Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate Intestinalis Ciona

L'obiettivo generale delle tecniche di trasfezione transitoria negli embrioni di Ciona è quello di studiare la regolazione genica e la funzione necessaria per formare larve simili a girini, sfruttando il loro lignaggio cellulare invariante e il genoma compatto degli invertebrati, al fine di ottenere informazioni sulle origini degli invertebrati cordati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica molecolare, come i meccanismi conservati del programma di sviluppo dei cordati che sono rilevanti per la ricerca sulle cellule staminali e per la scoperta di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che con l'elettroporazione degli embrioni è possibile gestire centinaia o migliaia di embrioni sincronizzati in un giorno.

Generalmente gli individui che si avvicinano per la prima volta a questo metodo avranno difficoltà, a causa della decorionazione dell'embrione fragile e perché è difficile sviluppare una tecnica di microiniezione efficiente. Inizia sezionando gli adulti di Ciona in una stanza per embrioni raffreddata a 18 gradi Celsius. Con le forbici piccole praticate un'incisione all'estremità opposta dei sifoni e sul lato del sifone più corto, sotto il quale scorre l'ovidotto e il dotto spermatico.

Allungare l'incisione per esporre l'ovidotto. Quindi, usa la punta delle forbici per praticare un'incisione precisa nell'ovidotto. Premere delicatamente l'ovidotto con le forbici chiuse e togliere le uova.

Lascia che le uova cadano direttamente in una piastra a sei pozzetti contenente acqua di mare artificiale con HEPES. Utilizzare una pipetta pasteur, pre-risciacquata con ASWH, per raccogliere e trasferire le uova rimanenti. Per raccogliere lo sperma, tagliare il dotto spermatico con le forbici, quindi utilizzare una pipetta pasteur separata per raccogliere lo sperma concentrato e trasferirlo in una provetta da 1,5 millilitri.

Attiva lo sperma combinando un millilitro di ASWH e 50 microlitri di Tris in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungi 20 microlitri di spermatozoi concentrati, chiudi il tappo e mescola delicatamente capovolgendo il tubo o usando una pipetta pasteur. Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri di soluzione di spermatozoi attivati a ciascun pozzetto di ovuli e mescolare bene pipettando su e giù, in modo che gli ovuli galleggino nel terreno.

Iniziare la decorionazione raccogliendo gli zigoti e dispensandoli in tubi di vetro. Con la centrifuga a mano, far girare gli zigoti a milleduecento volte G per circa 20 secondi, quindi fermare lentamente la centrifuga. Rimuovere l'ASWH dai pellet con una pipetta pasteur.

Aggiungere quattro millilitri di soluzione di decorionazione attivata al pellet in ciascuna provetta. Sospendi gli zigoti pipettandoli delicatamente su e giù con una pipetta pasteur trattata con acqua di rubinetto, sormontata da una piccola pera di gomma. La soluzione dovrebbe diventare giallastra dopo 1 o 3 minuti.

Durante la decorioinazione, rimuovere una piccola aliquota della sospensione decronizzante, utilizzando la pipetta pasteur. Depositare una goccia su un vetrino e osservarla al microscopio da dissezione. Pipettare la sospensione dello zigote su e giù e controllare il vetrino ogni 20-30 secondi.

Prima le cellule del follicolo si staccano, poi il corion diventa giallo e opaco e, infine, si stacca dagli zigoti. Gli zigoti dechorionati rosa affonderanno sul fondo del tubo di vetro. Una volta che più del 50% degli zigoti è dechorionato, riempire la provetta con ASWH.

Centrifugare molto delicatamente per circa 10-15 secondi, quanto basta per sedimentare gli zigoti dechorionati. Arrestare lentamente la centrifuga. Rimuovere quasi tutto il liquido dal tubo di vetro, compreso l'eventuale materiale galleggiante, e sostituirlo con ASWH.

Pipettare lentamente su e giù per lavare, quindi centrifugare delicatamente come prima. Lavare di nuovo fino a quando non rimangono più detriti di corion. Sedimento per gravità il lavaggio in zigoti dechorionati in tubi siliconati da 1,5 millilitri.

Dopo la sedimentazione, rimuovere l'ASWH fino al segno di 100 microlitri sul tubo. Ora usa una pipetta Pasteur per aggiungere 250 microlitri di DNA precedentemente preparato in soluzione di mannitolo a una provetta di zigoti. Mescolare delicatamente e trasferire immediatamente il composto in una cuvetta per elettroporazione da quattro millimetri.

Posizionare la cuvetta nel supporto dell'elettroporazione e dare un singolo impulso di 16 millisecondi a 50 volt. Quindi rimuovere gli zigoti dalla cuvetta utilizzando la stessa pipetta pasteur ed espellerli in una piastra di coltura contenente ASWH fresco e filtrato. Agitare il piatto per distribuire gli zigoti.

Sciacquare la pipetta in un becher di ASWH, quindi passare al campione successivo. Dopo aver eproceronato tutti gli zigoti, allevi gli zigoti a una temperatura compresa tra 15 e 20 gradi Celsius. Installare il micromanipolatore in una stanza raffreddata a 18 gradi Celsius.

Collegare il tubo di plastica e il portaago a una siringa di vetro da 10 millilitri riempita di olio minerale. Riempire il tubo e il portaago con olio ed espellere eventuali bolle d'aria. Inserire l'ago per iniezione che contiene 0,5 microlitri di soluzione iniettabile con colorante vitale verde nel supporto dell'ago.

E posizionare il supporto sul micro-manipolatore. Regolare il portaago in modo che si muova lungo una linea retta con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie. Orientare le uova dechorionate in una piccola piastra di coltura rivestita di agarosio lungo una rientranza, in modo che le uova possano essere iniettate una per una al microscopio di dissezione.

Se necessario, rompere la punta dell'ago spingendo delicatamente l'ago contro un pezzo di vetrino, posto sull'agarosio. Applicare una leggera pressione per verificare che la punta dell'ago sia aperta. Iniettare gli ovuli non fecondati uno per uno, introducendo prima l'ago nell'ovulo e aspirando leggermente per rompere la membrana dell'uovo.

Quindi, iniettare la soluzione di iniezione verde al centro dell'uovo, fino a un massimo di un terzo del diametro della cella. Dopo aver iniettato tutte le uova, rimuovere l'ago, trasferire le uova iniettate e non fecondate in un piatto di coltura fresco e incubare a 15-18 gradi Celsius fino alla fecondazione. La microiniezione è stata utilizzata per studiare la regolazione del fattore di trascrizione della mielina Ciona intestinalis o MyT, allo stadio di gastrula degli embrioni di Ciona.

Monitorata mediante ibridazione in situ, l'espressione endogena è osservata nei precursori della placca neurale della sesta fila in wild type. La microiniezione di morfolini per abbattere i fattori embrionali precoci, come la scatola Forkhead A, un fattore di trascrizione, elimina l'espressione complessiva di MyT. Al contrario, l'espressione di MyT è attivata ectopicamente in seguito alla sottoregolazione del nodo, suggerendo che il nodo normalmente reprime l'espressione di MyT in questi precursori del cordone nervoso laterale.

Il fattore di trascrizione GATAa è stato marcato con un tag di Venere ed elettroporato in blastomeri ectodermici con un driver pfog. Come si vede qui, GATAa è per lo più localizzato nei nuclei, come previsto per un fattore di trascrizione. Mentre l'espressione di Venere è onnipresente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la trasfezione transitoria mediante elettroporazione in zigoti Ciona sincronizzati, come gestire i fragili embrioni dechorionati e come trovare l'angolo corretto della microiniezione. Dopo il loro sviluppo, queste tecniche hanno aperto la strada alla genomica funzionale. Esplorare la funzione genica, le reti di regolazione genica e conservare i moduli di sviluppo, importanti per la formazione dei tessuti anche nell'uomo.