Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di

L'obiettivo generale di questo esperimento è sviluppare un semplice metodo LAMP utilizzando reagenti liofilizzati per la rilevazione di C.burnetii in campioni di pazienti. Il vantaggio principale di questo protocollo è che non è richiesta alcuna refrigerazione per la conservazione dei reagenti. Questo metodo è ideale per l'uso in contesti con risorse limitate in cui la febbre Q è endemica.

La procedura sarà dimostrata da Tatiana, un'assistente del nostro laboratorio. A partire dal DNA del gene bersaglio IS1111a da C.burnetii RSA493, determinare la concentrazione del plasmide mediante spettrofotometro a 260 nanometri. Convertire la concentrazione del DNA plasmidico in numero di copie utilizzando i seguenti calcoli, in cui 6330 corrisponde alla lunghezza in paia di basi del plasmide e 34,2 nanogrammi per microlitro è la concentrazione del plasmide, appena determinata mediante spettrofotometro.

Quindi preparare diluizioni seriali del plasmide da 8 a 10 volte per ottenere il seguente numero di copie per microlitro. Per preparare il template di DNA per la reazione LAMP, partire da 200 microlitri di campioni di plasma umano ed estrarre il DNA utilizzando il kit di miniprep del DNA seguendo il protocollo del produttore. Diluire il campione finale in un volume di 20 microlitri.

Preparare 1 millilitro di tampone di reazione LAMP 2x combinando i seguenti reagenti. Mescolare mediante vortex per 10 secondi. Per eseguire la reazione LAMP standard, in un tubo PCR da 0,2 millilitri, mescolare 12,5 microlitri di tampone LAMP 2x, 1,2 microlitri di mix di primer, 1 microlitro di DNA polimerasi Bst e 5,3 microlitri di acqua.

Successivamente, aggiungere 5 microlitri di DNA alla reazione da 20 microlitri e mescolare accuratamente, quindi incubare a 60 gradi Celsius in un bagno termico o blocco riscaldante per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 5 microlitri di buffer di carico per gel 10x al tubo. Quindi, caricare 5 microlitri dei prodotti di reazione su un gel di agarosio al 2% colorato con un colorante intercalante per acidi nucleici.

Eseguire l'elettroforesi in TBE 1x a 100 volt per 35 minuti, quindi utilizzare la luce UV per visualizzare i risultati. Per eseguire la reazione LAMP con reagenti ricostituiti, preparare 1 millilitro di tampone di ricostituzione mescolando i seguenti reagenti. Mescolare mediante vortex a impulsi per 10 secondi.

Successivamente, rimuovere le provette contenenti i reagenti liofilizzati dal sacchetto sigillato in foglio di alluminio. Per il Passaggio 4.2, è molto importante assicurarsi che il sacchetto in foglio di alluminio sia correttamente sigillato prima di aprirlo. Non utilizzare le provette se il sacchetto di alluminio non è sigillato o è danneggiato.

Aggiungere 20 microlitri di tampone di ricostituzione a ciascuna provetta di reagenti e mescolare aspirando e dispensando cinque volte con una pipetta. Assicurarsi che i reagenti liofilizzati siano completamente risospesi. Successivamente, aggiungere 5 microlitri di stampo di DNA ai reagenti ricostituiti e mescolare accuratamente.

Incubare a 60 gradi Celsius in un bagno d'acqua o blocco termoregolato per 60 minuti. Per arrestare la reazione al termine dell'incubazione, aggiungere 5 microlitri di buffer di carico per gel 10x, quindi caricare 5 microlitri dei prodotti di reazione su un gel di agarosio al 2% colorato con un colorante intercalante per acidi nucleici. Eseguire l'elettroforesi in buffer TBE 1x a 100 volt per 35 minuti, quindi visualizzare i risultati mediante luce UV.

Per eseguire la reazione LAMP con blu idrossinaftolo, o HNB, o un colorante intercalante, preparare 1 millilitro di tampone di ricostituzione unendo i seguenti reagenti che includono HNB o un colorante intercalante fluorescente. Mescolare mediante vortex a impulsi per 10 secondi. Eseguire la reazione LAMP come appena descritto e utilizzare la luce UV o l'occhio nudo per visualizzare i risultati.

Per eseguire la reazione LAMP con uno scanner per provette, aggiungere 5 microlitri di DNA ai reagenti ricostituiti contenenti il colorante fluorescente intercalante, quindi inserire la provetta chiusa nello scanner. Impostare la temperatura di incubazione a 60 gradi Celsius e misurare la fluorescenza a 520 nanometri per 60 minuti. Questa figura mostra i risultati della reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati.

Osservare che il reagente liofilizzato mantiene la sua attività. Le reazioni LAMP preparate con entrambi i reagenti hanno rilevato 25 copie del template di DNA. In questa figura è mostrato il rilevamento dei prodotti della reazione con HNB o con colorante fluorescente intercalante nella reazione.

L'aggiunta di HNB alla reazione produce un cambiamento visivo del colore, dal viola al blu, con 25, 50 e 100 copie di DNA stampo presenti nelle reazioni. Inoltre, l'inclusione di un colorante intercalante fluorescente nella reazione mostra un segnale fluorescente intenso alla luce UV quando sono presenti numeri simili di copie di DNA. Qui vengono mostrati i risultati ottenuti utilizzando lo scanner per provette per monitorare in tempo reale i segnali fluorescenti con il colorante intercalante fluorescente.

I segnali fluorescenti sono superiori alla linea di base dopo 14, 18, 21 e 23 minuti, con 10^6, 10^4, 10^3 e 100 copie di modello di DNA nelle reazioni. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere completata in 90 minuti. Dopo il suo sviluppo, questo saggio ha aperto la strada a una diagnosi rapida dell'infezione da Coxiella burnetii in aree con risorse limitate.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ricostituire i reagenti LAMP liofilizzati. Non dimenticare che i campioni prelevati dai pazienti possono essere infettivi e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare le opportune precauzioni di sicurezza.