自动声胶肽受体激动剂的效价测定测定的连续稀释

该自动化方案用于肽样品的连续稀释，其总体目标是尽可能减少肽对塑料器皿的吸收，从而准确测定药物发现的效价。该方法可以提高数据的质量和重现性，并且去除基于吸头的移液还可以消除样品残留，因此错误不会在整个连续稀释过程中传播。该技术的主要优点是它通过最大限度地减少肽对塑料器皿的吸收来提高数据质量。

这对于在药物发现中推动结构-活性关系或先导化合物识别活动尤为重要。根据文本方案制备检测缓冲液并为散装分配器创建分配程序后，将分配盒管浸入检测缓冲液中并灌注液体。将 384 孔低体积检测板放在板托架上。

然后按开始。将 25 微升 100 倍肽储备液分配到声学合格的 384 孔平底聚丙烯微孔板的第 1 至第 5 列中，以指定为源板 A.将 25 微升 100 倍参比对照分配到孔 A23 和 A24 中。然后将 10 μL 检测缓冲液分配到第 11 至 15 列，将 30 μL 检测缓冲液分配到第 21 至 22 列。

接下来，将第二个声学合格的 384 孔聚丙烯微孔板（指定为源板 B）的第 6 至 10 列和第 16 至 20 列中，分配 10 微升分析缓冲液。将源板 A 和 B 以 300 次 g 离心 1 分钟。接下来，将源板和检测板加载到机器人的板式部分。

然后根据文本协议运行机器人软件，使用集成到系统中的声液分配器准备三个连续的 100 分之一的中间稀释液。首先从源板 A 的第 1 至第 5 列转移到源板 B 上的第 6 至第 10 列，制备了 100 中的第一个稀释后，允许自动化将源板 B 转移到集成离心机中，并以 300 倍 g 离心 1 分钟，然后将板放回声波流体分配器。然后，在将溶液从源板 B 转移到源板 A 进行 100 倍稀释的第二个稀释后，自动化会将源板 A 转移到离心机中并旋转，然后将板返回到液体分配器。

最后，在自动将溶液从板 A 转移到 B 中，以 100 倍稀释进行第三个稀释后，再次离心板 B。然后使用源板 A 和源板 B 中的这些肽稀释液在分析中制备全浓度响应曲线，如文本方案中所述。这一步至关重要，因为基于探针的比较方法会因肽吸收到塑料器皿中而导致样品效价急剧下降。

在 37 度水浴中快速解冻表达靶小鼠 GLP1 受体的冷冻保存的 CHO 细胞，并使用 20 毫升测定缓冲液重悬它们。将细胞悬液在 200 倍 g 和室温下离心 5 分钟。弃去上清液，使用 10 毫升测定缓冲液重悬细胞沉淀。

使用台盼蓝，将细胞原液一一稀释，并使用自动细胞计数仪确定活细胞密度。然后使用检测缓冲液以每毫升 160 万个细胞的浓度重悬细胞。使用散装试剂分液器，向含有连续稀释肽的分析板的每个孔中加入 5 μL 细胞悬液，并在室温下孵育 30 分钟。

要进行环状 AMP 检测测定，请使用裂解缓冲液制备每种均相时间分辨荧光或 HTRF 试剂的 20 分之一稀释液。使用散装试剂分配器向检测板的所有孔中加入 5 μL 加密试剂。然后将 5 μL D2 试剂添加到板的第 1 列到第 22 列中。

接下来，将 5 μL D2 试剂加入 E23 至 P24 孔中。立即使用手动移液器向 A23 至 D24 孔中加入 5 μL 裂解缓冲液，用作非特异性结合对照孔。将检测板在 200 次 g 和室温下离心 1 分钟以混合孔。

然后盖上板子并孵育 1 小时。孵育后，使用读板器在 320 纳米的激发和 620 和 665 纳米的发射下测量 Fret 信号。根据文本协议分析数据。

环状 AMP 检测分析的声学转移第一步是在两个源板上创建四个储备肽中间体稀释液，如图所示。第二步，声波分液器进一步稀释源板 A 和 B 的储备液，为每个测试肽创建一个 11 点浓度范围，对于 16 种不同的肽，一式两份。进行检测缓冲液回填以确保检测板中每孔的体积恒定。

此处显示的是一个示例板的热图，其中包含 16 个肽，在环状 AMP 积累测定中一式两份运行。紫色显示的低值表示高环状 AMP 浓度。这些浓度响应曲线说明了重复点的重现性。

样品 1 代表测定的阳性对照。样本 2、3 和 4 处于非活动状态，由图形上的平线表示。样品 5 到 16 代表活性测试肽。

这里介绍的方法允许在广泛的效力范围内生成完整的浓度响应曲线。一旦掌握，这项技术可以在三个小时内完成，但这将取决于需要制备的样品数量。在尝试此程序时，重要的是要记住肽是生物样品，应该这样处理。

为了保持其完整性，应避免重复冻融循环。这项技术将为多肽药物发现领域的研究人员铺平道路，并允许进行促进结构-活性关系所需的准确效价预测。观看本视频后，您应该对用于肽连续稀释的自动声波分样有很好的了解，这将最大限度地减少吸收造成的肽损失并提高测量的准确性。

不要忘记，使用具有皮摩尔效力的生物活性肽可能非常危险，应始终使用个人防护设备等预防措施。