Name: Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate Intestinalis Ciona (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Scopri la microiniezione e l'elettroporazione negli embrioni di Ciona intestinalis per studiare la regolazione genica nello sviluppo dei cordati. Queste tecniche permettono di esplorare le reti regolatorie e i meccanismi evolutivi conservati.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università di Innsbruck, Austria, e dall'Accademia Austriaca delle Scienze (ÖAW).

1. Preparativi per microiniezione e elettroporazione in Ciona Uova e zigoti <ol><li> Preparare 10 L acqua di mare artificiale con HEPES (ASWH) per la coltura di embrioni. Sciogliere 420 mm NaCl, 9 mm KCl, 10 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 24,5 mM MgCl 2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO 4 · 7H 2 O e 2,15 mM NaHCO 3 in acqua bidistillata (DDH 2 O) da agitazione per una notte. Aggiungere 5 mM HEPES pH 8.0, e verificare / regolare il pH a 8,0. Conservare il ASWH a 4 ° C. Riscaldarlo fino a 18 ° C e filtrare con carta da filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare 20x soluzione dechorionation inattivato: 20% thioglycolate di sodio, 1% pronase in ASWH. Conservare 500 microlitri aliquote a -20 ° C, e portare a un volume finale di 10 ml ASWH prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare 15 a 20 piastre di coltura per le uova / embrioni. Versare fuso 1% agarosio in ASWH in 3,5, 5, 9 o 15 cm capsule di Petri, rivestimento con uno strato sottile di 1-2 mm.Lasciate che il agarosio solidificare e coprire le piastre con ASWH. loro stock a 4 ° C per 1-2 settimane al massimo. Sostituire il ASWH prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare piatti iniezione speciali. <ol><li> Versare uno spesso strato di 5-7 mm di fuso 1% agarosio in un cinque centimetri Petri e posizionare uno stampo in agarosio (ad esempio una chiusura a chiusura zip incollato ad una custodia di plastica) per produrre una rientranza sulla solidificazione agarosio che può contenere le uova. Preparare 4 a 5 piatti di iniezione e coprire con ASWH. Conservare a 4 ° C e sostituirlo con ASWH fresco prima dell&#39;uso. Utilizzare solo piatti freschi per iniezione (massimo un giorno di vita). </li></ol></li><li> Preparare β-galattosidasi (LacZ) buffer di colorazione: 1 mm MgCl 2 · 6H 2 O, 3 mm K 4 [Fe (CN) 6] · 3 H 2 O, 3 mm K 3 [Fe (CN) 6] in tampone fosfato salino (PBS) con Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 0,05% Tween). Conservare in al buio a 4 ° C. Preparare substrato LacZ 5-Bromo-4-cloro-3-indolil ß-D-galattopiranoside (X-gal, 10 U / ml) in aliquote di 40 mg / ml in dimetilformammide (DMF) e le scorte conservare a -20 ° C fino uso. </li><li> Mettere a bagno pipette Pasteur in rubinetto acqua durante la notte per evitare che gli embrioni si attacchino. </li><li> Preparare aghi da iniezione. <ol><li> Impostare un estrattore micropipetta a condizioni come il calore 425, tirare 75, velocità 75 e il tempo 200 (da una prova filamento rampa di 415). </li><li> Tirare 4 a 5 capillari di vetro a filamento contenenti produrre da 8 a 10 lunghe e sottili aghi normalmente chiuse in punta. Conservare gli aghi in una scatola degli aghi senza polvere, collegato a doppio nastro adesivo su un supporto elevata, per evitare di rompere le punte e che è conveniente per il riempimento degli aghi. NOTA: Verificare gli aghi ottenuti iniettando un paio di uova con colorante vitale verde (come descritto nel capitolo 6) e regolare l&#39;ago condizioni di trazione per ottenere una forma punta che permette la messa a punto e repetitive iniezione come descritto in 6.6. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di iniezione. Preparare 4 ml di soluzione di iniezione, per esempio, composto da 1 ml di 2 mM MO, 2 ml di 10 mg / mL colorante vitale verde e 1 ml DDH 2 O. Aggiungere una concentrazione finale di 0,05-0,5 mg / mL capped mRNA o 20 ng / ml di DNA plasmidico secondo la domanda sperimentale. Mescolare bene. Tenere in ghiaccio se la soluzione contiene mRNA. </li></ol> 2. Raccolta di Gameti <ol><li> Adulti Dissect Ciona in un 18 ° C raffreddati camera embrione. Utilizzare piccole forbici e iniziare dall&#39;estremità che si oppone sifoni sul lato della espirazione (breve) sifone sotto cui ovidotto e il tratto di canale aria spermatozoi. </li><li> Esporre il ovidotto e delicatamente fare un&#39;incisione nell&#39;ovidotto usando la punta delle forbici. Eliminare le uova uscenti direttamente in un 6-pozzetti contenenti ASWH premendo delicatamente la oviduct con le forbici chiuse spogliarsi l&#39;esempiogs. Trasferire le uova restanti con una pipetta Pasteur pre-risciacquato con ASWH. </li><li> Depositare le uova provenienti da animali diversi in diversi pozzi. Osservare la qualità delle uova nell&#39;ambito di applicazione dissezione. NOTA: le uova ben sviluppati sono tondi e rosa per un po &#39;di colore giallo. Essi sono circondati da uno strato vitellina non cellulare, il corion che forma uno spazio perivitellino ben definito intorno all&#39;uovo. Il corion è associato a celle di test Nelle cellule follicolari all&#39;interno e a stella al suo esterno. Uova di bassa qualità spesso non hanno spazio perivitellino o le cellule del follicolo. Essi appaiono meno rotondo, più granulare o di colore diverso. ovociti immaturi sono più piccoli e hanno un colore bianco argento. </li><li> Tagliare il condotto di sperma con le forbici e raccogliere lo sperma concentrato in una provetta da 1,5 ml con una pipetta Pasteur separata. Piscina La sperma di animali diversi (almeno due) nella stessa provetta. Conservare spermatozoi a 4 ° C per diversi giorni. </li></ol> 3.Fecondazione <ol><li> Raccogliere lo sperma e le uova a 18 ° C come descritto al punto 2. </li><li> Attivare lo sperma. <ol><li> Preparare 1 ml ASWH in una provetta da 1,5 ml e mescolare con 50 ml di 1 M Tris pH 9.5. Quindi aggiungere 20 ml di sperma concentrato e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo. </li><li> Verificare l&#39;attivazione degli spermatozoi in una goccia di sperma posizionato su una cover di una piccola scatola di Petri o un vetrino ed osservare nell&#39;ambito di applicazione dissezione. Gli spermatozoi devono essere nuotare freneticamente. </li></ol></li><li> Aggiungere 100-200 ml della soluzione di spermatozoi attivi per ciascun pozzetto di uova (contenenti da 100 e 1.000 uova), mescolare bene pipettando su e giù, così le uova sono galleggianti nel mezzo. Attendere per 10 minuti senza muovere gli embrioni. </li></ol> 4. dechorionation di ovuli ed embrioni <ol><li> Diluire un&#39;aliquota 500 ml di soluzione di 20x dechorionation a 10 ml nel ASWH. Attivare la soluzione dechorionation aggiungendo goccia a goccia 200 ml di 2.5 M NaOH alla soluzione dechorionation 10 ml 1x. Un precipitato lattiginoso si formerà. Mescolare delicatamente invertendo il tubo. </li><li> Raccogliere le uova o zigoti (dopo il 10 min aspettare in fase 3.3) in tubi di vetro con una pipetta Pasteur. Pool le uova da 2 a 3 animali in una provetta (circa 1.000-5.000 uova / tubo). Sedimenti con una centrifuga mano facendo girare ad alta velocità (1200 xg) per circa 20 secondi per formare un pellet embrione sul fondo della provetta. Lentamente fermare la centrifuga e rimuovere il ASWH con una pipetta Pasteur. </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione dechorionation attivato per i pellet uova / zigoti in ciascun tubo. Sospendere le uova / zigoti da loro pipettando gentilmente su e giù con un tap-acqua trattata pipetta Pasteur sormontato da una piccola pera di gomma. La soluzione dovrebbe diventare giallastra dopo 1-3 min. </li><li> Seguire la dechorionation rimuovendo una piccola aliquota della sospensione dechorionating uovo / zigote con la pipetta Pasteur. Depositare una goccia su un vetrino e osservare sotto la s dissezionefar fronte. Mantenere pipettaggio uova / zigoti su e giù e controllare ogni 20-30 sec. NOTA: le cellule del follicolo primi staccano, quindi il corion diventa giallo e opaco, e, infine, si stacca dagli zigoti. Rosa dechorionated uova / zigoti si depositano sul fondo del tubo di vetro. Il dechorionation non dovrebbe richiedere più di max. 5 minuti. </li><li> Riempire il tubo con ASWH una volta il 50% di uova / zigoti sono dechorionated. NOTA: Molto delicatamente centrifuga (8 x g) per circa 10-15 secondi corrispondente ad una velocità molto bassa tanto che basta per sedimentare le dechorionated uova / embrioni. Lentamente fermare la centrifuga da non perturbare il pellet di uova / zigoti sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere quasi tutto il liquido dal tubo di vetro compreso il materiale galleggiante con uova incompleto dechorionated / zigoti e sostituirlo con ASWH. Lentamente pipettare su e giù per lavare e centrifugare delicatamente di nuovo come al punto 4.2. In alternativa, attendere zigoti a stabilirsi per gravità. Lavare una volta di più fino a quando non detriti chorion è lEFT. </li><li> Trasferire le uova / zigoti per risciacquati appena piastre di coltura con una pipetta Pasteur. Mantenere gli zigoti (non uova) a bassa densità (circa 200 embrioni per 10 cm piatto) per evitare la loro attacchino. Cultura gli embrioni allo stadio desiderato a temperature comprese tra 13 e 20 ° C. In alternativa, l&#39;elettroporazione gli zigoti (punto 5) o iniettare le uova non fecondate (punto 6). </li></ol> 5. elettroporazione <ol><li> Fecondare le uova e dechorionate gli zigoti a 18 ° C, come nelle sezioni 3 e 4. Fornire tra 50 e 400 uova per campione elettroporazione. </li><li> Preparare 50 microlitri DNA plasmidico in una provetta da 1,5 ml (max. 100 mg di DNA plasmidico in 50 microlitri DDH 2 O) e aggiungere 200 microlitri 0,95 M mannitolo. Mescolare bene nel vortex. </li><li> Spedizione e la gravità sedimenti gli zigoti dechorionated in siliconati provette da 1,5 ml. Rimuovere il ASWH fino al segno 100 microlitri sul tubo. </li><li> Procedere, consecutivamente, per ciascun tubo zigote come segue: aggiungisoluzione di DNA / mannitolo con una pipetta Pasteur. Mescolare delicatamente con gli zigoti e immediatamente prendere il DNA / mannitolo / sospensione zigote e trasferimento in una cuvetta elettroporazione 4 mm. </li><li> Posizionare la provetta immediatamente nel supporto elettroporazione e dare un singolo impulso di 16 msec a 50 V. </li><li> Rimuovere gli zigoti dalla provetta utilizzando la stessa pipetta Pasteur e li sparsi su un piatto di coltura contenente ASWH fresca e filtrata. Pipettare gli zigoti prima di iniziare a fendere circa 1 ora dopo la fecondazione (HPF) a 18 ° C. </li><li> Risciacquare la pipetta tra i campioni in un becher di ASWH. </li><li> Cultura gli zigoti a 15-20 ° C a bassa densità sufficiente di circa 200 embrioni per 10 cm piatto per evitare la loro attacchino. </li></ol> 6. microiniezione <ol><li> Preparare dechorionated uova per l&#39;iniezione. <ol><li> Dechorionate le uova a parte, da 2-4 animali, come descritto nella sezione 4. Tenere il non fecondato e dechorionated eGGS in piccolo agarosio piatti della cultura rivestiti separati. Lavare le uova più volte nei piatti per rimuovere i detriti. </li><li> Test di fertilizzare piccoli lotti di uova dechorionated (circa 50) da ogni individuo. Utilizzare un separato piatto cinque centimetri per ogni lotto e applicare 2 ml di spermatozoi attivi (punto 3.2). Mescolare bene agitando i piatti e diffondere le uova nel piatto spostando i piatti di lato. Mantenere lo sperma e le uova insieme per circa 10 minuti senza muoversi. </li><li> Eliminare un massimo di sperma come segue: trasferire le uova fecondate un piatto di coltura fresco o lavare due volte con ASWH fresca. Lasciare gli embrioni fendendo imperturbati fino alla fase a 32 celle (a 18 ° C per circa 3 ore dopo la fecondazione). Scegli uova dal migliore sviluppo batch (migliore percentuale di fertilizzazione e più modello scissione regolare) per la microiniezione. </li></ol></li><li> Impostare i aghi da iniezione. <ol><li> Backfill 4 aghi per iniezione in posizione verticale per consentire la gravità flow lungo il filamento. Deposito 0,5 soluzione ul iniezione (passo 1,8) contenente colorante vitale verde sul back-end degli aghi che sono posizionati ago punta verso il basso. Attendere che il liquido per riempire la punta dell&#39;ago in basso. </li><li> Riposizionare gli aghi in senso orizzontale e recupero informazioni con olio minerale con un metallo fine e lungo o punta della pipetta di plastica. Lentamente sovrapporre la soluzione per l&#39;iniezione con olio minerale espellere tutte le bolle d&#39;aria mentre si riempie l&#39;ago. </li></ol></li><li> Impostazione micromanipolatore in un 18 ° C raffreddato in camera. <ol><li> Collegare il tubo di plastica del supporto dell&#39;ago ad una siringa di vetro 10 ml riempito con olio minerale. Backfill il tubo e il supporto dell&#39;ago con olio ed espellere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Inserire l&#39;ago nel supporto dell&#39;ago e posizionare il supporto sul micromanipolatore. </li><li> Regolare il movimento porta-aghi lungo una linea retta con un angolo di 45 ° rispetto alla superficie. </li></ol></li><li> Orientare la dechorionauova ted lungo la rientranza agarosio del piatto iniezione, in modo che le uova possono essere iniettate uno per uno al microscopio di dissezione. </li><li> Rompere la punta dell&#39;ago, se necessario, spingendo delicatamente l&#39;ago contro l&#39;agarosio o contro un pezzo di copertura in vetro antiscivolo posta sul agarosio. Leggermente pressione la manopola della siringa per verificare che la punta dell&#39;ago è aperto (contenuto aghi verdi saranno espellere). </li><li> Iniettare il uova non fecondate uno per uno, introducendo dapprima l&#39;ago nell&#39;uovo e leggermente aspirando a rompere la membrana dell&#39;uovo seguita da iniezione. Iniettare soluzione iniettabile verde in mezzo l&#39;uovo per un massimo di 1/3 del diametro delle cellule. (Ciò corrisponde a circa 30 pl per un diametro uovo 140 micron). </li><li> Trasferire le uova non fecondate iniettato a un piatto di coltura fresco e incubare a 15-18 ° C fino a quando la fecondazione. </li><li> Fecondare le uova iniettate con sperma attivato di recente, come nelle concimazioni di prova (passo 6.1.2). eliminatEA massima dello sperma trasferendo le zigoti ad un piatto di coltura fresco. Stendere gli embrioni e non li perturbare durante le fasi di scissione (fino alla fase 32 celle). </li><li> Culture gli embrioni allo stadio desiderato ad una temperatura compresa tra 13 e 20 ° C. </li><li> Raccogliere gli embrioni da essi vorticoso nel centro del piatto e trasferirli in siliconato provette da 1,5 ml. Fissare e macchia, o montare (punti 7 e 8). </li><li> Confronta i fenotipi ottenuti agli controllo iniettato embrioni. NOTA: Iniettare un secondo non sovrapposte MO, che ha come obbiettivo la stessa trascrizione per ottenere fenotipi identici. Salvare la specifica fenotipo (s) MO con mRNA modificati codifica del proteina di interesse, ma che non è riconosciuto dal MOS. Iniettare un MO controllo che non dà fenotipo. </li></ol> 7. LacZ colorazione <ol><li> Raccogliere gli embrioni in una fase desiderata in siliconati provette da 1,5 ml e fissarli a 0,2% glutaraldeide in 1 ml ASWH per 1530 min massima. </li><li> Lavare 2x 10 minuti con 1 ml 1x PBT. </li><li> Risciacquare una volta in 500 microlitri di buffer LacZ colorazione. Sostituire con substrato X-Gal integrato 1 ml di tampone colorazione (utilizzare 10 ml / ml di 40 mg / ml di X-Gal magazzino). Trasferire gli embrioni in una piastra da 12 per una migliore osservazione della colorazione. </li><li> Incubare al buio. Variare incubazione da 0,5 ore a tutta la notte a 4 ° C, a temperatura ambiente oa 37 ° C a seconda della forza del driver esprime LacZ. </li><li> Lavare gli embrioni fino a 4 volte in 1 ml 1X PBT per rimuovere il tampone colorazione. </li><li> Post-correzione per 10 min a temperatura ambiente con 2% paraformaldeide (PFA) in 1 ml 1x PBT o 0,2% glutaraldeide in 1 ml 1x PBT per l&#39;interpretazione e la visualizzazione degli embrioni macchiati. </li></ol> 8. Montaggio di fluorescenza con etichette Wmbryos <ol><li> Fissare gli embrioni di una fase di sviluppo desiderato per 20 min a 2% PFA in 1 ml ASWH. </li><li> Lavare gli embrioni 2x in 1 ml 1x PBT. Evitare qualsiasi esposizioni di luceure mantenendo gli embrioni in condizioni di oscurità. </li><li> Trasferimento fino a 50 embrioni di una diapositiva. Rimuovere un massimo di PBT prima con una pipetta e accuratamente con un tovagliolo di carta. </li><li> Aggiungere 20-25 ml mezzo di montaggio. </li><li> Aggiungere un vetrino da posizionandolo in un angolo (da un lato in primo luogo) e abbassare lentamente con un oggetto appuntito (aghi, pinze, puntale) evitando le bolle fino a quando il campione è coperto. Fissare il vetrino ai bordi con punti di uno smalto trasparente. </li><li> Sigillare l&#39;intero vetrino con uno smalto dopo l&#39;essiccazione. Conservare al buio a -20 ° C. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ci sono due principali tecniche per generare transgenici embrioni Ciona: microiniezione di RNA o DNA ed elettroporazione del DNA. Queste tecniche di gene perturbazione in embrioni di Ciona sono stati utilizzati nel 1990 7,8 e da allora in poi successivamente migliorato, e ora utilizzati in Ciona (e altri generi ascidia) 20 in tutto il mondo. passaggi critici nel protocollo Transgenesi successo in gameti Ciona che sono facilmente raccolto da animali adulti dipende da una serie di fattori critici. La qualità dei gameti dipende la stagione riproduttiva (in genere da maggio a dicembre in Atlantico del Nord, che cambia con la temperatura dell&#39;acqua e l&#39;ossigenazione), sulla qualità dell&#39;acqua di mare negli acquari (a giusta salinità, adulti rimanere in buona salute per 2-4 settimane) e infine sulla corretta gestione dei gameti upon estrazione dalle adulti, come descritto di seguito per le varie fasi delprotocollo. Durante le fasi di preparazione, incubazione pipette Pasteur con acqua di rubinetto impedirà embrioni da attaccare e acqua di mare pre-incubazione di capsule di Petri agarosio rivestite rimuoverà sostanze tossiche rilasciate dalla agarosio. Generalmente, piatti possono essere preparati fino a 2 settimane prima dell&#39;uso, conservati a 4 ° C per evitare la crescita batterica e sciacquati momento, prima dell&#39;uso. Un giorno di vita, piccoli piatti sembrano meglio per preparazioni iniettabili. L&#39;efficienza e la durata del dechorionation è un passo cruciale nel protocollo come trattamento prolungato di uova / embrioni danneggia lo sviluppo. preparazione attenta (senza agitazione) e corretta conservazione (a 4 ° C per una settimana) preservare la qualità della soluzione dechorionation. Proteasi nella soluzione perdere efficienza se mescolato troppo violentemente preparazione o nel tempo, in particolare se conservato a temperatura ambiente per più ore / giorni. Abbiamo ottimizzato questo passaggio critico con la soluzione di dechorionation fresco convenientementepreparata da aliquote congelate di 20x soluzione madre. La corretta gestione delle fragili uova dechorionated / embrioni è essenziale e taglio o da taglio di embrioni mentre pipettaggio sarà dannosa. Quando pipettaggio, gli embrioni vengono mantenuti il ​​più possibile in sospensione (gentilmente &#39;soffiando&#39; liquido a turbinare li seguita pipettando liscia ma veloce), tenendo la pipetta di vetro in verticale anziché orizzontale. Tale protezione si applica a tutte le fasi di pipettamento per il lavaggio, risospensione e trasferire le uova / embrioni e su tubi, cuvette o piastre, prima e dopo la fissazione. Su fissazione, particolare attenzione dovrebbe essere presa per pipette separate per vivere rispetto a embrioni fisse per evitare tossicità da resti di fissativi. Microiniezione è piuttosto difficile in Ciona uova / embrioni causa delle loro piccole dimensioni e la resilienza della membrana vitellina e critico dipende da una dimensione di punta ottimizzata dil&#39;ago di iniezione, un angolo perfetto di iniezione (movimento dell&#39;ago in una linea, lungo il raggio uovo) e un finemente sintonizzato, rottura manuale della membrana vitellina (per aspirazione prima aspirazione per iniezione). Quest&#39;ultima è possibile solo se le bolle d&#39;aria vengono eliminati completamente dal tubo di iniezione che contiene olio minerale per il livellamento della pressione di aspirazione / iniezione. Inoltre, i pezzi più piccoli di polvere o uovo detriti ostruire l&#39;ago, e sono facilmente evitati da condizioni di lavoro pulite e fase di lavaggio delle uova prima di trasferire sul piatto iniezione. iniezione Post, il trasferimento di uova su piatti freschi eviterà gli effetti tossici da embrioni morti non essere sopravvissuti alla procedura di iniezione. Risoluzione dei problemi Potenziali problemi nella procedura possono essere indirizzate dai seguenti soluzioni. Bassi tassi di fecondazione possono derivare dall&#39;attivazione di spermatozoi insufficiente, basso pulizia uovo o grandi volumi di fecondazione. utilizzare freshly pool e meno diluito sperma. Verificare il movimento degli spermatozoi al momento dell&#39;attivazione. Lavare le uova con ASWH prima fecondazione come descritto al punto 4.2. Ridurre la quantità di acqua e di ridurre la quantità di uova per la fecondazione piatto / pozzetto. Perdere embrioni durante le fasi di preparazione possono essere evitati con l&#39;aggiunta di una goccia di soluzione dechorionation per centrifugare in modo più efficiente le uova / embrioni undechorionated. Dechorionation tempo dovrebbe essere ottimizzato come uova parzialmente dechorionated sarà non sedimenti e dechorionation prolungata è tossico, causando gli embrioni per esplodere. sviluppo asincrono può derivare da sperma residuo rilasciato durante la dissezione. Mantenere i lotti di uova separate da animali diversi per evitare incontrollata fertilizzazione incrociata. sviluppo anormale può avere diverse cause. All&#39;inizio e alla fine della stagione, dopo aver mantenuto l&#39;embrione da differenti individui separati, possono essere selezionate le migliori partite. Evitare perturbando gli embrioni per la10 min che seguono la fecondazione, per evitare di interferire con la loro segregazione ooplasmic. Assicurarsi che gli embrioni non iniziare dividendo pur essendo trasferito come pipettaggio separa i blastomeri sorella e si traduce in embrioni parziali. Usare meno spermatozoi per le uova dechorionated per evitare polispermia. Usare piatti preparati al momento agarosio ma risciacquati. Assicurarsi che il dispositivo di dispensazione è fissativo gratuito. Mantenere gli embrioni di controllo che non sono stati dechorionated e non elettroporate per rilevare in cui lo sviluppo passo è stato interrotto. Supplemento gli embrioni con antibiotici caso di contaminazione e la decomposizione. Se il dispositivo di iniezione è &#39;intasato,&#39; l&#39;apertura dell&#39;ago iniezione può essere verificata espellendo alcuni dei suoi contenuti macchiato. materiale intasamento può essere spazzato via trascinando con attenzione la punta dell&#39;ago attraverso l&#39;agarosio. Le bolle d&#39;aria nel tubo di iniezione e / o l&#39;ago deve essere rimosso. Cambiare l&#39;ago per un migliore controllo del volume di iniezione come il neepunta dle potrebbe rompersi o intasare lungo iniezione. Lavare le uova e metterli in un piatto di iniezione pulito se i detriti si è accumulata nel piatto. Centrifugare la soluzione per l&#39;iniezione prima del riempimento aghi freschi per sedimentare eventuali piccole particelle o cristalli. Anche utile è praticare l&#39;iniezione solo con il colorante vitale. Verificare la tecnica di iniezione da concimazione uova iniettate e non iniettati. Infine, la consultazione con un collega esperto può essere utile per migliorare la tecnica di iniezione. Per controllare gli effetti fuori bersaglio una seconda non sovrapposti MO e soccorso con un mRNA modificato che non è riconosciuto da MOS può fedelmente escludere effetti fenotipici non specifici in Ciona. Microiniezione: significato e limiti Microiniezione in Ciona è stato utilizzato per generare il primo progetto per una rete di regolamentare intero gene embrionale (GRN) in una cordati 11. Tuttavia, nonostante tale remarealizzazione rkable, microiniezione in embrioni Ciona ha limiti, a causa delle dimensioni relativamente ridotte (0,14 mm di diametro) di uova Ciona. Rispetto a quelli di altre specie cordati dove DNA estraneo / mRNA è introdotto da microiniezioni, uova Ciona sono relativamente difficili da gestire e il tasso di embrioni Ciona iniettati per esperimento rimane bassa (in media da 30 a 50 embrioni per esperimento), impedendo analisi quantitative. Tuttavia, per i fattori materni perturbanti in Ciona, microiniezione del MOS è il metodo di scelta anche per studiare il loro coinvolgimento nella insorgenza zygotic di sviluppo dal 16 a 32 cellule stadi 15. Inoltre, è possibile anche se molto più difficile microinject singoli blastomeri fino alla fase 16-32 cellule. Infine, microiniezione rimane la tecnica più efficiente per la generazione di embrioni transgenici (da mRNA o iniezione DNA) nelle specie di ascidie diverse da Ciona, per il quale completamente optiminon esistono protocolli di elettroporazione Zed. Elettroporazione: significato e limiti Per superare i numeri bassi e altri vincoli di microiniezione, gran parte della comunità Ciona ha utilizzato elettroporazione di DNA plasmidico da quando è stato sviluppato e pubblicato come protocollo ottimizzato e standardizzato da Zeller et al. Nel 2004 9. Infatti, migliaia di transgenici embrioni Ciona può essere generato in un&#39;ora fino a 500 embrioni contemporaneamente elettroporate in una cuvetta con un unico impulso 50 V di 16 msec. L&#39;approccio di generare un massiccio numero di embrioni transgenici è ancora unico tra organismi modello cordati. Questo aveva portato Ciona essere rapidamente riconosciuto come un sistema modello potente per l&#39;esecuzione in vivo analisi di potenziali regioni -regulatory cis e localizzazione cellulare / subcellulare, come esemplificato qui. Anche se electroporatisu di zigoti Ciona ha radicalmente rivoluzionato il campo della ricerca chordate GRN, la tecnica si trova di fronte, tuttavia, alcuni limiti. In primo luogo, i plasmidi sono transitoriamente introdotti in embrioni Ciona e sono molto probabilmente ereditati come array extracromosomici, rendendo la stabilità del DNA plasmide elettroporate speculativo. Inoltre, è molto difficile, forse impossibile, per controllare le copie di plasmidi elettroporate che verranno ripresi per zigote, conseguente fluttuazioni fenotipici. Un ulteriore problema che rende difficile interpretare i risultati elettroporazione è un fenomeno che chiamiamo mosaicism. DNA plasmidico elettroporate può essere preso in diverse posizioni della fase embrione unicellulare; che determina quali e quanti quarti della zigote riceveranno plasmide essere ereditata dai blastomeri discendenti. Tali variazioni rendono chiaramente l&#39;interpretazione di effetti quantitativi più difficile. Tuttavia, la maggior parte dei problemi che vengono con electroporavariabilità zione sono risolti da una quantità appropriata di campioni biologici, con il conteggio e statistiche del LacZ (o GFP) cellule positive, che è facilmente ottenibile in un singolo batch. Versatilità e potenziale di elettroporazione per l&#39;ingegneria genetica Elettroporazione infine permette per lo screening metà-throughput di potenziali regioni -regulatory cis e analisi quantitative della funzione del gene, una volta clonati in giornalista o espressione plasmidi. A causa del genoma compatto Ciona, l&#39;identificazione e la clonazione di potenziali regioni regolatorie è abbastanza semplice 3. Una strategia per l&#39;utilizzo del patrimonio di dati di comunità è dimostrato nella figura 2A. Clonazione di giornalista e di geni codificanti plasmidi è ulteriormente facilitato dalla generazione di Ciona adattato, Gateway Suites vettore compatibili 19 e una lunghezza totale compatibile biblioteca ORF 18. Entrambi gli strumenti sono a disposizione della comunità econsentire efficiente, restrizione ricombinazione privo enzimatico di driver regolamentazione e regioni codificanti, come illustrato nella Figura 2B. Negli ultimi anni, l&#39;elettroporazione è stato adattato con successo per raggiungere la manipolazione genetica dei tessuti-bersaglio con plasmidi che esprimono strumenti di modifica dei geni, come i componenti CRISPR / Cas9 sotto il controllo di tessuti driver specifici 21,22. Tali approcci avanzerà rapidamente la nostra comprensione delle dinamiche di GRN e dei meccanismi di segnalazione potenzialmente conservati, tra cui trascrizione dei codici dei fattori coinvolti nella formazione di tessuto e l&#39;uscita graduale dal pluripotenza. Inoltre, in perdita tessuto-specifica o il guadagno-di-funzione approcci (per CRISPR / Cas9 o di sovraespressione) usando elettroporazione sarà strumentale per studiare Ciona ortologhi di geni associati alla malattia umana. Infatti, cataloghi Ciona ortologhi di geni delle malattie umane e la loro lunghezza ORF codifica cloni sono prontamente disponibilLe analisi per Ciona 1 8. A causa delle ampie duplicazioni del genoma nei vertebrati, la maggior parte dei geni umani possiedono paraloghi funzionalmente ridondanti che complicano le analisi della funzione del gene 1. Ciona essere un sistema più semplice con la disposizione tipica del tessuto chordate nelle larve dovrebbe svelare i ruoli fondamentali di tali importanti geni, spesso funzionalmente conservati.

Recentemente, la sequenza del genoma e repertori gene trascritti sono diventate accessibili in un certo numero di organismi modello. Determinazione gene collegamenti funzionali, tuttavia, e come queste connessioni sono cablati nel DNA per eseguire l&#39;attività trascrizionale nel tempo e nello spazio embrionali, resta una sfida importante, soprattutto nei vertebrati. La complessità delle interazioni normativi e la complessità dei genomi 1,2, in particolare nei vertebrati, rallentano analisi funzionali efficienti, in particolare a livello del DNA in vivo. Infatti, nessun GRN è attualmente analizzato dalla fecondazione alla, stato terminalmente differenziate finale dell&#39;organismo in via di sviluppo. L&#39;ascidia C. intestinalis rappresenta un organismo modello in cui tale completa GRN analisi può essere possibile. Ha un genoma non duplicati tipico degli invertebrati con poca ridondanza genica. Vertebrati, al contrario hanno subito due turni di duplicazioni del genoma che HAVe ha generato più grandi famiglie di geni e la diversificazione funzionale, ma anche ridondanza tra paraloghi. Le compatte sequenze -regulatory cis (le centraline di GRN) di C. intestinalis, e un invariabile lignaggio embrionali con poche cellule ricordano C. elegans. Inoltre, la sua posizione filogenetica unica come un gruppo sorella invertebrati ai vertebrati entro cordati permette l&#39;osservazione dello sviluppo, con una risoluzione di cellulare, del piano di carrozzeria che costituisce cordati 3-6. La questione chiave che garantisce il successo futuro della genomica funzionale in organismi modello è la generazione di un gran numero di embrioni per quantitativi in vivo perturbazioni. Lo sviluppo della tecnica di microiniezione in Ciona uova 7, e la possibilità di ottenere rapidamente molti animali transgenici transitoriamente da elettroporazione in vivo in centinaia di Ciona zigoti 8,9 è stato un importante passo avanti nella <em&gt; Ciona genomica funzionale. Qui, per prima presentiamo la tecnica microiniezione più laboriosa per il targeting singoli geni che rimane il metodo di scelta per morfolino (MO) gene mediata knockdown, in particolare dei trascritti materni. oligo MO tipicamente bersaglio l&#39;iniziatore ATG o dei siti di splicing del RNA e interferiscono con traduzione in proteine. Abbiamo poi mostrato come l&#39;elettroporazione in uova fecondate di Ciona permette un gran numero di embrioni da analizzare in modo quantitativo, aprendo così viali di analisi efficiente di esaltatori in vivo e di guadagno-tessuto-specifica o la perdita-di approcci funzione, con la possibilità di manipolazioni e analisi simultanee. Abbiamo inoltre dimostrare come strumenti di community Ciona sono utilizzati per la previsione in silico di regioni regolatorie e la clonazione efficiente di tutti i fotogrammi di lettura aperti (ORF) in vettori di espressione. Infine, abbiamo dimostrato differenziali localizzazioni subcellulare di fluorescenza con tago proteine ​​su sovraespressione etichettati da elettroporazione.

<table><tbody><tr><td>Laboratorio con temperatura costante (~18 &deg; C)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Per lavori embrionali</td></tr><tr><td>Ciona intestinalis adulti</td><td>UPMC - Station Biologique, Roscoff, France</td><td></td><td>Per la raccolta di gameti</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>Per ASWH</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td>Per ASWH</td></tr><tr><td>CaCl2x2H2O</td><td>Roth</td><td>A119.1</td><td>Per ASWH</td></tr><tr><td>MgCl2x6H2O</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td>Per ASWH</td></tr><tr><td>MgS04x7H2O</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>Per ASWH</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>6885.1</td><td>Per ASWH</td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td>per ASWH</td></tr><tr><td>tioglicolato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MZ-6</td><td>per la pronasi di dechorionation</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>T0632-100G</td><td>per Dechorionation</td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G</td><td>Per elettroporazione</td></tr><tr><td>DNA plasmidico (prep >1&micro; g/&micro; l)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.100</td><td>Per elettroporazione o microiniezione</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Per il rivestimento di piastre per colture embrionali</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica</td><td>VWR</td><td>612-2079</td><td>Rivestito con l'1% di agarosio in ASWH, coperto con ASWH</td></tr><tr><td>Piccole forbici</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Per la dissezione di gameti</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Roth</td><td>6771.1</td><td>Per l'attivazione della soluzione di decorionazione</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Roth</td><td>5429.3</td><td>1 M pH 9.5, per l'attivazione degli spermatozoi</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur&nbsp;</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td>Trattato mediante immersione in acqua di rubinetto per almeno 12 ore</td></tr><tr><td>Centrifuga manuale</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>1011</td><td>Utilizzare provette da centrifuga in vetro</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 ml</td><td>Sigma</td><td>T3406-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 2 ml</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore quadrato</td><td>Bio Rad Gene Pulser Xcell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione 4 mm</td><td>Eurogentec</td><td>CE-0004-50</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Sto Premium</td><td>PR248212600</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>VWR</td><td>ECN 613-1551</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma</td><td>G6257-10ML</td><td>Per fissaggio in colorazione LacZ</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148-500G</td><td>Per la fissazione di campioni fluorescenti</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>Per il montaggio di campioni fluorescenti</td></tr><tr><td>X-Gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil &szlig;-D-Galactopiranoside)</td><td>Roth</td><td>2315.2</td><td>Substrato LacZ; stock in 40 mg/ml DMF (Dimetilformammide)</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6&#8226; 3H2O</td><td>Merck</td><td>4984</td><td>Per tampone di colorazione LacZ</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Merck</td><td>4973</td><td>Per tampone di colorazione LacZ</td></tr><tr><td>Na22HPO4</td><td>Roth</td><td>4984.2</td><td>Per PBT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Per PBT</td></tr><tr><td>Tween&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBJ5103V</td><td>per</td></tr><tr><td>olio minerale</td> PBT <td>Sigma</td><td>M8410</td><td>coltura embrionale testata</td></tr><tr><td>verde colorante vitale</td><td>veloce verde Sigma&nbsp;</td><td>F7251</td><td>per microiniezione; 10&micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette (fiammante/marrone)</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modello P-97</td><td>Per l'estrazione di aghi da iniezione</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato GC100TF-10</td><td>Harvard Apparatus Ltd. UK</td><td>30-0038</td><td>1,0 mm O.D. x 0,78 mm I.D., contenente filamento, per microiniezione</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MWS-2</td><td>Sistema oleodinamico a tre assi; per movimenti fini 3D durante l'iniezione</td></tr><tr><td>Supporto per iniezione</td><td>Narishige</td><td>1M-H1</td><td>Per contenere aghi da iniezione, intero sistema riempito con olio minerale</td></tr><tr><td>Siringa interamente in vetro</td><td>Walter Graf & Co GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>No. 95199.10427A4</td><td>10 ml FortunaOptima; riempito con olio minerale, per la regolazione fine della pressione di microiniezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Morfolini&nbsp;</td><td>GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA</td><td></td><td>Iniezione a 0,25-0,5 mM mRNA</td></tr><tr><td>con cappuccio</td><td>Ambion mMessage mMashine kit</td><td></td><td>Iniezione a 0,05-0,5&micro; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Iniezione di DNA</td><td></td><td></td> plasmidico <td>a 20 ng/&micro; l</td></tr><tr><td>Kit di clonazione per ricombinazione</td><td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td><td>11789-013</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione per ricombinazione</td><td>Gateway LR Clonasi Enzyme Mix Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo tag anti-HA</td><td>abcam</td><td>ab110</td><td>per l'immunofluorescenza, utilizzare 1:400 in 3% BSA/PBT</td></tr><tr><td>TRITC anticorpo anti-coniglio di capra</td><td>Jackson</td><td>111-025-144</td><td>per l'immunofluorescenza, utilizzare 1:300 in 3% BSA/PBT</td></tr></tbody></table>

embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; intestinalis ciona</em

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Gli organismi modello semplici sono strumentali per studi in vivo sui processi di sviluppo e differenziazione cellulare. Attualmente, la distanza evolutiva dall'uomo dei sistemi modello convenzionali di invertebrati e la complessità dei genomi nei vertebrati sono sfide critiche per modellare le condizioni normali e patologiche umane. Il cordato Ciona intestinalis è un cordato invertebrato emerso da un antenato comune con i vertebrati e può rappresentare caratteristiche all'interfaccia tra invertebrati e vertebrati. Un piano corporeo comune con una composizione cellulare e genomica molto più semplice dovrebbe svelare i collegamenti della rete di regolazione genica (GRN) e le letture della genomica funzionale che spiegano i fenomeni nella condizione dei vertebrati. Il genoma compatto di Ciona, un lignaggio embrionale fisso con poche divisioni e grandi cellule, combinato con strumenti di comunità versatili favorisce analisi funzionali geniche efficienti in questo organismo. Qui presentiamo diversi metodi cruciali per questo promettente organismo modello, che appartiene al gruppo gemello più vicino ai vertebrati. Presentiamo protocolli per la transgenesi transitoria mediante elettroporazione, insieme al knockdown genico mediato da microiniezione, che insieme forniscono i mezzi per studiare la funzione genica e gli elementi regolatori genomici. Estendiamo i nostri protocolli per fornire informazioni su come vengono utilizzati i database comunitari per la progettazione in silico di esperimenti di regolazione genica o funzionale genica. Uno studio di esempio dimostra come si possano ottenere nuove informazioni sull'interazione e la loro quantificazione di fattori neurali selezionati conservati tra Ciona e l'uomo. Inoltre, mostriamo esempi di localizzazione subcellulare differenziale in cellule embrionali, in seguito all'elettroporazione del DNA negli zigoti Ciona. Infine, discutiamo il potenziale di questi protocolli di essere adattati per l'interferenza genica tessuto-specifica con i metodi emergenti di editing genetico. Gli approcci in vivo di Ciona superano le principali carenze degli organismi modello classici nella ricerca di svelare meccanismi conservati nel programma di sviluppo dei cordati, rilevanti per la ricerca sulle cellule staminali, la scoperta di farmaci e la successiva applicazione clinica.

Microiniezione per gene regolatore studi di rete Embrioni della ascidia intestinalis Ciona sono adatti per il gene studi normativi funzionali o dei geni a livello di linea cellulare e con una risoluzione di cellulare. mRNA, MO o etichette possono essere microiniettati nell&#39;uovo fecondato o in singoli blastomeri seguenti fecondazione. MO gene mediato atterramento con la tecnica microiniezione è descritta al punto 6. MO si rivolgono specificamente l&#39;mRNA di geni selezionati e prevenire la loro traduzione in proteine. MO perdita-di-funzione (OL) di geni dello sviluppo cambia l&#39;espressione di una vasta gamma di geni a valle mediato, nel complesso rivelando uno sguardo nel embrionale GRN 10. Tali analisi in Ciona fornito il primo progetto normativo intero embrione in un metazoo 11. La figura 1 mostra un esempio di come microinjection è stato utilizzato per studiare la regolazione a monte della espressione del fattore di trascrizione Ci -Myelin conservato (Ci -MYT) allo stadio di gastrula di embrioni Ciona. Monitorato da ibridazione in situ (ISH), espressione endogena (Figura 1a, schematizzato nella figura 1a &#39;) viene osservato nel precursori piastra neurale 6-Row, di particolare cervello (righe III / IV, in rosso) e il midollo spinale ( I fila, in verde). Inoltre, Ci -MYT regolazione a monte è stato analizzato mediante iniezione MO target diversi fattori che sono espressi in o adiacenti ai precursori neuronali precedenti a Ci espressione -MYT insorgenza (Figura 1b-g). MO knockdown di fattori embrionali precoci, come la casella Aa Forkhead (Foxá-a) fattore di trascrizione e il fattore di crescita dei fibroblasti 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (Figura 1b o 1c, rispettivamente) elimina complessiva Ci -MYT espressione. Altri fattori di trascrizioneriguardano solo in parte espressione -MYT Ci conseguente downregulation MO-mediata in un sottogruppo di precursori del cervello (teste di freccia blu in figura 1d, F e G). Al contrario, l&#39;espressione Ci -MYT è ectopicamente attivato al down-regulation di Nodale (figura 1e, punte di freccia rossa), suggerendo che nodale reprime normalmente espressione -MYT Ci in questi precursori cordone nervoso laterali. Elettroporazione per gene efficiente studi funzionali e enhancer Elettroporazione di DNA plasmidico in zigoti Ciona è un metodo efficiente per la transgenesi transitoria e successiva osservazione dei cambiamenti fenotipici in vivo. A differenza di microiniezione di mRNA, elettroporazione consente la sovraespressione specifica dei tessuti, in cui le regioni del gene codificante (ORF, open reading frames) sono espressi sotto controllodi driver specifici tessuti. Questi costituiscono normalmente cis regioni -regulatory di geni noti (come il potenziatore brachyury per l&#39;espressione dei precursori di notocorda 8). Al contrario, l&#39;elettroporazione è strumentale per l&#39;analisi efficiente di regioni regolatorie in cui nuovi geni reporter (LacZ o proteina fluorescente verde, GFP) rivelano la loro attività in vivo. Il flusso di lavoro per l&#39;identificazione e la successiva analisi elettroporazione mediata di una regione regolatoria ad romanzo (per Ci -MYT) è mostrato in Figura 2. Un vasto repertorio di Ciona dati comunitari, facilmente accessibili in ascidie specifici browser genoma 12,13, come la Rete Ascidian per in situ espressione e Embriologico dati (semi di anice) 23, viene ispezionata per l&#39;identificazione in silico di regioni regolatorie (Figura 2A). La successiva reazione a catena della polimerasi (PCR) clonaggio base di queste regioni in vettori di espressione consente elettroporazione mediata test in vivo. (Figura 2B). Il browser genoma screen-shot in Figura 2A mostra la regione a monte del modello di trascrizione KH per Ci -MYT (primi tre esoni, in arancione, e due introni sono visibili). Diverse le tracce del browser genoma annotare i dati genomici funzionali previsti per questa regione, come ad esempio immunoprecipitazione della cromatina (chip) di dati 14 (qui indicati per ZicL, Ci Zinco dito del cervelletto L), conservazione sequenza tra due specie affini Ciona 15,24 o nucleosomi occupazione 16,17 (dall&#39;alto verso il basso nella figura 2A). In generale, proteine exonic regioni codificanti sono altamente conservati (pista di allineamento in Figura 2A). Ulteriori picchi alta conservazione compaiono nelle regioni non codificanti monte e nel primo introne. Due di questi sono previsti per essere nucleosomi un liberoecondo una sequenza basata algoritmo di 16,17 (cornici rosse nella figura 2A) suggerendo accessibilità ai fattori di trascrizione. Infatti, i segnali Chip-on-chip 14 per Ci -ZicL fattore di trascrizione vincolante (barre verdi in Figura 2a) sono arricchiti in queste due regioni conservate. Inoltre, utilizzando un&#39;interfaccia 25 che cerca potenziali siti di legame fattore di trascrizione, sono stati identificati i siti Zic situate all&#39;interno delle sequenze genomiche segnati da cluster Ci -ZicL Chip (frecce arancioni e sequenze con sottolineata ZIC-core, Figura 2A). Il legame di Ci -ZicL fattore di trascrizione in conservata e prevedibilmente nucleosomi regioni regolatorie libere Ci -MYT è coerente con la down-regulation dell&#39;espressione Ci -MYT osservato in MO-iniezione esperimenti atterramento mediate di targeting ZicL (Figura 1d). dopo dissuadereestrazione potenziali regioni -regulatory cis in silico per l&#39;espressione Ci -MYT, questi sono PCR amplificati da Ciona DNA genomico ed inseriti dalla ricombinazione clonazione in LacZ reporter di plasmidi 19. I costrutti sono poi elettroporate in uova fecondate Ciona (Figura 2B) e analizzati per la loro attività da LacZ colorazione (Figura 3). La figura 3 mostra che un tale approccio silico è stato possibile individuare due sequenze cis -regulatory separati che ricapitolano domini espressione Ci -MYT mRNA (confrontare Figura 1a). In generale, gli embrioni transgenici transitoriamente elettroporate con plasmide DNA spettacolo espressione mosaico solo in quelle cellule che hanno incorporato il DNA. Espressione Mosaico LacZ è quindi guidato da pmyt-R3 e può essere trovato in tutti i precursori che esprimono anche Ci </em&gt; -MYT MRNA cioè neurali precursori piatto della fila posteriore I e le file anteriori III / IV gastrula e fasi neurula precoce (Figura, 3a, b, punte di freccia viola e rosso, rispettivamente). Al contrario, pmyt-R5 è attivo solo nel posteriore (fila I) precursori piastra neurale e a partire dalla fase successiva neurula (Figura 3c, punte di freccia rossa). Le due regioni codificano così due aspetti spaziali e temporali separate di regolazione genica Ci-MYT. È interessante notare che entrambe le regioni regolatorie anche macchiano precursori aggiuntivi che non si vedono in ISH, in particolare nel anteriore e piastra neurale laterale e nei muscoli (Figura 3a, b, rosa, bianco, e punte di freccia di colore giallo, rispettivamente). Tale espressione più ampia può puntare a repressivi gli elementi che non sono contenuti nei frammenti normativi isolati (ad esempio per nodale che reprime laterale destino neurale, vedi Figura 1e) o per bassi livelli di espressione rilevati con accumuloLacZ segnale enzimatica. Oltre agli studi enhancer, elettroporazione in Ciona facilita anche le analisi funzionali di Ciona geni che codificano per la loro sovraespressione. Una grande raccolta di Ciona ORF piena lunghezza è a disposizione della comunità, ed è stato, inoltre, commentato per ortologhi umani, compresi i geni associati alla malattia 18. Geni individuali o gruppi di geni di questa libreria completa ORF cDNA compatibile ricombinazione-clonazione (Figura 2B) vengono facilmente trasferiti in vettori di destinazione contenenti driver appropriati per essere espressi in embrioni. Risultanti cloni espressione può, inoltre, essere co-elettroporate con cis -regulatory giornalista costrutti per testare il loro ruolo putativo di attivazione enhancer. Figura 2B illustra l&#39;isolamento di cloni dei ORF per i fattori di trascrizione Ci -ZicL e CI- GATAa e la loro recombination in vettori di destinazione adeguati che possono contenere i tag traslazionali 19 (ad esempio verde fluorescente Venus-o emoagglutinina virale (HA) -tag) e un driver specifico tessuto, come l&#39;amico di regione regolatoria Gata (driver pfog) per i primi di espressione pan-ectodermica 15 utilizzato nel presente studio. L&#39;effetto di Ci -ZicL sovraespressione nei tessuti ectodermica e neuroectodermici stato analizzato mediante co-elettroporazione di pmyt-R3&gt; LacZ e pmyt-R5&gt; LacZ reporter (Figura 3b &#39;, b&#39; &#39;e c&#39;, c &#39;&#39;, rispettivamente). Le nostre analisi suggeriscono che elettroporazione Ci -ZicL può attivare l&#39;espressione Ci -MYT attraverso pmyt-R3 e le regioni enhancer pmyt-R5 sia come costrutti reporter ha mostrato espressione LacZ ectopica nelle regioni ectodermiche (punte di freccia verde in figura 3b &#39;, b&#39; &#39;e C &amp;# 39;, c &#39;&#39;,). Come mostrato nella Figura 3d, elettroporazione di DNA plasmidico in centinaia di uova Ciona permette statisticamente rilevante quantificazione dei cambiamenti di espressione, illustrate per pmyt-R3&gt; espressione LacZ ectopica dalla concentrazione dipendente, pan-ectodermica espressione Ci -ZicL. Elettroporazione in vivo subcellulare localizzazione Figura 4 descrive la localizzazione subcellulare di fattori di trascrizione contrassegnate quando espressi su elettroporazione in blastomeri ectodermici usando costrutti di espressione adeguate (schematizzate in Figura 2B). Da fattori C-terminale di tagging di trascrizione (come ad esempio Ci -GATAa) con un tag Venere (figura 4b) o di una HA-tag (figura 4c) e sovraespressione nei tessuti ectodermici (pfog) Abbiamo potuto osservare che in vivo, &#39;Ci -GATAa è in gran parte localizzata a nuclei, come previsto per un fattore di trascrizione, mentre l&#39;espressione di Venere è onnipresente, tra cui il citoplasma. Esperimenti simili possono essere eseguiti per studiare la dinamica di localizzazione subcellulare nel corso del tempo, di individuo o di una combinazione di fattori di trascrizione, forse rivelando la loro co-localizzazione con diversi tag. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54313/54313fig1.jpg" /> Figura 1:. Valutare regolazione -MYT Ci dalla microiniezione nelle uova Ciona espressione Ci -MYT mRNA nel WT e Morpholino (MO) iniettato embrioni. (A) espressione modello WT di Ci -MYT nella piastra neurale. (A &#39;) Rappresentazione schematica di precursori macchiati in piastra neurale (NP). Linea I / II: posteriore destino neurale; fila III / IV: anteriore destino neurale; fila V / VI: palp destino. ( <stron.. g&gt; b - g) l&#39;espressione Ci -MYT su microiniezione di vari MOs per abbattere i geni che partecipano indicati nei primi anni del Ciona GRN (immagini adattato da Imai et al, 2006) 11 Ci -MYT, Ci -myelin fattore di trascrizione; WT, wild type; punte di freccia blu: perdita di segnale -MYT Ci; frecce rosse: ectopica segnale Ci -MYT. Barra di scala = 100 micron si riferisce a tutte le immagini. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54313/54313fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54313/54313fig2.jpg" /> Figura 2: Flusso di lavoro di in silico delle regioni enhancer e ricombinazione clonazione per transgenesi transitorio mediante elettroporazione in embrioni Ciona (A) Un&#39;istantanea dalla ANICE 23 ASCI.dian del browser genoma identifica sequenze regolatrici a monte di CI - MYT. Cornici rosse indicano due potenziali regioni -regulatory cis, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) e pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) che sono stati selezionati per l&#39;analisi mediante elettroporazione. I nomi delle tracce: sonde ZicL: chip-on-chip di dati 14; KH2012 Trascrizioni: Ciona intestinalis modelli di trascrizione; Allineamento Score Cs / Ci LastZ: conservazione sequenza tra Ciona savignyi (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) 15,24; . Segal 2006 ha previsto nucleosomi occupazione versione 1: pulcino addestrato algoritmo di calcolo da Segal et al, 2006 16 applicato a Ci come in Khoueiry et al, 2010 17 barre verdi:.. Ci -ZicL ChIP Picchi 14; frecce arancioni: predetto siti Zic; GCTG: nucleo ZIC sito di legame. (B) Schema per la generazione di costrutti iperespressione da un Communa a figura intera biblioteca ORF cDNA, ricombinati in vettori di destinazione contenenti i conducenti dei tessuti specifici (pfog) e tag proteine successivamente co-elettroporate con costrutti reporter (come pmyt-R3&gt; LacZ o pmyt-R5&gt; LacZ) per in vivo lettura Ci. - MYT, Ci fattore di trascrizione -myelin; Ci -ZicL, Ci Zinco dito del fattore di trascrizione L cervelletto;. pfog, regione regolatoria di Ci -Friend di GATA <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54313/54313fig2large.jpg" target="_blank">prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54313/54313fig3.jpg" /> Figura 3: embrioni elettroporate Ciona mostrano Ci -ZicL inducibile -Regolamento cis spazio-temporale di Ci -MYT LacZ embrioni macchiate a metà gastrul.un (mg) / tardo-gastrula (LG) o neurula fase iniziale (EN) sono mostrati che sono stati co-elettroporate sia con pmyt-R3&gt; LacZ o pmyt-R5&gt; LacZ e un costrutto di controllo (pfog&gt; mCherry) o pfog&gt; ZicL. Il driver pfog 19 media ectopica (pan-animale) espressione ZicL in ectoderma e neuroectoderma e provoca ectopica macchia LacZ in queste cellule. (A) attività di pmyt-R3 LacZ in embrioni fase mg / lg (piccole punte di freccia, pannello di sinistra) o in territori schematiche corrispondentemente colorati (cerchi blu, pannello di destra); vista vegetale (VG). Linea I / II: posteriore destino neurale; Linea III / IV: anteriore destino neurale; Row V / VI: palp destino. (B) l&#39;attività pmyt-R3 in fasi IT nei tessuti come in una. (B &#39;) ectopica attività pmyt-R3 upon Ci -ZicL co-elettroporazione è indicato da frecce verdi. (B &#39;&#39;) Stesse embrioni come in b &#39;, orientata al polo animale fino (a). ( <strong&gt; c) attività pmyt-R5 LacZ negli stadi (c &#39;) ectopica attività pmyt-R5 su Ci -ZicL co-elettroporazione è indicato da frecce verdi. (C &#39;&#39;) Stesse embrioni come in C &#39;, ma orientato polo animale fino (a). (D) Quantificazione di esperimenti rappresentativi per Ci -ZicL over-attivazione pmyt-R3 a basse concentrazioni. Una ripetizione biologica è rappresentata Ci -MYT, Ci -myelin fattore di trascrizione;. Ci -ZicL, Ci Zinco dito del fattore di trascrizione cervelletto L; Ci -FOG, Ci -Friend di GATA; WT, wild type; MG, mid-gastrula; LG, tardo-gastrula; EN, neurula precoce; una vista in animali; vg, vista vegetale; NLS LacZ, segnale di localizzazione nucleare per LacZ. Scala bar = 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54313/54313fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura</a>. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54313/54313fig4.jpg" /> Figura 4:. Differenziale localizzazione subcellulare di proteine su elettroporazione localizzazione di Venere-tag o Hemagglutinin- (HA) -tagged proteine overexpressed nelle cellule ectodermiche utilizzando il driver pfog 19. (A - c) le immagini DIC. (A &#39;, b&#39;) corrispondenti immagini di fluorescenza. (C &#39;) immagine di fluorescenza corrispondente su etichettatura istologico immunitario con TRITC. Barra di scala = 100 micron si riferisce a tutte le immagini. DIC, interferenza differenziale contrasto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54313/54313fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Vi presentiamo transgenesi transitori e silenziamento genico in Ciona intestinalis, un gruppo sorella chordate di vertebrati, utilizzando tecniche di microiniezione e elettroporazione. Tali metodi facilitano genomica funzionale in questo semplice invertebrato che dispone di caratteristiche rudimentali di vertebrati, tra cui notocorda e epiteli sensoriali della testa, e molti ortologhi di malattie associate geni umani.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

L'obiettivo generale delle tecniche di trasfezione transitoria negli embrioni di Ciona è studiare la regolazione genica e la funzione necessarie per formare larve simili a girini, sfruttando la loro linea cellulare invariante e il genoma compatto di invertebrato, al fine di ottenere informazioni sulle origini degli invertebrati cordati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica molecolare, come i meccanismi conservati del programma di sviluppo dei cordati che sono rilevanti per la ricerca sulle cellule staminali e per la scoperta di farmaci. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, mediante elettroporazione degli embrioni, è possibile manipolare centinaia o migliaia di embrioni sincronizzati in un solo giorno.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà a causa della delicata dechorionazione dell'embrione e della complessità nello sviluppare una tecnica di microiniezione efficiente. Iniziare dissezionando adulti di Ciona in una stanza per embrioni mantenuta a 18 gradi Celsius. Utilizzare forbici piccole per praticare un'incisione all'estremità opposta dei sifoni e sul lato del sifone più corto, sotto il quale si trovano l'ovidotto e il dotto spermatico.Allunga l'incisione per esporre l'ovidotto. Quindi, utilizza la punta delle forbici per praticare un'incisione precisa nell'ovidotto. Premi delicatamente l'ovidotto con le forbici chiuse ed estrai le uova.Lasciare cadere direttamente le uova in una piastra a sei pozzetti contenente acqua di mare artificiale con HEPES. Utilizzare una pipetta di Pasteur, prerisciacquata con ASWH, per raccogliere e trasferire le uova rimanenti. Per raccogliere lo sperma, tagliare il dotto spermatico con le forbici, quindi utilizzare una pipetta di Pasteur separata per raccogliere lo sperma concentrato e trasferirlo in una provetta da 1,5 millilitri.Attivare gli spermatozoi combinando un millilitro di ASWH e 50 microlitri di Tris in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di sperma concentrato, chiudere il cappuccio e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo o utilizzando una pipetta di Pasteur. Poi, aggiungere da 100 a 200 microlitri della soluzione di sperma attivato in ogni pozzetto contenente uova, e mescolare bene aspirando e dispensando con la pipetta, in modo che le uova galleggino nel mezzo.Iniziare la dechorionazione raccogliendo gli zigoti e distribuendoli in provette di vetro. Con la centrifuga manuale, centrifugare gli zigoti a 1200 ×g per circa 20 secondi, quindi fermare lentamente la centrifuga. Rimuovere l'ASWH dai pellet con una pipetta di Pasteur.Aggiungere quattro millilitri di soluzione attivata di dechorionazione al pellet in ogni provetta. Sospendere i zigoti pipettando delicatamente su e giù con una pipetta di Pasteur trattata con acqua di rubinetto, munita di una piccola pera di gomma. La soluzione dovrebbe diventare giallastra dopo 1-3 minuti.Durante la dechorionazione, prelevare un piccolo aliquota della sospensione dechorionante utilizzando la pipetta di Pasteur. Depositare una goccia su un vetrino e osservarla al microscopio stereoscopico. Aspirare e rilasciare la sospensione di zigoti con la pipetta e controllare il vetrino ogni 20-30 secondi.Prima le cellule follicolari si staccano, poi la coriona diventa gialla e opaca e, infine, si stacca dagli zigoti. Gli zigoti dechorionati di colore rosa affonderanno sul fondo del tubo di vetro. Quando oltre il 50% degli zigoti è dechorionato, riempire il tubo con ASWH.Centrifugare molto delicatamente per circa 10-15 secondi, giusto il tempo necessario per sedimentare i zigoti dechorionati. Arrestare lentamente la centrifuga. Rimuovere quasi tutto il liquido dal tubo di vetro, inclusi eventuali materiali galleggianti, e sostituirlo con ASWH.Pipettare lentamente su e gi&ugrave; per lavare, quindi centrifugare delicatamente come in precedenza. Lavare nuovamente fino a quando non rimane alcun residuo di corione. Far sedimentare per gravit&agrave; il lavaggio fino ai zigoti dechorionati in provette silanizzate da 1,5 millilitri.Dopo la sedimentazione, rimuovere l'ASWH fino al segno di 100 microlitri sul tubo. Utilizzare ora una pipetta di Pasteur per aggiungere 250 microlitri di DNA precedentemente preparato in soluzione di mannitolo a un tubo di zigoti. Mescolare delicatamente e trasferire immediatamente la miscela in una cuvetta di elettroporazione da quattro millimetri.Posizionare la cuvetta nel supporto per elettroporazione e applicare un singolo impulso di 16 millisecondi a 50 volt. Successivamente, rimuovere gli zigoti dalla cuvetta utilizzando la stessa pipetta di Pasteur ed espellerli in una piastra di coltura contenente ASWH fresco e filtrato. Agitare la piastra per distribuire uniformemente gli zigoti.Risciacquare la pipetta in un becher di ASWH, quindi passare al campione successivo. Dopo aver elettroporato tutti i zigoti, coltivare gli zigoti a una temperatura compresa tra 15 e 20 gradi Celsius. Impostare il micromanipolatore in una stanza raffreddata a 18 gradi Celsius.Collegare il tubo di plastica e il portaago al cilindro di una siringa di vetro da 10 millilitri riempita con olio minerale. Riempire nuovamente con olio il tubo e il portaago, ed eliminare eventuali bolle d'aria. Inserire l'ago di iniezione contenente 0,5 microlitri di soluzione di iniezione con colorante verde vitale nel portaago.E posizionare il supporto sul micromanipolatore. Regolare il supporto dell'ago in modo che si muova lungo una linea retta con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie. Orientare le uova dechorionate in una piccola piastra di coltura rivestita con agarosio lungo un'incisione, in modo che le uova possano essere iniettate una alla volta sotto il microscopio stereoscopico.Se necessario, rompere la punta dell'ago spingendolo delicatamente contro un frammento di vetrino di vetro posizionato sull'agarosio. Applicare una leggera pressione per verificare che la punta dell'ago sia aperta. Iniettare le uova non fecondate una alla volta, introducendo prima l'ago nell'uovo ed eseguendo una leggera aspirazione per rompere la membrana dell'uovo.Quindi, iniettare la soluzione verde al centro dell'uovo, fino a un massimo di un terzo del diametro della cellula. Dopo aver iniettato tutti gli uova, rimuovere l'ago, trasferire le uova iniettate non fecondate in una nuova piastra di coltura e incubare a 15-18 gradi Celsius fino alla fecondazione. L'iniezione microscopica è stata utilizzata per studiare la regolazione del fattore di trascrizione della mielina di Ciona intestinalis, o MyT, allo stadio di gastrula degli embrioni di Ciona.Mediante ibridazione in situ, l'espressione endogena viene osservata nei precursori della piastra neurale della sesta fila nei soggetti di tipo selvaggio. L'iniezione microscopica di morfolini per inibire fattori embriogenetici precoci, come la Forkhead box A, un fattore di trascrizione, elimina completamente l'espressione di MyT. Al contrario, l'espressione di MyT viene attivata ectopicamente in seguito alla riduzione dell'espressione di nodal, suggerendo che nodal normalmente reprimi l'espressione di MyT in questi precursori del cordone nervoso laterale.Il fattore di trascrizione GATAa è stato marcato con un'etichetta Venus ed elettroporato in blastomeri ectodermici con un driver pfog. Come si può osservare, GATAa è localizzato principalmente nei nuclei, come previsto per un fattore di trascrizione, mentre l'espressione di Venus è ubiqua.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la trasfezione transitoria mediante elettroporazione in zigoti di Ciona sincronizzati, di come manipolare gli embrioni dechorionati, particolarmente fragili, e di come individuare l'angolo corretto per la microiniezione. Dopo il loro sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada verso la genomica funzionale. Per esplorare la funzione genica, le reti di regolazione genica e i moduli evolutivamente conservati, importanti anche nella formazione dei tessuti negli esseri umani.

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