td></tr><tr><td>3 Tesla MRI l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bobina</td><td></td><td></td><td></td> dell'estremità umana di 18 cm di diametro/18 cm di lunghezza</tr><td colspan="4">Campionamento e preparazione muscolare (necroscopia)Tiopentale di sodio&nbsp;<tr></td></tr><tr><td></td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma</td><td></td><td>20 mg/kg</td></tr><tr><td>Laboratori Abbott di isoflurano</td><td>&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Gomma</td><td></td><td></td> adragante <td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Azoto Liquido&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dischi di sughero</td><td>Iwai-kagaku&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>per ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td>secco</tr><tr><td>Poly-L-lisina&ndash; vetrini rivestiti</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Microsystem&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>cm1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Immunoistochimica&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Diluizioni 1:150&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>Diluizioni 1:150</td></tr><tr><td>Alexa 594 capra antitopo IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2.500 diluizioni</td></tr><tr><td>Alexa 594 capra antitopo IgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2.500 diluizioni</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Contiene agente di montaggio</td></tr><tr><td>Siero di capra&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di umidità&nbsp;</td><td>Laboratorio di Ideazione Scientifica&nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino da camera&nbsp;</td><td>Lab-tek&nbsp;</td><td></td><td></td>154453</tr><tr><td>Occhiali di copertura&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza&nbsp;</td><td></td><td></td><td>594 nm con ingrandimento 20X.</td></tr><tr><td colspan="4">Western Blotting&nbsp; </forte></td></tr><tr><td>Acqua distillata&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore manuale&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&volte; Laemmli SDS-loading buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,1 M Tris&ndash; HCl (pH 6,6), 2% (p/v) SDS, 2% (0,28&nbsp; M) beta-mercaptoetanolo, 20% glicerolo, 0,01% blu bromofenolo</td></tr><tr><td>Gel SDS&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-1210</td> Gel SDS <td>risolutivi al 5%</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>3-8%</td></tr> <tr><td>membrana PVDF&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone di funzionamento (10&times;)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM di Tris-Base, 1.920 mM di tampone di scorrimento Glycine</td></tr><tr><td>(1&times;)</td><td></td><td></td><td>10% tampone 10&volte, 20% metanolo</td></tr><tr><td>0,05% PBS/Tween 20 (PBST)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2.000 ml &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3&volte; 200 ml per il lavaggio</td></tr><tr><td>PBST/5% latte in polvere&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine</td> da 100 ml <td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Beta Mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di caricamento/campione per Western blotting</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore del cocktail di proteasi&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> catodico <td>0,025 M base Tris + 40&nbsp; mM Acido 6-amminocaproico + 20%</td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> anodico metanolo <td>0,03 M Tris base + 20%</td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> anodico concentrato metanolo <td>0,3 M Tris base + 20%</td></tr><tr><td>anticorpo metanolo desmina&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Diluizioni 1:150&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td> ImageJ</tr></tbody></table>

multi-esone skipping utilizzando oligonucleotidi antisenso cocktail nella distrofia muscolare canine x-linked

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle malattie genetiche letali più comuni in tutto il mondo, causata da mutazioni nel gene della distrofina (DMD). Exon skipping impiega breve DNA / RNA-come le molecole chiamate oligonucleotidi antisenso (AONs) che ripristinano il quadro di lettura e di produrre le proteine ​​più brevi ma funzionali. Tuttavia, esone skipping terapia deve affrontare due ostacoli principali: limitata applicabilità (fino a solo il 13% dei pazienti possono essere trattati con un singolo farmaco AON), e la funzione delle proteine ​​incerta troncati. Questi problemi sono stati affrontati con un approccio cocktail AON. Mentre circa il 70% dei pazienti DMD possono essere trattati con sola skipping esone (tutti gli esoni combinati), si potrebbe potenzialmente trattare più del 90% dei pazienti DMD se esone skipping multipli usando cocktail farmaci antisenso può essere realizzato. Il cane X-linked distrofia muscolare (CXMD) modello di cane, il cui fenotipo è più simile a pazienti DMD umani, è stato utilizzato per testare la effic sistemicaACY e la sicurezza di multi-exon skipping degli esoni 6 e 8. modello cane Il CXMD ospita un sito di splice mutazione in introni 6, che porta ad una mancanza di esone 7 in distrofina mRNA. Per ripristinare la fase di lettura CXMD richiede multi-exon skipping degli esoni 6 e 8; Pertanto, CXMD è un buon modello animale di medie dimensioni per testare l&#39;efficacia e la sicurezza di multi-exon skipping. In questo studio, un cocktail di Morpholinos antisenso di targeting esone 6 e esone 8 è stato progettato e restaurare l&#39;espressione della distrofina nei muscoli scheletrici wide-body. Metodi di trasfezione / iniezione di oligonucleotidi cocktail e valutazione dell&#39;efficacia e della sicurezza di multi-exon skipping nel modello cane CXMD sono presentati.

Esperimenti in vitro Mioblasti sono state trasfettate con diverse condizioni di trattamento 2&#39;OMePS al fine di confrontare l&#39;efficacia di ogni AON. Trattamenti singoli AON con 600 Nm ciascuno dei Ex6A, Ex6B, Ex8A, o Ex8B sono state fatte, così come un trattamento cocktail con 600 Nm ciascuno di tutte e 4 le sequenze di AON. campioni di RNA sono stati raccolti quattro giorni dopo la trasfezione. Dopo RT-PCR, campioni per ogni trattamento sono stati analizzati su un gel insieme campioni (NT) non trattati. Bande superiori sul gel rappresentano out-of-frame DMD prodotti; queste bande sono stati osservati in NT, Ex8A, e Ex8B mioblasti trattati. Ex6A, Ex6B, Ex8A, ei mioblasti cocktail-trattati hanno mostrato i prodotti in-frame. Il cocktail e Ex6A / B hanno mostrato 100% prodotti in-frame, mentre Ex8A ha mostrato solo il 30% dei prodotti in-frame (Figura 7). Per confermare exon skipping e restauro dila cornice di lettura, è stata eseguita cDNA sequenziazione; i risultati indicano che esoni 6 - 9 erano effettivamente stati saltati (Figura 7). L&#39;immunoistochimica ha dimostrato che i cani AON-trattati erano aumentate fibre distrofina-positive rispetto ai campioni NT (Figura 8). In esperimenti in vivo Per confrontare l&#39;efficienza di diverse condizioni di trattamento AON, cani CXMD (0,5 - 5 anni) sono stati iniettati una volta con 1,2 mg Ex6A o un cocktail di Ex6A, Ex6B, e Ex8A a vari dosaggi. Due settimane dopo l&#39;iniezione, campioni di muscolo sono stati raccolti e colorati con DYS-1 per confrontare il numero di fibre distrofina-positive. Tutti i campioni cocktail-trattati hanno mostrato un aumento dell&#39;espressione della distrofina rispetto ai campioni NT. Fibre distrofina-positivi aumentava con AON dosaggio (Figura 9). A seguito di sistemainiezione ic, wild-type (WT), NT, e campioni di muscolo CXMD cocktail trattate sono state colorate con DYS-1 (Figura 10). Cocktail-trattati cani CXMD hanno mostrato un aumento dell&#39;espressione della distrofina rispetto ai cani NT CXMD, sia in CT e campioni di muscolo cardiaco. Tuttavia, AON trattati muscolo scheletrico (CT) ha mostrato molto più elevata espressione di distrofina rispetto al muscolo cardiaco trattato. Un immunoblot confrontando WT, NT, e vari morpholino muscoli cocktail-trattati ha portato alla stessa conclusione. C&#39;era anche una vasta gamma di distrofina espressione nei campioni di muscolo scheletrico trattate (Figura 10). Ematossilina e eosina (HE) colorazione rivelato che trattata CXMD cani hanno mostrato una migliore istopatologia, con una significativa diminuzione delle fibre in posizione centrale-nucleate (CNF) rispetto ai cani NT CXMD (Figura 11). Questo indica non vi è più la degenerazione / rigenerazione che si verificano nel cane NT, un segno di patologia muscolo distrofico. Inoltre, cani trattati hanno avuto più velocetempi di esecuzione ei punteggi migliorati sulla scala di valutazione clinica. Cani CXMD trattati hanno mostrato punteggi migliori di cani NT CXMD in tutte le categorie (Figura 12). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figura 1. La mutazione del modello del cane CXMD e esoni 6 -. 8 Strategie Skipping Utilizzando un cocktail antisenso cani CXMD hanno una mutazione puntiforme nell&#39;esone 6 che conduce ad una perdita dell&#39;esone 7 nel cane distrofici mRNA. Ciò comporta l&#39;mRNA essere fuori-di-frame e la produzione della proteina distrofina è perduto. Brevi sequenze AON sono progettate per legarsi a esone 6 e 8, che si traduce in mRNA splicing saltare efficacemente esoni 6 - 8. La barra grigia nelle AON cani cocktail-trattata rappresenta brevi sequenze AON. Exon 9 codifica un dominio cerniera ed è a volte spontaneamente impiombato con AONs contro esone 6 e 8. I codici di mRNA che derivano per distrofina proteine ​​che sono più brevi, ma la funzioneal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Sono mostrati Figura 2. I principali sintomi clinici di una 1-year-old animali Canine collegata a X distrofia muscolare (CXMD). A 1-year-old wild-type beagle e un cane CXMD. Il coinvolgimento di prossimale, arti e muscoli temporali sono tipicamente osservato da 2 mesi di età. Contrattura comune e uno spostamento del bacino sono palesi dai 4 mesi di età. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;anestesia generale per un cane. A) Intramusculiniezioni ar e biopsie muscolari vengono eseguiti in anestesia generale con isoflurano. B) Tenendo dell&#39;animale per preparazioni iniettabili sistemici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figura 4. risonanza magnetica (MRI) di Wild-tipo, non trattati CXMD, e trattati CXMD. Risonanza magnetica degli arti posteriori a 3 mesi e 5 mesi in WT e NT CXMD cani. sono mostrati due immagini campione di trattati CXMD posteriori degli arti risonanza magnetica pre (1 settimana prima della prima iniezione) e post-iniezione di AON. 2703MA è stato trattato settimanale 7x con 200 mg / kg Morpholinos cocktail. 2001MA è stato trattato con 5x IV iniezione settimanale di 120 mg / kg Morpholinos cocktail. Controllo e cani trattati sono stati pari età. cani trattati mostrano diminuite segnali T2. Le immagini sono adap<html> Ted con il permesso di Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figura 5. muscolare procedura di biopsia per un cane. A) un arto inferiore è fissato per la biopsia muscolare. B) Con l&#39;aiuto di pinze, dell&#39;arto inferiore si svolge. C) Il muscolo CT è esposto. tecnica aperta biopsia viene utilizzato per ottenere campioni di muscolo di siti iniettati. Le discussioni sono utilizzati per contenere campioni di biopsia. Campioni D) muscolosi in gomma adragante dopo la dissezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. semisecco metodo di trasferimento. Una rappresentazione del metodo di trasferimento semi-secco per Western blotting è presentato. Tre giornali imbevuti di buffer di anodo concentrato sono fissate al terminale negativo; 3 carte imbevuti di buffer di anodo sono accatastati in cima a questa. La carta Mb PVDF è intriso di metanolo e poi tampone anodo prima di essere posto sulla parte superiore delle 6 carte. Il gel, che è stato immerso in tampone catodo, viene posato dolcemente sul foglio PVDF. Infine, 3 carte imbevute di tampone di catodo sono disposti sulla parte superiore del gel. Il terminale positivo è impostato sulla parte superiore. Per 1 ora, 400 mA è gestito attraverso il sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figura 7. Exon skipping in CXMD mioblasti. </strong&gt; mioblasti CXMD sono state trasfettate con Ex6A, Ex6B, Ex8A, o da soli Ex8B, o un cocktail di tutti e quattro. Un totale di 600 nM è stato utilizzato per le singole sequenze e per il cocktail è stato usato 600 nM di ogni sequenza. A) 2&#39;OMePS trattamento in CXMD mioblasti cane. Ex6A, Ex6B, ei campioni cocktail trattati mostrano forti bande nella posizione prevista del trascrizioni esone-saltato in-frame. Ex8A mostra una banda intermedia, Ex8B mostra una banda debole e NT non mostra una banda nella posizione in-frame. B) la sequenza cDNA da sola Ex6A, 4 giorni dopo la trasfezione. Le immagini vengono adattate con il permesso di Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figura 8. Aumento Dystrophin espressione in 2&#39;O-metilati fosforotioato (2&#39;OMePS) trasfettate CXMD mioblasti. mioblasti CXMD sono state trasfettate con il solo Ex6A o con 2&#39;OMePS cocktail. DYS-2 (rosso) e DAPI (blu) colorazione sono mostrati. I mioblasti trattati vengono confrontati con wild-type (WT) e mioblasti non trattati (NT). Le immagini vengono adattate con il permesso di Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figura 9. Salvataggio di distrofina espressione con intramuscolare iniezioni di Morpholinos nel solo CXMD cani. Sia Ex6A o un cocktail di Ex6A, Ex6B, e Ex8A sono stati iniettati nei muscoli CT di cani CXMD. Distrofina (DSY-1) colorazione di wild-type(WT), non-trattati (NT), e cani CXMD trattati sono mostrati. I cani sono stati trattati con 1,2 mg da solo Ex6A o 1,2 mg cocktail. Le immagini vengono adattate con il permesso di Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figura 10. aumento dell&#39;espressione della distrofina Dopo sistemica Cocktail Morpholino trattamento in CXMD cani. Distrofina (DYS-1) colorazione è stato utilizzato per confrontare l&#39;espressione della distrofina nel wild-type (WT) (controllo positivo), non trattato (NT) (controllo negativo), e cani CXMD trattati con 120 mg / kg morfolino cocktail (40 mg / kg di ogni AON). Il cocktail morfolino conteneva Ex6A, Ex6B, e Ex8A. I cani sono stati iniettati per via endovenosa 5 volte siamoekly con questo cocktail. A) Un confronto di espressione distrofina in tibiale craniale (CT) muscoli WT, NT e cani trattati. B) Un confronto di espressione della distrofina nel tessuto cardiaco tra il NT e morpholino cani cocktail-trattata. C) Immunoblot per distrofina con desmina come controllo di caricamento viene mostrato per WT, NT, e morpholino cani cocktail-trattata. I seguenti muscoli sono indicati per cani trattati: tricipite brachiale (TB), bicipite brachiale (BB), il diaframma (DIA), esofago (ESO), CT, adduttore (ADD), estensore lungo delle dita (EDL), massetere (MAS), e il cuore. Le immagini vengono adattate con il permesso di Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> figura11. Miglioramento istopatologia in CXMD cani trattati per 7 settimane con 240 mg / kg Morpholino cocktail. Cani CXMD che vanno da un anno e mezzo a cinque anni sono state iniettate per via endovenosa con 240 mg / kg morfolino cocktail (Ex6A, Ex6B, e Ex8A) una volta al settimana per 7 settimane. Quattordici giorni dopo l&#39;ultima iniezione, muscoli esofago sono state prese e ematossilina e eosina (HE) colorazione è stato fatto. HE colorazione dei muscoli dell&#39;esofago da non trattato (NT) e morfolino cocktail-trattati (trattato) cani CXMD (40X lente obiettivo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figura 12. I punteggi migliorate sulla classificazione clinica e 15 m Durata Dopo cani Morpholino trattamento. Morpholino-trattati sono stati confrontati con non trattato-littermate (NT)S. Le barre di errore nel grafico indicano SEM. A) Punteggio totale per l&#39;esame di classificazione clinica è stato calcolato prima e dopo il trattamento e animali trattati sono stati confrontati con i fratellini NT. B) Un confronto di 15 m tempi di esecuzione dei cani trattati e NT. C) simili a B; tuttavia, sono stati utilizzati cani più giovani. Le immagini vengono adattate con il permesso di Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligonucleotidi antisenso </td><td> sequenza nucleotidica </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabella 1. antisenso oligonucleotide Design.

Exon skipping è attualmente un&#39;opzione terapeutica più promettente per distrofia muscolare di Duchenne (DMD). Per espandere l&#39;applicabilità per pazienti DMD e per ottimizzare la stabilità / funzione delle proteine ​​distrofina troncate risultanti, un multi-esone skipping approccio utilizzando cocktail oligonucleotidi antisenso stato sviluppato e abbiamo dimostrato salvataggio distrofina sistemica in un modello del cane.

Multi-esone skipping Utilizzando oligonucleotidi antisenso Cocktail nella distrofia muscolare Canine X-linked

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è esaminare l'efficacia e la tossicità del salto multiplo di esoni mediante l'uso di oligonucleotidi antisenso, o AON, in un modello canino della distrofia muscolare di Duchenne, o DMD. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca traslazionale sulla terapia di salto di esoni antisenso, come ad esempio se gli oligonucleotidi antisenso siano in grado di indurre il salto multiplo di esoni e ridurre l'espressione della distrofina in un modello animale di grandi dimensioni. Il principale vantaggio dell'utilizzo del modello canino in uno studio è che i risultati terapeutici ottenuti in animali di maggiori dimensioni possono essere estrapolati ai pazienti affetti da DMD in modo più affidabile.Sebbene il salto degli esoni sia una terapia molto promettente per la DMD, può essere applicata anche ad altre malattie genetiche, come la distrofia muscolare congenita e la distrofia muscolare cinturale. La dimostrazione degli esperimenti in vitro sarà effettuata dal dottor Yoshitsugu Aoki, capo del nostro laboratorio, mentre la dimostrazione degli esperimenti in vivo sarà effettuata dal dottor Mutsuki Kuraoka, ricercatore post-dottorato del mio dipartimento. Dopo aver progettato gli AON seguendo il protocollo descritto nel testo, utilizzare piastre a 6 pozzetti per seminare da uno a cinque volte 10 alla terza mioblasti CXMD per centimetro quadrato in tre millilitri di DMEM contenente 10% di FBS e 1% di pen-strep.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino al raggiungimento di una confluenza del 60-80%. Quando le cellule raggiungono la confluenza desiderata, utilizzare un mezzo con siero ridotto per diluire un reagente di trasfezione a base di liposomi cationici fino a un volume totale di 100 microlitri, e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Successivamente, diluire gli AONs in mezzo con siero ridotto fino a un volume finale di 100 microlitri.Combinare il reagente di trasfezione diluito con gli AON diluiti e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Nel frattempo, rimuovere il mezzo dalle cellule e lavarle tre volte con mezzo fresco. Successivamente, aggiungere 0,8 millilitri di mezzo alla miscela di trasfezione, quindi aggiungere l'intera soluzione alle cellule appena lavate.Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Successivamente, aggiungere il mezzo di differenziamento, o DM, alle cellule e incubare fino a 10 giorni per consentire il differenziamento. A partire dal terzo giorno circa, verificare la presenza di differenziamento.Per eseguire la trasfezione con morpholino di mioblasti canini, coltivare i mioblasti CXMD come mostrato precedentemente in questo video. Riscaldare i morpholino del cocktail a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere quindi un reagente di consegna peptidico e regolare la concentrazione del morpholino a un valore finale compreso tra tre e sei micromolari.Successivamente, utilizzare il DM per sostituire il mezzo nei mioblasti e aggiungere il morpholino in ogni pozzetto a una concentrazione finale di un micromolare. Incubare per 16-18 ore. Quindi, per raccogliere le cellule per l'estrazione dell'RNA, aggiungere un millilitro di tiocianato di guanidinio-fenolo-cloroformio alle cellule per staccarle dalla piastra.Dopo aver incubato le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti, trasferire le cellule in provette da 1,5 millilitri. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio a ciascuna provetta e incubare a temperatura ambiente per due minuti, fino a quando saranno visibili tre strati separati: lo strato dell'RNA, lo strato delle proteine e lo strato del DNA. Centrifugare le provette a 12.000 × g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti.Quindi, rimuovere il livello superiore del soprannatante e trasferirlo in una provetta contenente 500 microlitri di isopropanolo. Centrifugare le provette del soprannatante prima di rimuovere il soprannatante e conservare il pellet di RNA. Lavare il pellet con etanolo e centrifugare a 8.000 × g e 4 gradi Celsius per cinque minuti.Rovesciare il tubo per 15 minuti per far evaporare l'etanolo residuo prima di aggiungere da 15 a 30 microlitri di acqua priva di RNasi. Quindi, utilizzare la spettroscopia UV-Vis a 260 nanometri per quantificare l'RNA. Per eseguire la RT-PCR, mescolare i seguenti reagenti e aggiungere acqua fino a un volume finale di 25 microlitri.Posizionare i campioni in un termociclatore ed eseguire il seguente programma. Al termine della corsa, conservare il prodotto a quattro gradi Celsius o a 20 gradi Celsius. Per eseguire un'iniezione intramuscolare, dopo aver preparato l'animale per l'intervento chirurgico e averlo anestetizzato secondo il protocollo indicato nel testo, utilizzare un bisturi per tagliare la pelle longitudinalmente per circa cinque centimetri sopra la tibia craniale, o CT. Per segnare i siti di iniezione, utilizzare un ago chirurgico e filo chirurgico per suturare la fascia profonda, creando due punti di riferimento a distanza di due centimetri l'uno dall'altro.È molto importante segnare il sito di iniezione con un filo, poiché ciò consente una biopsia più accurata. Successivamente, utilizzando un ago da 27 gauge, iniettare la concentrazione desiderata di AONs nel muscolo e lasciare l'ago in sede per un minuto. Quindi, per eseguire una biopsia muscolare a cielo aperto, utilizzare un bisturi chirurgico per rimuovere un pezzo di tessuto muscolare di circa due centimetri di lunghezza dal muscolo CT.Riposizionare la fascia muscolare sopra il muscolo e utilizzare un filo assorbibile 000 per chiudere il tessuto. Successivamente, utilizzare un filo di nylon 000 per chiudere la cute. Mediante un ago, somministrare un'iniezione intramuscolare di 0,02 milligrammi per chilogrammo di cloridrato di buprenorfina.Per iniettare un cocktail contenente quantità uguali di ciascun AON in una vena dell'arto, mentre si tiene l'animale secondo il protocollo descritto nel testo, inserire un ago venoso permanente in una vena dell'arto. Utilizzando una pompa per infusione o un driver per siringa, iniettare un volume totale di 50 millilitri a una velocità di 2,5 millilitri al minuto per 20 minuti, seguendo le istruzioni del produttore. Ripetere le iniezioni settimanalmente o bisettimanalmente, poiché l'espressione della distrofina aumenterà con iniezioni ripetute.Per eseguire settimanalmente analisi del sangue per esaminare la tossicità, utilizzare un ago per prelevare tre millilitri di sangue da una delle vene sottocutanee dell'arto anteriore o posteriore. Seguendo le istruzioni del produttore, includere le seguenti valutazioni. Eseguire ulteriori analisi secondo il protocollo descritto nel testo.I mioblasti sono stati trasfettati con diverse condizioni di trattamento con 2'OMePS al fine di confrontare l'efficacia di ciascun AON. La gel mostrata qui rappresenta campioni di RT-PCR ottenuti dall'RNA raccolto quattro giorni dopo il trattamento. Le bande posizionate più in alto sul gel rappresentano prodotti DMD fuori traccia di lettura ed erano visibili nei mioblasti non trattati Ex8A e nei mioblasti trattati con Ex8B.I mioblasti trattati con Ex6A, Ex6B, Ex8A e con il cocktail hanno mostrato prodotti in frame. Il sequenziamento del cDNA ha verificato che gli esoni da 6 a 9 erano stati saltati. Come mostrato in questa figura, l'immunocitochimica ha rivelato che le cellule canine trattate con ODN avevano un aumento di fibre positive per distrofina rispetto ai campioni non trattati.Per confrontare l'efficacia di diverse condizioni di trattamento con AON, i cani CXMD sono stati iniettati con Ex6A, oppure con un cocktail di Ex6A, Ex6B ed Ex8A a varie dosi. I campioni muscolari colorati per DYS1 mostrano un aumento dell'espressione della distrofina nei campioni trattati con il cocktail, e le fibre positive alla distrofina sono aumentate con la dose di distrofina. Dopo iniezioni sistemiche, i cani CXMD trattati con il cocktail hanno mostrato un'espressione maggiore di distrofina rispetto ai cani CXMD non trattati, sia nei campioni di muscolo scheletrico che cardiaco.Tuttavia, i muscoli scheletrici trattati con oligonucleotidi antisenso hanno mostrato un'espressione della distrofina molto più elevata rispetto al muscolo cardiaco trattato. Inoltre, i cani CXMD trattati hanno mostrato un miglioramento dell'istopatologia, con una significativa riduzione delle fibre con nuclei centrali rispetto ai cani CXMD non trattati. Una volta acquisite le competenze necessarie, entrambi gli esperimenti in vitro e in vivo possono essere eseguiti in un paio d'ore, se effettuati correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante monitorare attentamente le condizioni di salute del cane. Dopo il suo sviluppo, il salto esonico sistemico ha aperto la strada ai ricercatori di questo settore per avviare prove cliniche sull'uomo in pazienti con DMD. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trattare i cani con oligonucleotidi antisenso.

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Un protocollo strutturato è presentato per un saggio basato su cellule come un test funzionale per predire la prognosi di scoliosi idiopatica utilizzando la spettroscopia dielettrica cellulare (CDS). L'analisi può essere eseguita con cellule fresche o congelate mononucleate del sangue periferico (PBMC) e la procedura è completata entro 4 giorni.

Basata-Cell Assay Protocollo per la previsione prognostica della scoliosi idiopatica Uso Cellular dielettrica Spettroscopia

Questo protocollo prevede procedure dettagliate per l'isolamento di cellule derivate dalle urine da pazienti con distrofia muscolare; la loro riprogrammazione efficiente e rapida attraverso la trasduzione del virus Sendai.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

Scopri il salto multi-esone con oligonucleotidi antisenso cocktail nel modello canino di distrofia muscolare di Duchenne. Questo metodo permette il recupero sistemico della distrofina senza tossicità significativa.

Multi-esone skipping Utilizzando oligonucleotidi antisenso Cocktail nella distrofia muscolare Canine X-linked

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