Name: 基于无标签阻抗的 GPCR 检测中用于提高吞吐量的逐步加量协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学习基于无标签阻抗的GPCR检测逐步加量协议，通过单孔连续给药实现完整浓度响应分析，显著提高实验通量。该方法适用于稀有细胞模型和器官芯片等复杂生物系统，为药物研发中的受体激动剂表征提供可靠技术。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Barbara Goricnick 和 Nadja Hinterreiter 在细胞培养及实验溶液制备方面的帮助。作者谨此感谢研究培训组 1910 提供的经费支持。 &#34;选择性G蛋白偶联受体配体的药物化学&#34; 由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号222125149。JAS特别感谢巴伐利亚州性别平等计划提供的奖学金。

1. 在电极阵列上接种细胞
注意：电极布局的选择需要在灵敏度和研究细胞数量之间进行权衡。电极越小，测量灵敏度越高，但可研究的细胞数量越少。对于在基础条件下随时间表现出强烈阻抗波动的细胞，建议使用较大或叉指状电极。
<ol>
	<li>预热细胞常规传代和接种所需的所有溶液 37 &#176;C 水浴。对于人U-373 MG细胞的实验，需要以下试剂：不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）、0.05%（w/v）胰蛋白酶、细胞培养基（添加5%（v/v）胎牛血清（FCS）、2 mM L-谷氨酰胺的Eagle最小必需培养基（EMEM）） 100 &#181;g/mL 青霉素/链霉素</li>
	<li>用 PBS 将常规细胞培养瓶或培养皿底部生长的储备培养物细胞层冲洗两次。</li>
	<li>移除 PBS，加入胰蛋白酶溶液（25 cm² 培养瓶加 1 mL）2）并将细胞置于 37 &#176;C 5分钟（适用于U-373 MG细胞）。</li>
	<li>通过显微镜观察，控制细胞从生长基质底部完全脱离。</li>
	<li>一旦细胞完全脱落，立即向细胞悬液中加入9 mL细胞培养基以终止胰蛋白酶反应（每1 mL胰蛋白酶加入9 mL培养基）。通过移液管将悬液反复吹打细胞培养基质底部，轻柔冲洗残留细胞。</li>
	<li>用移液器收集细胞悬液，并转移至离心管（15 mL 或 50 mL 离心管）中。</li>
	<li>通过离心以110 x g离心沉淀细胞 g 室温下孵育10分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，将细胞沉淀用培养基充分重悬，然后进行细胞计数（例如，使用血细胞计数板在相差显微镜下进行人工计数）。</li>
	<li>将细胞悬液调整至所需细胞密度。对于U-373 MG细胞的实验，使用100 000个细胞/cm²2 在48小时内形成融合的细胞层。对于生长面积约为0.8 cm²的8孔电极阵列，相当于细胞密度为200 000个细胞/mL2 以及孔体积 400 &#181;L. 
	注意：为了获得可重复的 GPCR 激活实验结果，细胞应在电极阵列上生长至形成融合的单层。为确保细胞表面有适当的受体表达，细胞接种后至少需培养 36 小时方可进行实验。通常有必要测试不同的细胞接种密度，以确定最佳实验条件。</li>
	<li>将细胞悬液加入电极阵列的孔中，于室温静置10–15分钟，以确保细胞在孔底均匀分布。</li>
	<li>培养细胞 至少 36 h，置于含5% CO₂的标准细胞培养箱中培养2 （取决于培养基类型）在 37 &#176;C 并置于湿润的培养环境中。实验前24小时更换细胞培养基。</li>
	<li>实验当天，通过（相差）显微镜检查电极阵列上的细胞层，以确保细胞完全覆盖电极。</li>
</ol>
2. 在无血清培养基中平衡细胞
<ol>
	<li>预热无血清培养基，在本研究中为 Leibovitz's L15 培养基。</li>
	<li>移除电极阵列上培养的细胞中的培养基，并替换为预热的无血清培养基。8 孔板格式的电极阵列使用 200 µL，96 孔板格式的电极阵列使用 150 µL。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 的无血清培养基中平衡至少 2 小时。平衡时间显著依赖于细胞类型。例如，U-373 MG 细胞需要 2 小时，CHO 细胞需要 4 小时，BAEC 细胞可能需要在 L-15 培养基中过夜平衡。 
	注意：L-15 培养基不依赖 CO2，需在无 CO2 的环境中使用。在 L-15 培养基中平衡时，应将培养箱设置为 0 % CO2。可通过阻抗读数监测平衡过程，建议在首次实验时进行监测。</li>
</ol>
3. 使用阻抗读数监测细胞平衡
<ol>
	<li>将电极阵列放入阻抗分析仪的连接阵列支架中。</li>
	<li>确保电极与阻抗分析仪之间形成良好的低阻抗接触。此检查因不同仪器而异。 
	注意：如果仪器无法与电极建立连接，请再次打开接触夹，重新调整电极阵列在支架内的位置，并重试。</li>
	<li>从软件用户界面中选择电极类型和/或微孔板格式。</li>
	<li>设置测量参数。有多种选项可供选择。 
	注意：为选择最敏感的交流频率，我们参考相关文献和仪器说明书，因为这取决于所研究的电极布局和细胞类型。通常，检测频率范围在 4 kHz – 50 kHz 之间。本实验中，U-373 MG 细胞培养于直径为 250 µm 的圆形工作电极上，并在 12 kHz 的交流频率下进行监测。
	<ol>
		<li>如果提供单频率和多频率数据采集模式，请选择单频率模式以确保最高的时间分辨率。测量将在该单一频率下进行。对于目前广泛使用的仪器，可在可用频率范围内选择若干预设频率。</li>
		<li>如果所研究的孔数较少或时间分辨率不关键，可选择多频率记录模式。将对每个孔在指定数量的频率下记录阻抗读数，以便后续深入分析。 
		注意：每孔记录的频率数量越多、总孔数越多，时间分辨率越低。频率和数据采集模式的选择选项因仪器类型和版本而异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始采集时间过程数据。</li>
	<li>持续监测细胞层阻抗（至少 2 小时），直至阻抗稳定。在此期间，准备激动剂溶液。</li>
	<li>当细胞层达到稳定的阻抗水平后，可选择（i）在同一次实验中继续进行系列激动剂添加，或（ii）终止数据采集，并启动新的数据集以监测激动剂诱导的受体激活。</li>
</ol>
4. 激动剂模式实验用激动剂溶液的制备
<ol>
	<li>根据公式（1），计算每步连续给药所需激动剂溶液的浓度。n 的取值范围为 1 至连续加样总步数 i。x 表示第 n 步时孔中的浓度和体积。y 表示第 n 步中“待加入溶液”的浓度和体积。</li>
</ol>
<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/60686/60686equ01.jpg" />
注意：考虑重复次数并计算总体积 &#34;待添加溶液&#34; 每个浓度步骤的结果计算示例如下所示 表1-4需要对所研究的激动剂浓度范围有一个大致的了解，因为该范围决定了在连续加样过程中需添加的浓度梯度及加样次数。采用连续激动剂添加方案时，激动剂浓度逐步增加，因此在加入下一次剂量时，必须考虑孔中已存在的激动剂含量。当 数量 孔中已存在的激动剂分子数量为 nx = cx &#8729;Vx （当前浓度为c）x 和体积 Vx）以及 数量 下一次添加后孔中分子的数量为 nx+y， 这些 数量 待添加分子的数量 ny 由浓度 c 决定y 和体积 Vy 待施加于孔中的溶液的体积（ny = cy &#8729; Vy）。加入一部分激动剂后，孔中激动剂分子的新数量为：cx+y &#8729; Vx+y = cx &#8729; Vx + cy &#8729; Vy此计算适用于后续每一步。由于孔中激动剂浓度与每步添加部分中激动剂含量相互关联，因此必须预先确定每步后的最终浓度。
模式 1：随着液体持续加入，孔中的体积将在每一步骤中逐渐增加。 
使用此模式和 8 孔板格式时，设 Vx1 = 200 µL，Vy1 …. Vyi = 30 µL。
模式 2： 井内体积保持恒定，因为每一步加入的体积在下一次添加前即被移除。 
采用此模式和 96 孔板格式时，使用 Vx1 = 150 µL 和 Vy1 …. Vyi = 75 µL。
<ol start="2">
	<li>打印包含各浓度对应总体积及移液详细操作说明的数据表。</li>
	<li>按所需用量配制所有溶液。所有激动剂溶液均应使用与细胞平衡阶段相同的无血清培养基配制。 
	警告：根据2012年美国职业安全与健康管理局《危险信息沟通标准》（29 CFR 1910.1200），盐酸组胺被视为有害物质。盐酸组胺可引起皮肤刺激、严重眼刺激，吸入后可能导致过敏性皮肤反应、过敏、哮喘症状或呼吸困难，并可能引起呼吸道刺激。请查阅安全数据表以了解详细信息。 
	注意：激动剂溶液应尽可能新鲜配制。激动剂在溶液中的稳定性可能差异较大。配制后的溶液应于4 °C或更低温度保存，直至实验使用。对于某些分子，可考虑添加额外的稳定剂（如使用基于肽或脂质的分子时加入BSA），以防止其吸附至孔板或离心管管壁。</li>
	<li>若采用96孔板格式进行实验，需先将溶液转移至常规96孔板（无电极），然后使用8通道（或12通道）移液器快速将液体转移至电极阵列板中。</li>
</ol>
5. 拮抗模式实验中激动剂溶液的制备
注意：配制拮抗剂溶液时，应使用实验全程所需的浓度。拮抗剂溶液的体积和浓度取决于激动剂添加方式（1 或 2）。在添加方式 2 下，8 孔板或 96 孔板实验的示例如下：（A）8 孔板格式（Vx1 = 200 µL，VAntagonist = 200 µL）；（B）96 孔板格式（Vx1 = 150 µL，VAntagonist = 75 µL）。
<ol>
	<li>根据步骤 4.1 所述，计算系列剂量每一步所需的每种激动剂溶液浓度。</li>
	<li>使用与细胞平衡时相同的无血清培养基配制所有激动剂溶液，并加入拮抗剂，使其终浓度与实验中各孔计划使用的浓度一致。 
	注意：本实验中，组胺储备液（10 mM）用 L-15 培养基配制。当激动剂溶解于其他溶剂（如二甲基亚砜（DMSO）、乙醇）时，应设置溶剂对照，以校正每次加样过程中溶剂浓度递增所带来的影响。</li>
</ol>
6. 在激动剂模式下执行序列加样方案
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 – 3.5 所述开始数据采集。</li>
	<li>使用前将激动剂溶液预先温育，将其放入培养箱中约 10 – 15 分钟后再加入。 
	注意：当使用热不稳定的物质时，溶液在 37 °C 下不宜保存过长时间。如果预温 10 – 15 分钟被认为可能影响活性，可在加样前将溶液短暂置于水浴中升温至 37 °C。</li>
	<li>根据所选加样模式进行激动剂的系列浓度给药。采用模式 1时，每加入下一个剂量，孔中的总体积随之增加。在模式 2中，每次加入一定体积后，在加入下一个更高剂量前，会先移除等量的液体。 
	注意：两次连续激动剂剂量之间细胞层达到平衡所需的时间取决于细胞的响应速度。通过平行模式（一个孔对应一个浓度）的初步实验可确定：(i) 不同激动剂浓度下细胞的响应时间；(ii) 最敏感的曲线参数（如阻抗最大值、给药后时间 x 的阻抗值）。</li>
</ol>
A：模式1 / 8孔板格式
<ol>
	<li>向已用 200 µL 无血清培养基平衡的细胞中加入 30 µL 浓度最低的激动剂第一溶液。</li>
	<li>让细胞在预定义的时间段内（例如 15 分钟）响应并重新平衡。</li>
	<li>加入 30 µL 下一个较高浓度的第二溶液。</li>
	<li>依次对第三、第四直至后续浓度的激动剂溶液重复步骤 6.3.1–6.3.3。 
	注意：若使用 10 个浓度梯度，实验结束时总体积将达到 500 µL，略低于此类孔板约 550 µL 的最大适用体积。</li>
</ol>
B：模式2 / 96孔板格式
注意：在96孔板体系中进行实验时，每次液体操作步骤（添加/移除）期间，需通过阻抗仪器的软件暂停数据采集。复杂的液体操作可能会干扰数据采集。请使用多通道移液器。
<ol>
	<li>暂停数据采集。</li>
	<li>向已用 150 µL 无血清培养基平衡的细胞中加入 75 µL 浓度最低的激动剂第一种溶液。</li>
	<li>恢复数据采集。</li>
	<li>让细胞在预定义的时间段内（例如 15 分钟）响应并重新平衡。</li>
	<li>在常规平衡时间结束前约 1–2 分钟，暂停测量，并从每个孔中移除 75 µL 溶液。 
	注意：移除溶液的时间点取决于同时监测的孔数和移液速度。移除溶液所需时间不应超过后续步骤之间的时间间隔。</li>
	<li>加入 75 µL 下一个较高浓度的第二种溶液，并恢复测量。</li>
	<li>依次对第三、第四及后续浓度的激动剂溶液重复步骤 6.3.8–6.3.10。</li>
</ol>
7. 拮抗模式下进行序列加样操作
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 – 3.5 所述开始测量。</li>
	<li>在细胞层平衡期间，配制拮抗剂溶液（例如，将 200 µL 的 1.5 µM 盐酸苯海拉明溶于 L15 培养基中）。 
	注意：盐酸苯海拉明可能对健康造成急性危害。吞食或吸入有害，可能引起眼睛和皮肤刺激，也可能导致呼吸道和消化道刺激。请参考安全数据表。</li>
	<li>在向细胞培养物中添加前约 10 – 15 分钟，将拮抗剂和激动剂溶液放入培养箱中预热（参见 6.2）。若检测中包含无拮抗剂的孔，也需将无血清培养基预热。</li>
	<li>将拮抗剂溶液加入指定孔中，使细胞与拮抗剂平衡 15 – 20 分钟。若包含无拮抗剂的孔，则向这些孔中加入等体积的无血清培养基。</li>
	<li>根据模式 2的拮抗剂添加方式，从孔中移除溶液： 
	(A) 8 孔板格式（200 µL） 
	(B) 96 孔板格式（75 µL）</li>
	<li>按照步骤 6.3 所述运行激动剂添加程序。</li>
</ol>
8. 数据导出与分析
<ol>
	<li>使用阻抗仪器的配套软件导出数据，将所有记录的数据从专有格式转换为通用数据格式（例如，csv）。此步骤可实现利用其他软件包对数据进行重新整理和呈现。</li>
	<li>将 csv 格式的数据载入科学数据分析软件。</li>
	<li>通过减去刺激前最后一个数据点的阻抗值来归一化阻抗数据 首先 加入激动剂溶液，并将加药时间设为 t = 0，绘制归一化阻抗随时间的变化曲线。</li>
	<li>绘制各时间过程曲线，并确定每次添加步骤后阻抗的最大值。将这些数值整理成数据表。</li>
	<li>将最大（或最小，如适用）阻抗变化值作为激动剂浓度的函数进行绘图。该分析可针对单个孔进行，也可针对平均值（均值）进行 &#177; SD</li>
	<li>使用数据拟合程序确定半数最大有效浓度（EC50) 和最大反应（EMax）使用四参数逻辑模型（方程2）：</li>
</ol>
<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/60686/60686equ02.jpg" />
注意：c 表示激动剂浓度，A1 为S形剂量-反应曲线的最小渐近值，A2 为最大渐近值（A2 = EMax）。EC50 是曲线上拐点处的浓度，n 对应Hill斜率。

<ol><li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li>
<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs%3A+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li>
<li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+drug+development+process%3A+The+new+face+of+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacoly+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6(2010).</li>
<li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li>
<li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+GPCR+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li>
<li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+whole-cell+assays%3A+expanding+the+scope+of+GPCR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li>
<li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16(2006).</li>
<li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function%3A+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li>
<li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+versus+conventional+cellular+assays%3A+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li>
<li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种无标记阻抗检测方法，用于确定激动剂诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）激活在有或无特异性拮抗剂存在情况下的剂量-反应关系。该方法的概念验证已在近期发表的研究中得到证实12。据我们所知，这是首次报道利用单层体外细胞建立激动剂介导的GPCR激活完整剂量-反应曲线的研究。该方法必然需要采用无标记的细胞监测技术，因此不适用于终点检测实验。
本方案以U-373 MG细胞为例进行了演示，该细胞内源性表达人组胺1受体（hHR1），通过一系列浓度递增的内源性激动剂组胺进行刺激，同时连续记录细胞的阻抗变化。为验证该方案在拮抗剂研究中的适用性，实验在存在恒定浓度的苯海拉明（一种hH1R的竞争性拮抗剂）条件下重复进行。此外，阻抗记录技术已成功用于研究其他H1R激动剂（如UR-KUM53011，单次及逐步给药）和拮抗剂（如美吡拉明）12，除本文所示示例外。同时，该方案也已应用于其他细胞系和受体，例如表达多巴胺D2受体（D2R）的CHO-D2R细胞或表达...

本报告详细描述了一种序列加样方案，该方案通过无标记阻抗检测技术，用于定量测定贴壁生长细胞中配体诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）活化。G蛋白偶联受体（GPCRs）参与多种生理功能及人类疾病1。由于其在细胞表面易于接触且功能重要，GPCRs成为最重要的药物靶点之一。这一评估体现在目前约有700种获批药物以GPCRs为靶点，占所有上市药物的约35%2。
新药研发包含两个核心过程：（i）生物靶点分子的鉴定与功能表征，以及（ii）新型先导化合物的发现及其向可给药药物的开发。在这两个过程中，均需要高效的方法来定量评估药物与靶点之间的相互作用及其引发的后续生物学下游反应。临床前药物研发的不同阶段采用不同的分析方法，范围从药物与靶点之间的生物分子相互作用研究，到细胞培养的功能研究，再到离体器官组织或整体动物的实验。从前者到后者，其生理意义和生物学复杂性逐步增加3。尽管总体目标是尽量减少动物实验，但使用实验动物的离体器官甚至整体动物进行药理学研究仍被视为全面表征新药候选物所不可或缺的手段。在分析检测方面，器官药理学研究提供了具有最高生理相关性的远端、整合性&#34;整体性&#34;功能反应。此类实验的一个缺点是，出于技术和伦理原因，无法适用于高通量筛选，因此在很大程度上已被基于体外细胞培养的研究所取代4。
用于量化细胞培养中 GPCR 激活的方法包括多种基于标记的化学检测法，可特异性检测第二信使、下游信号蛋白的磷酸化状态、特定转录因子介导的转录激活或配体诱导的受体内吞转运4,5此类基于标记的检测方法的一个缺点是需要使用可能有害的染料或放射性标记物对细胞进行标记，这通常要求将检测设定为在特定暴露时间后的终点测定。 先验的使用基于标记的终点检测方法存在实验时间点选择极为有限且存在偏倚的问题，同时化学标记物和探针可能干扰细胞的正常生理活动，而这种干扰可能未被实验者察觉。
近年来，出现了用于监测 GPCR 激活的无标记检测方法，例如基于阻抗的技术或应用共振波导光栅的光学方法5,6。这些方法在实验上无需对细胞进行标记。由于此类物理检测信号幅度较低，因此被认为是非侵入性的，可实现对细胞的连续监测，甚至可能实现实时监测，且观察时间仅受限于细胞培养状态，而不受检测手段本身的限制。与来自完整器官的检测类似，无标记方法通常报告的是受体激活后信号通路下游的整体性细胞响应，此时信号网络的整体整合导致细胞形态或质量重新分布发生随时间变化但特异性较低的改变。阻抗检测技术测量的是细胞形态变化引起的介电特性信号7,8，而基于共振波导光栅的检测则对细胞-基质界面处由动态质量再分布（DMR）引起的折射率变化具有敏感性9。这种整合性特征使得无标记方法对受体介导的事件极为敏感，无论信号级联中涉及何种类型的 G 蛋白（Gq、Gi/0、Gs、G12/13）或 β-抑制蛋白6，且适用于受体的内源性表达水平。
在标准的无标记阻抗检测实验中，细胞被接种于多孔板中，并在每孔底部带有共面金膜电极的表面上贴壁生长10。这些电极阵列连接至阻抗分析仪，通过时间分辨的阻抗读数，记录细胞对实验刺激的反应。在典型的G蛋白偶联受体（GPCR）检测中，将配体以各自不同的浓度分别加入各个孔中。随后，通过分析阻抗随时间变化曲线的特征参数，如最大信号变化、曲线下面积、特定时间区间内的信号变化或指定时间点的曲线斜率，来量化配体的效价和效能11。
电极阵列的成本可能会限制该技术在高通量筛选（HTS）项目中的应用。此外，随着需要并行监测的样品数量增加，独立测量的次数也随之增多，从而逐渐降低每个孔的可用时间分辨率——即使对于最先进的多通道记录系统也是如此。在这种条件下，快速且短暂的细胞反应可能无法被检测到。另外，传统的一孔一浓度方法在灌注式器官芯片或类器官芯片用于配体-GPCR相互作用分析时，显著增加了时间和成本负担。
基于此，我们开发了一种逐步加药方案，可在培养的细胞单层中通过持续监测单个孔的阻抗，同时逐步增加激动剂浓度，从而记录配体诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）活化的完整剂量-反应曲线。序列激动剂添加方案显著提高了每个孔的通量，从单一浓度提升至10个或更多浓度，如本研究中以人U-373 MG细胞为例所示，该细胞内源性表达组胺1受体（H1R）。因此，该方法有望在保持仪器最高时间分辨率的同时，显著提升无标记剂量-反应研究的通量。

<table><tbody><tr><td>B&amp;uuml;血细胞计数板</td><td>马里恩费尔德（劳达-科&amp;ouml;尼格斯霍芬，德国</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>25 cm 细胞培养瓶&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Greiner bio-one（德国弗里克海姆）</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱（Heraeus Function Line BB15）</td><td>赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特）</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>离心机（Heraeus 1S-R）</td><td>赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特）</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>盐酸苯海拉明</td><td>Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）</td><td>D3630</td><td></td></tr><tr><td>含4.5 g/L D-葡萄糖和2.2 g/L NaHCO₃的Eagle最小必需培养基&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>阻抗仪（ECIS Z&amp;theta;)</td><td>应用生物物理学公司（美国纽约州特洛伊）</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>8通道电极阵列（8W1E PET）</td><td>应用生物物理学公司（美国纽约州特洛伊）</td><td>\</td><td>PET 基材，厚度 0.049 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 工作电极和约50 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 对电极（金）</td></tr><tr><td>96孔电极阵列（96W1E+ PET）</td><td>应用生物物理学公司（美国纽约州特洛伊）</td><td>\</td><td>带两个电极（金）的PET基底，电极间距为0.256 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 总电极面积</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Biochrom（德国柏林）</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>盐酸组胺</td><td>卡尔·罗特（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>4017.1</td><td></td></tr><tr><td>层流罩（Herasafe，KS 12）</td><td>赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特）</td><td>51022515</td><td>II级生物安全柜</td></tr><tr><td>Leibovitz' L-15 培养基</td><td>赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特）</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>大号微量移液器（100 - 1000 &amp;micro;L</td><td>Brandt（德国韦尔泰姆）</td><td>704780</td><td></td></tr><tr><td>大号微量移液器（20 - 200 &amp;micro;L)</td><td>Brandt（德国韦尔泰姆）</td><td>704778</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（相差，Nikon Diaphot）</td><td>尼康（D&amp;uuml;德国杜塞尔多夫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>移液管，血清学</td><td>Greiner bio-one（德国弗里克豪森）</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>移液器（accu-jet pro）</td><td>Brandt（德国韦尔泰姆）</td><td>26300</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）</td><td>T4174</td><td>在含1 mM EDTA的PBS中</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>德国弗里克豪森 Greiner bio-one 公司</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner bio-one（德国弗里克豪森）</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>U-373 MG 细胞</td><td>ATCC（美国马里兰州罗克维尔）</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅（TW21）</td><td>Julabo（德国席尔巴赫）</td><td>\</td><td></td></tr></tbody></table>

无标记阻抗法g蛋白偶联受体检测中提高通量的逐步给药方案

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

无标记阻抗检测方法正越来越多地用于在细胞培养实验中非侵入性地研究配体诱导的 G 蛋白偶联受体（GPCR）活化。该方法可实现对细胞的实时监测，设备依赖的时间分辨率可达数十毫秒，并具有高度自动化的特点。然而，当样本数量较大时（例如针对多种不同配体的剂量-反应研究），一次性电极阵列的成本以及逐孔顺序记录时可获得的时间分辨率可能成为限制因素。因此，本文提出一种连续激动剂添加方案，有望显著提高无标记 GPCR 检测的产出效率。采用连续激动剂添加方案，可在持续监测样本阻抗的同时，将 GPCR 激动剂以递增浓度依次加入同一细胞层中（激动剂模式）。通过这种连续方法，现在仅需一个细胞层即可建立完整的 GPCR 激动剂剂量-反应曲线。该连续激动剂添加方案适用于不同类型的 GPCR 耦合方式，包括 Gq、Gi/0 和 Gs，并可兼容受体在重组表达或内源性表达水平下的检测。同时，也可评估 GPCR 拮抗剂对受体的阻断作用（拮抗剂模式）。

使用组胺作为激动剂，在8孔电极阵列上进行实验时，各种激动剂溶液的典型配制方案见表1-4。表1和表2列出了采用加样模式1（参见图1）的实验所需的体积和浓度，而表3和表4则列出了采用加样模式2（参见图1）的实验所需的体积和浓度。数据由公式(1)计算得出。
一个代表性实验如图所示 图2 对于在8孔电极阵列上培养的U-373 MG细胞融合层，该细胞内源性表达组胺1受体，其工作电极为 250 &#181;m 使用组胺作为激动剂测定血管直径。测量在12 kHz的单一频率下进行。激动剂浓度梯度的添加按以下步骤进行 模式1在选定的实验中，依次每15分钟加...

本方案展示了利用无标记阻抗检测技术，从生长在单个微电极上的单层细胞中实时记录激动剂诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）激活全过程剂量-反应关系的方法。新的加样方案在不损失时间分辨率的前提下显著提高了通量。

无标记阻抗法G蛋白偶联受体检测中提高通量的逐步给药方案

基于阻抗的无标记检测方法正越来越多地被用于在细胞培养实验中以非侵入性方式研究配体诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）活化。该方法……

该方案能够从一个细胞群体中记录G蛋白偶联受体（GPCR）激动剂完整的功能性浓度-反应关系，即使在细胞样本量较少的情况下也能实现激动剂的详细表征。连续给药的主要优势在于通量的提升，因为单个孔即可满足完整的浓度-反应分析需求。该技术特别适用于研究稀有且复杂的生物模型中的单一信号转导过程，例如封闭式微流控容器中的类器官芯片模型。只要具备适当的设备，该实验方案并不难实施。成功的关键在于配制出正确浓度的各种G蛋白偶联受体（GPCR）配体溶液。我们实验室的研究生Michael Skiba和本科生Anne Mildner将演示该操作流程。将细胞接种到电极阵列上时，向每个电极阵列的孔中加入适当浓度的细胞，并在室温下静置10至15分钟，使细胞均匀沉降到孔底。在37摄氏度、5%二氧化碳的标准细胞培养箱中培养至少36小时后，通过相差显微镜检查细胞层，确保每个电极表面均被细胞完全覆盖。随后，将每孔中的细胞培养基更换为适量预热的无血清培养基。开始阻抗记录时，将电极阵列插入阻抗分析仪的连接阵列支架中，并确认电极与阻抗分析仪之间形成良好的低阻抗接触。在软件用户界面中选择电极类型和/或微孔板格式。如果系统支持单频和多频数据采集模式，且待分析的孔数较少或时间分辨率要求不高时，应选择多频记录模式。为了确保最高的时间分辨率，选择单一的监测频率。然后开始采集时间过程数据，并选择用于保存数据的数据文件夹。每个孔的阻抗读数将在指定数量的频率下被记录。要在八孔阵列中以激动剂模式启动连续加样程序，需向细胞中加入30微升所需激动剂的最低浓度溶液。然后让细胞在预定时间内响应并达到平衡，之后加入30微升下一个更高浓度的激动剂溶液，直至所有激动剂的系列稀释浓度均已被添加。为分析数据，需减去激动剂溶液首次加入前最后一个数据点的阻抗值，并将加入时刻设为零，以归一化阻抗值。绘制归一化阻抗随时间变化的曲线，并绘制各单独的时间过程曲线，以识别每次加样后阻抗的最大值。根据这些数值编制数据表，并绘制最大阻抗变化值随激动剂浓度变化的曲线图。然后使用数据拟合程序，通过四参数逻辑模型确定半数最大有效浓度和最大反应值。在此代表性实验中，每15分钟依次向细胞中加入1种浓度递增的组胺溶液，共加入10种溶液，并在每个时间点测量阻抗的变化。随后可将阻抗变化值对组胺浓度作图，并将四参数逻辑模型的传递函数拟合至来自七个孔的实验数据点。为考虑组胺受体可能发生的下调、细胞脱敏或过度刺激，可缩小用于分析的数据范围，如本单次序贯给药实验所示。随后可对数据进行三参数优化，得到本次分析的半数有效浓度为 0.75 ± 0.12 微摩尔。在首次加入组胺前20分钟添加组胺受体拮抗剂苯海拉明，会导致在连续给药方案中阻抗的升高出现延迟，这表明需要更高浓度的激动剂才能引发细胞反应。在剂量-反应关系中，若拮抗剂相对于激动剂为竞争性配体，则其效应表现为曲线向右移动，对应于半最大有效浓度的增加。连续给药方案在技术上易于实施，但需要周密的规划，因为要准确把握所有步骤的时间节点具有挑战性。序贯给药为利用其他检测系统进行浓度-反应研究开辟了道路，尤其适用于那些在平行监测样本数量上受限的系统。序贯给药的独特优势使得研究人员能够采用全新的检测方法来研究受体介导的信号转导过程，这些新方法可敏感地检测其他表型变化，例如细胞力学特性。在配制受体激动剂的储备液时，请佩戴手套和护目镜，因为这些物质若被吸入或吞咽可能具有危害性。

stepwise-dosing-protocol-for-increased-throughput-label-free

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

基于无标签阻抗的 GPCR 检测中用于提高吞吐量的逐步加量协议

本文介绍了一种优化的多重逆转录定量PCR（qRT-PCR）方案，结合微流控平台，作为检测microRNA（miRNA）表达水平的高通量筛选工具，具有成本低、耗时短的优点，尤其适用于样本量有限的情况。...

高通量 microRNA 表达谱分析：在 Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs 上进行纳升级优化多重 qRT-PCR

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。...

药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’...

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

在传统的基于移液头的连续稀释过程中，多肽吸附到塑料器皿上会显著影响活性测定结果，并干扰对药物发现过程中先导化合物筛选和优化阶段所依赖的构效关系的理解。本文描述了多肽样品自动化声学非接触式连续稀释的方法。...

用于肽类激动剂效价测定实验中系列稀释的自动化声波移液技术

本文介绍了使用四种常用生物传感器平台测定抗体-抗原结合亲和力和动力学的实验方案。...

利用四种生物传感器平台测定高亲和力抗体-抗原结合动力学

所述细胞检测旨在鉴定能够抑制或刺激CXC趋化因子受体4（CXCR4）相互作用的试剂，这些试剂可通过竞争性或变构方式抑制或激活由CXCR4激活引发的细胞内Ca2+...

一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。...

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。...

使用PRESTO-Tango检测技术在全GPCR范围内并行检测β-阻遏蛋白2招募以进行配体筛选

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

学习基于无标签阻抗的GPCR检测逐步加量协议，通过单孔连续给药实现完整浓度响应分析，显著提高实验通量。该方法适用于稀有细胞模型和器官芯片等复杂生物系统，为药物研发中的受体激动剂表征提供可靠技术。

无标记阻抗法G蛋白偶联受体检测中提高通量的逐步给药方案

探索更多视频