无标记阻抗法G蛋白偶联受体检测中提高通量的逐步给药方案

该方案能够从一个细胞群体中记录G蛋白偶联受体（GPCR）激动剂完整的功能性浓度-反应关系，即使在细胞样本量较少的情况下也能实现激动剂的详细表征。连续给药的主要优势在于通量的提升，因为单个孔即可满足完整的浓度-反应分析需求。该技术特别适用于研究稀有且复杂的生物模型中的单一信号转导过程，例如封闭式微流控容器中的类器官芯片模型。

只要具备适当的设备，该实验方案并不难实施。成功的关键在于配制出正确浓度的各种G蛋白偶联受体（GPCR）配体溶液。我们实验室的研究生Michael Skiba和本科生Anne Mildner将演示该操作流程。

将细胞接种到电极阵列上时，向每个电极阵列的孔中加入适当浓度的细胞，并在室温下静置10至15分钟，使细胞均匀沉降到孔底。在37摄氏度、5%二氧化碳的标准细胞培养箱中培养至少36小时后，通过相差显微镜检查细胞层，确保每个电极表面均被细胞完全覆盖。随后，将每孔中的细胞培养基更换为适量预热的无血清培养基。

开始阻抗记录时，将电极阵列插入阻抗分析仪的连接阵列支架中，并确认电极与阻抗分析仪之间形成良好的低阻抗接触。在软件用户界面中选择电极类型和/或微孔板格式。如果系统支持单频和多频数据采集模式，且待分析的孔数较少或时间分辨率要求不高时，应选择多频记录模式。

为了确保最高的时间分辨率，选择单一的监测频率。然后开始采集时间过程数据，并选择用于保存数据的数据文件夹。每个孔的阻抗读数将在指定数量的频率下被记录。要在八孔阵列中以激动剂模式启动连续加样程序，需向细胞中加入30微升所需激动剂的最低浓度溶液。

然后让细胞在预定时间内响应并达到平衡，之后加入30微升下一个更高浓度的激动剂溶液，直至所有激动剂的系列稀释浓度均已被添加。为分析数据，需减去激动剂溶液首次加入前最后一个数据点的阻抗值，并将加入时刻设为零，以归一化阻抗值。绘制归一化阻抗随时间变化的曲线，并绘制各单独的时间过程曲线，以识别每次加样后阻抗的最大值。

根据这些数值编制数据表，并绘制最大阻抗变化值随激动剂浓度变化的曲线图。然后使用数据拟合程序，通过四参数逻辑模型确定半数最大有效浓度和最大反应值。在此代表性实验中，每15分钟依次向细胞中加入1种浓度递增的组胺溶液，共加入10种溶液，并在每个时间点测量阻抗的变化。

随后可将阻抗变化值对组胺浓度作图，并将四参数逻辑模型的传递函数拟合至来自七个孔的实验数据点。为考虑组胺受体可能发生的下调、细胞脱敏或过度刺激，可缩小用于分析的数据范围，如本单次序贯给药实验所示。随后可对数据进行三参数优化，得到本次分析的半数有效浓度为 0.75 ± 0.12 微摩尔。

在首次加入组胺前20分钟添加组胺受体拮抗剂苯海拉明，会导致在连续给药方案中阻抗的升高出现延迟，这表明需要更高浓度的激动剂才能引发细胞反应。在剂量-反应关系中，若拮抗剂相对于激动剂为竞争性配体，则其效应表现为曲线向右移动，对应于半最大有效浓度的增加。连续给药方案在技术上易于实施，但需要周密的规划，因为要准确把握所有步骤的时间节点具有挑战性。

序贯给药为利用其他检测系统进行浓度-反应研究开辟了道路，尤其适用于那些在平行监测样本数量上受限的系统。序贯给药的独特优势使得研究人员能够采用全新的检测方法来研究受体介导的信号转导过程，这些新方法可敏感地检测其他表型变化，例如细胞力学特性。在配制受体激动剂的储备液时，请佩戴手套和护目镜，因为这些物质若被吸入或吞咽可能具有危害性。