Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di Burnetii Coxiella

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di sviluppare un semplice metodo LAMP utilizzando reagenti liofilizzati per la rilevazione di C.burnetii in campioni di pazienti. Il vantaggio principale di questo protocollo è che non è richiesto alcun coaching per la conservazione dei reagenti. Questo metodo è ideale per l'uso in ambienti con risorse limitate in cui la febbre Q è endemica.

A dimostrare la procedura sarà Tatiana, un tecnico del nostro laboratorio. Partendo dal DNA per il gene bersaglio IS1111a di C.burnetii RSA493, determinare la concentrazione di plasmidi con uno spettrofotometro a 260 nanometri. Converti la concentrazione di DNA plasmidico in numero di copie utilizzando i seguenti calcoli, dove 6330 è uguale alla lunghezza e alle coppie di basi del plasmide e 34,2 nanogrammi per microlitro è la concentrazione del plasmide, come appena determinato utilizzando lo spettrofotometro.

Quindi preparare diluizioni seriali da 8 a 10 volte del plasmide per arrivare al seguente numero di copie per microlitro. Per preparare il modello di DNA per la reazione LAMP, iniziare con 200 microlitri di campioni di plasma umano e, con il kit di minipreparazione del DNA, estrarre il DNA secondo il protocollo del produttore. Diluire il campione finale in un volume di 20 microlitri.

Preparare 1 millilitro di 2x tampone di reazione LAMP combinando i seguenti reagenti. Mescolare a impulsi per 10 secondi. Per eseguire la reazione LAMP standard, in una provetta PCR da 0,2 millilitri, mescolare 12,5 microlitri di 2 tamponi LAMP, 1,2 microlitri di miscela di primer, 1 microlitro di DNA polimerasi Bst e 5,3 microlitri di acqua.

Successivamente, aggiungi 5 microlitri di DNA alla reazione da 20 microlitri e mescola bene, quindi incuba a 60 gradi Celsius in un bagnomaria o in un blocco riscaldante per 60 minuti. Dopo l'incubazione, terminare la reazione aggiungendo 5 microlitri di tampone di caricamento del gel 10x alla provetta. Quindi caricare 5 microlitri di prodotti di reazione su un gel di agarosio al 2% colorato con colorante di acido nucleico intercalante.

Far funzionare il gel in 1x TBE a 100 volt per 35 minuti, quindi utilizzare la luce UV per visualizzare i risultati. Per eseguire la reazione LAMP con reagenti ricostituiti, preparare 1 millilitro di tampone di ricostituzione combinando i seguenti reagenti. Mescolare a impulsi per 10 secondi.

Quindi, rimuovere le provette che contenevano i reagenti liofilizzati dal sacchetto di alluminio sigillato. Per il passaggio 4.2, è molto importante assicurarsi che il sacchetto di alluminio sia sigillato correttamente prima di aprirlo. Non utilizzare i tubi se il sacchetto di alluminio non è sigillato o è danneggiato.

Aggiungere 20 microlitri di tampone di ricostituzione a ciascuna provetta di reagenti e mescolare pipettando su e giù cinque volte. Assicurarsi che i reagenti liofilizzati siano completamente risospesi. Quindi, aggiungere 5 microlitri di modello di DNA ai reagenti ricostituiti e mescolare bene.

Incubare a 60 gradi Celsius in un bagnomaria o in un blocco riscaldante per 60 minuti. Per terminare la reazione dopo l'incubazione, aggiungere 5 microlitri di tampone di caricamento del gel 10x, quindi aggiungere 5 microlitri di prodotti di reazione su un gel di agarosio al 2% colorato con colorante di acido nucleico intercalante. Far scorrere il gel in 1 tampone TBE a 100 volt per 35 minuti, quindi visualizzare i risultati con la luce UV.

Per eseguire la reazione LAMP con blu idrossinaptolo, o HNB, o colorante intercalante, preparare 1 millilitro di tampone di ricostituzione combinando i seguenti reagenti che includono HNB o un colorante intercalante fluorescente. Mescolare a impulsi per 10 secondi. Eseguire la reazione LAMP come appena descritto e utilizzare la luce UV o ad occhio nudo per visualizzare i risultati.

Per eseguire la reazione LAMP con uno scanner a provetta, aggiungere 5 microlitri di DNA ai reagenti ricostituiti contenenti il colorante intercalante fluorescente, quindi inserire la provetta chiusa nello scanner a provetta. Impostare la temperatura di incubazione a 60 gradi Celsius e misurare la fluorescenza a 520 nanometri per 60 minuti. Questa figura mostra i risultati della reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati.

Osservare che il reagente liofilizzato mantiene la sua attività. Le reazioni LAMP preparate da entrambi i reagenti hanno rilevato 25 copie del modello di DNA. In questa figura viene mostrata la rilevazione dei prodotti della reazione con HNB o colorante intercalante fluorescente nella reazione.

L'aggiunta di HNB alla reazione produce un cambiamento visivo di colore, dal viola al blu, con 25, 50 e 100 copie di modello di DNA presenti nelle reazioni. Inoltre, l'inclusione di colorante intercalante fluorescente nella reazione mostra un forte segnale fluorescente con la luce UV quando sono presenti numeri di copie di DNA simili. Di seguito sono mostrati i risultati dell'utilizzo dello scanner a tubo per monitorare i segnali fluorescenti in tempo reale con colorante fluorescente intercalante.

I segnali fluorescenti sono al di sopra del basale dopo 14, 18, 21 e 23 minuti, con 10^6, 10^4, 10^3 e 100 copie di DNA modello nelle reazioni. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 90 minuti. Dopo il suo sviluppo, questo test ha aperto la strada a una diagnosi rapida dell'infezione da Coxiella burnetii in aree con risorse limitate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ricostituire i reagenti LAMP liofilizzati. Non dimenticare che i campioni dei pazienti possono essere infettivi e che è necessario prendere sempre precauzioni di sicurezza durante l'esecuzione di questa procedura.