Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

L'obiettivo generale di questo protocollo immunochemico è valutare la distribuzione spaziale di forme modificate della citosina in diversi contesti tissutali e cellulari, basandosi sull'uso di anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sull'amplificazione del segnale mediante tiaramide. Questo metodo supera i limiti di altre tecniche che non forniscono informazioni spaziali necessarie per comprendere la funzione biologica delle forme modificate della citosina. Inoltre, questo metodo consente la co-rilevazione di forme modificate della citosina insieme a marcatori proteici di linea cellulare e può essere impiegato per studiarne la localizzazione nucleare.

Per iniziare questa procedura, fissare sezioni di tessuto reidratate di embrioni di topo CD1 di tipo selvaggio e tessuti cerebrali adulti posizionandole in PFA al 4% o in FA al 4% freddi per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il fissativo in eccesso lavando le sezioni in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Poi, permeabilizzare le sezioni di tessuto immergendole in un barattolo Coplin riempito con PBX per 30 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere l'eccesso di PBX lavando brevemente le sezioni in PBT. A questo punto, collocare le sezioni permeabilizzate in HCl 2 N per 60 minuti a temperatura ambiente per la deapurinazione del DNA. Successivamente, trasferire le sezioni in Tris-HCl 10 millimolare per 30 minuti a temperatura ambiente per neutralizzare l'HCl.

In alternativa, lavare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS. Incubare le sezioni in PBT per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere con attenzione il liquido dalla zona circostante le sezioni di tessuto.

Nel frattempo, mantenere i taglietti di tessuto umidi. Utilizzare una penna con barriera idrofoba per delimitare i taglietti senza toccarli. Successivamente, incubare i taglietti in 100 microlitri di soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.

Quindi, incubare le sezioni di tessuto in 100 microlitri di una diluizione 1:5000 di un anticorpo primario monoclonale murino anti-5hmC e di una diluizione 1:1000 di un anticorpo primario policlonale di coniglio anti-5caC in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente. In alternativa, eseguire l'incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere gli anticorpi in eccesso lavando le sezioni in un barattolo di Coplin riempito con PBT, tre volte per cinque minuti ciascuna, a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere l'eccesso di PBT e, se necessario, delimitare nuovamente le sezioni con una penna per barriera idrofoba, poiché il PBT contiene un detergente che può indebolire la barriera idrofoba. Successivamente, preparare una diluizione 1:400 di anticorpo secondario anti-coniglio da capra coniugato con HRP e una diluizione 1:400 di anticorpo secondario anti-topo da asino coniugato con 555 in soluzione bloccante. Incubare quindi le sezioni di tessuto in 100 microlitri della miscela di anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.

In seguito, lavare le sezioni di tessuto in un barattolo Coplin riempito con PBT per tre volte, cinque minuti ciascuna, a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire le sezioni di tessuto in 100 microlitri di tiaramide in una diluizione 1:200 nel buffer di amplificazione del segnale con tiaramide per due minuti a temperatura ambiente. Il tempo di incubazione nella soluzione di tiaramide deve essere ottimizzato sperimentalmente per ogni singolo lotto del kit di amplificazione del segnale con tiaramide, in cui si osserva una relazione lineare tra l'intensità del segnale e la durata dell'amplificazione del segnale basata sulla tiaramide.

Immediatamente dopo, rimuovere la soluzione di tiaramide in eccesso lavando i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuna in PBT. Rimuovere con attenzione il PBT in eccesso e coprire immediatamente le sezioni con una goccia di mezzo di montaggio. Posizionare delicatamente un coprioggetto sulle sezioni di tessuto e sigillare il coprioggetto con smalto per unghie.

Quindi conservare le sezioni di tessuto a quattro gradi Celsius per diverse ore prima dell'esame microscopico. Per determinare la distribuzione di 5hmC in sezioni di tessuto cerebrale, è stata eseguita la codetenzione di questa modificazione epigenetica con un marcatore per neuroni post-mitotici, NeuN. L'analisi immunohistochimica ha rivelato che mentre la marcatura evidente di 5hmC colocalizzava con cellule positive per NeuN, le cellule gliali negative per NeuN presentavano livelli inferiori di 5hmC genomico.

Per determinare la distribuzione di 5caC nelle cellule staminali neurali in differenziamento, è stata eseguita una colorazione doppia di questo marcatore con un marcatore gliale, GFAP, su colture fisse di cellule staminali neurali a tre giorni dall'induzione della differenziazione gliale. A differenza di quanto osservato nelle cellule staminali neurali o negli astrociti maturi, è stato rilevato un forte segnale di 5caC in una grande proporzione di cellule che esprimevano GFAP. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore se effettuata correttamente.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di avere tutti i reagenti e i materiali pronti insieme ai campioni. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile effettuare un'analisi mediante microscopia confocale per rispondere ad ulteriori domande sulla distribuzione nucleare delle forme modificate della citosina. Questo può contribuire a chiarire la loro potenziale funzione biologica.

Ricordare che lavorare con HCl 2 N può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso della cappa di sicurezza e dell'abbigliamento protettivo devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.