基于无标签阻抗的 GPCR 检测中用于提高吞吐量的逐步加量协议

该协议能够记录从一个细胞群体中记录GPCR激动剂的完整功能集中反应关系，并提供详细的激动剂表征，即使是低细胞样本数。串行量的优势是吞吐量增加，因为单个井足以进行全浓度响应分析。该技术非常适合研究稀有和复杂的生物模型中的单转导，如封闭微流体容器中的片上器官格式。

只要有适当的设备可用，协议就不难执行。以正确的浓度准备各种 GPCR 配体解决方案是成功的关键。研究生迈克尔·斯基巴和本实验室的本科生安妮·米尔德纳将演示这个程序。

对于细胞种子化到电极阵列上，将适当浓度的细胞添加到每个电极阵列的孔中，并允许细胞在室温下均匀地沉淀到井底上10至15分钟。在37摄氏度和5%二氧化碳的标准细胞培养箱中至少36小时后，通过相对比显微镜检查细胞层，以确保每个电极与细胞完全覆盖。然后用适当体积的预热、无血清培养的培养素替换每井中的细胞培养培养。

要启动阻抗记录，请将电极阵列放入阻抗分析仪的连接阵列支架中，并确认电极与阻抗分析仪之间的适当低阻抗接触。在软件的用户界面中选择电极类型和/或多井格式。如果单频和多频数据采集模式可用，且要分析的井数较低或时间分辨率不关键，请选择多频率记录。

为确保最大时间分辨率，请选择单个监控频率。然后开始采集时间过程数据，并选择数据文件夹以用于保存数据的位置。阻抗读数将记录在每一个井的指定频率数中，为了在八井阵列的激动器模式下启动串行加法协议，向细胞中添加 30 微升，其对角剂的最低浓度。

然后让细胞在预定义的时间内响应和平衡，然后添加下一个最高浓度的30微升，直到添加激动剂的每个连续稀释。要分析数据，请减去第一次添加激动剂解之前最后一个数据点的阻抗，并设置添加零的时间以规范化阻抗值。绘制规范化阻抗的时间过程，并绘制各个时间路线，以在每次添加步骤后确定阻抗中的最大值。

用这些值组成数据表，并绘制最大阻抗变化的值作为激动剂浓度的函数。然后使用数据拟合例程使用四参数物流模型确定半最大值的有效浓度和最大响应。在这个具有代表性的实验中，每15分钟连续向细胞中添加10个组胺浓度增加的溶液，并在每个时间点测量阻抗的变化。

阻抗变化可以绘制为组胺浓度的函数和拟合在七孔实验数据点的四参数物流模型的转移函数。为了考虑可能组胺受体下调节、细胞脱敏或过度刺激，可以减少分析的数据范围，如此单序列量分试验所示。然后，三参数优化可应用于数据，为此分析提供 0.75 正负 0.12 微摩尔的半最大值有效浓度。

在第一组胺前20分钟添加组胺受体拮抗二苯胺会导致序列配药方案内阻抗延迟增加，从而需要更高的激动剂来引起细胞反应。在剂量反应关系中，对手的作用表示为曲线的右移，对应于半最大值有效浓度的增加，前提是拮抗剂是相对于对手的竞争配体。成功应用串行配分方案在技术上很容易，但需要周密的规划，因为要正确计时执行所有步骤是具有挑战性的。

串行给给为使用其他读出系统进行浓度响应研究铺平了道路，这些读出系统对并行监测的样品数量有限。串行给药的特殊优势允许研究受体调节的信号转导与全新的读数，是敏感的其他表型变化，如细胞力学。在准备受体激动剂的库存溶液时，请戴上手套和护目镜，因为它们在吸入或吞咽时可能很危险。