Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

Qui descriviamo un metodo immunochimico sensibile per mappare la distribuzione spaziale dei derivati di ossidazione 5mC basati sull'uso di anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sull'amplificazione del segnale della tiramide.

L'obiettivo generale di questo protocollo immunochimico è quello di valutare la distribuzione spaziale di forme modificate di citosina in vari contesti tissutali e cellulari sulla base dell'uso di anticorpi secondari coniugati con perossidasi e dell'amplificazione del segnale della tiramide. Questo metodo supera i limiti di altre tecniche che non forniscono informazioni spaziali necessarie per comprendere la funzione biologica delle forme modificate di citosina. Inoltre, questo metodo consente la co-rilevazione di forme modificate di citosina con marcatori di linea proteica e può essere impiegato per studiare la loro localizzazione nucleare.

Per iniziare questa procedura, fissare sezioni di tessuto reidratato di embrioni di topo CD1 wild-type e tessuti cerebrali adulti mettendoli in PFA ghiacciato al 4% o al 4% FA per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il fissativo in eccesso lavando le sezioni in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, permeabilizzare le sezioni di tessuto mettendole in un barattolo Coplin riempito di PBX per 30 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere il PBX in eccesso lavando brevemente le sezioni in PBT. Ora, posizionare le sezioni permeabilizzate in HCl 2 N per 60 minuti a temperatura ambiente per la depurizzazione del DNA. Quindi, trasferire le sezioni in Tris-Hcl da 10 millimolari per 30 minuti a temperatura ambiente per neutralizzare l'HCl.

In alternativa, lavare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS. Incubare le sezioni in PBT per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere con cura il liquido dall'area circostante le sezioni di tessuto.

Nel frattempo, mantenere umide le sezioni di tessuto. Usa una penna barriera idrofobica per circondare le sezioni senza toccarle. Successivamente, incubare le sezioni in 100 microlitri di soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente in una camera umida.

Quindi, incubare le sezioni di tessuto in 100 microlitri di una diluizione 1:5000 di un anticorpo primario monoclonale di topo anti-5hmC e diluizione 1:1000 di un anticorpo primario policlonale di coniglio anti-5caC in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. In alternativa, eseguire l'incubazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere gli anticorpi in eccesso lavando le sezioni in un barattolo Coplin riempito di PBT tre volte per cinque minuti ciascuna a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere il PBT in eccesso e, se necessario, circondare nuovamente le sezioni con una penna barriera idrofobica poiché il PBT contiene un detergente che può indebolire la barriera idrofobica. Successivamente, effettuare una diluizione 1:400 dell'anticorpo coniugato HRP anti-coniglio di capra e una diluizione 1:400 dell'anticorpo coniugato 555 anti-topo d'asino in soluzione bloccante. Quindi incubare le sezioni di tessuto in 100 microlitri della miscela di anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente in una camera umida.

Successivamente, lavare le sezioni di tessuto in un barattolo Coplin riempito di PBT tre volte per cinque minuti ciascuna a temperatura ambiente. Quindi trasferire le sezioni di tessuto in 100 microlitri di tiramide a una diluizione di 1:200 nel tampone di amplificazione del segnale della tiramide per due minuti a temperatura ambiente. Il tempo di incubazione è stato quello in cui la soluzione di tiramide deve essere ottimizzata sperimentalmente per ogni singolo lotto di kit di amplificazione del segnale di tiramide in cui si osserva una relazione lineare tra l'intensità del segnale e la durata dell'amplificazione del segnale basata sulla tiramide.

Subito dopo, rimuovere la soluzione di tiramidide in eccesso lavando i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno in PBT. Rimuovere con cautela il PBT in eccesso e coprire immediatamente le sezioni con una goccia di mezzo di montaggio. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sulle sezioni di tessuto e sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.

Quindi mantenere le sezioni di tessuto a quattro gradi Celsius per diverse ore prima dell'esame microscopico. Per determinare la distribuzione di 5hmC in sezioni di tessuto cerebrale, la co-rilevazione di questa modificazione epigenetica è stata eseguita con un marcatore per i neuroni post-mitotici, NeuN. L'analisi immunoistochimica ha rivelato che, mentre la colorazione prominente di 5hmC colocalizzava con le cellule NeuN-positive, le cellule gliali NeuN-negative possedevano livelli più bassi di 5hmC genomico.

Per determinare la distribuzione di 5caC nelle cellule staminali neurali differenzianti, il costaining di questo marcatore è stato eseguito con un marcatore gliale, GFAP, sulle colture fisse di cellule staminali neurali tre giorni dopo l'induzione del differenziamento gliale. A differenza delle cellule staminali neurali o degli astrociti maturi, è stato osservato un forte segnale 5caC in un'ampia percentuale di cellule che esprimono GFAP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di avere a portata di mano tutti i reagenti e i materiali insieme ai campioni. Dopo questa procedura, l'imaging confocale può essere eseguito per rispondere a ulteriori domande sulla distribuzione nucleare di forme modificate di citosina. Questo può contribuire a decifrare la loro potenziale funzione biologica.

Non dimenticare che lavorare con 2 N Hcl può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'armadio di sicurezza e l'abbigliamento protettivo.