基于无标签阻抗的 GPCR 检测中用于提高吞吐量的逐步加量协议
February 21st, 2020
该协议演示了使用无标签阻抗测量从单个微电极上生长的单个细胞层的激动剂诱导GPCR活化的全剂量-反应关系的实时记录。新的配量方案显著提高了吞吐量，而不会损失时间分辨率。
该协议能够记录从一个细胞群体中记录GPCR激动剂的完整功能集中反应关系，并提供详细的激动剂表征，即使是低细胞样本数。串行量的优势是吞吐量增加，因为单个井足以进行全浓度响应分析。该技术非常适合研究稀有和复杂的生物模型中的单转导，如封闭微流体容器中的片上器官格式。
只要有适当的设备可用，协议就不难执行。以正确的浓度准备各种 GPCR 配体解决方案是成功的关键。研究生迈克尔·斯基巴和本实验室的本科生安妮·米尔德纳将演示这个程序。
对于细胞种子化到电极阵列上，将适当浓度的细胞添加到每个电极阵列的孔中，并允许细胞在室温下均匀地沉淀到井底上10至15分钟。在37摄氏度和5%二氧化碳的标准细胞培养箱中至少36小时后，通过相对比显微镜检查细胞层，以确保每个电极与细胞完全覆盖。然后用适当体积的预热、无血清培养的培养素替换每井中的细胞培养培养。
要启动阻抗记录，请将电极阵列放入阻抗分析仪的连接阵列支架中，并确认电极与阻抗分析仪之间的适当低阻抗接触。在软件的用户界面中选择电极类型和/或多井格式。如果单频和多频数据采集模式可用，且要分析的井数较低或时间分辨率不关键，请选择多频率记录。
为确保最大时间分辨率，请选择单个监控频率。然后开始采集时间过程数据，并选择数据文件夹以用于保存数据的位置。阻抗读数将记录在每一个井的指定频率数中，为了在八井阵列的激动器模式下启动串行加法协议，向细胞中添加 30 微升，其对角剂的最低浓度。
然后让细胞在预定义的时间内响应和平衡，然后添加下一个最高浓度的30微升，直到添加激动剂的每个连续稀释。要分析数据，请减去第一次添加激动剂解之前最后一个数据点的阻抗，并设置添加零的时间以规范化阻抗值。绘制规范化阻抗的时间过程，并绘制各个时间路线，以在每次添加步骤后确定阻抗中的最大值。
用这些值组成数据表，并绘制最大阻抗变化的值作为激动剂浓度的函数。然后使用数据拟合例程使用四参数物流模型确定半最大值的有效浓度和最大响应。在这个具有代表性的实验中，每15分钟连续向细胞中添加10个组胺浓度增加的溶液，并在每个时间点测量阻抗的变化。
阻抗变化可以绘制为组胺浓度的函数和拟合在七孔实验数据点的四参数物流模型的转移函数。为了考虑可能组胺受体下调节、细胞脱敏或过度刺激，可以减少分析的数据范围，如此单序列量分试验所示。然后，三参数优化可应用于数据，为此分析提供 0.75 正负 0.12 微摩尔的半最大值有效浓度。
在第一组胺前20分钟添加组胺受体拮抗二苯胺会导致序列配药方案内阻抗延迟增加，从而需要更高的激动剂来引起细胞反应。在剂量反应关系中，对手的作用表示为曲线的右移，对应于半最大值有效浓度的增加，前提是拮抗剂是相对于对手的竞争配体。成功应用串行配分方案在技术上很容易，但需要周密的规划，因为要正确计时执行所有步骤是具有挑战性的。
串行给给为使用其他读出系统进行浓度响应研究铺平了道路，这些读出系统对并行监测的样品数量有限。串行给药的特殊优势允许研究受体调节的信号转导与全新的读数，是敏感的其他表型变化，如细胞力学。在准备受体激动剂的库存溶液时，请戴上手套和护目镜，因为它们在吸入或吞咽时可能很危险。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
该协议使用标签免疫阻抗测量，能够记录来自一个细胞群体的GPCR激动剂的完整功能浓度反应关系。串联给药的主要优势是提高了通量，因为一个孔就足以进行完整的浓度反应分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 药理学
- 细胞生物学
背景
- GPCR在细胞信号传导中起着关键作用。
- 理解激动剂诱导的激活对药物开发至关重要。
- 传统方法可能需要更大的细胞样本。
- 该协议适用于罕见和复杂的生物模型。
研究目的
- 展示GPCR激活的实时记录。
- 提供详细的激动剂特征。
- 提高浓度反应分析的通量。
使用的方法
- 标签免疫阻抗测量。
- GPCR配体的串联给药。
- 单微电极设置。
- 在适当浓度下配制配体溶液。
主要结果
- 成功记录了完整的剂量-反应关系。
- 在不损失时间分辨率的情况下提高了通量。
- 在低细胞样本数量下证明了可行性。
- 适用于微流控容器中的器官芯片格式。
结论
- 该协议增强了复杂模型中GPCR的研究。
- 它为激动剂特征提供了可靠的方法。
- 未来应用可能包括各种生物学研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Label-free impedance-based GPCR assays face throughput limitations in dose-response studies due to electrode array costs and sequential well recording constraints. The serial agonist addition protocol enables full concentration response curves from a single cell layer, significantly increasing assay output while maintaining real-time monitoring. This approach supports predictive confidence in target validation by reducing biological sample requirements and enhancing data efficiency in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through full dose-response characterization from minimal cell samples.
- Operational Value: Reduces reagent and electrode array consumption by consolidating multi-point assays into single-well formats.
- Predictive Confidence: Supports lead identification by providing quantitative EC50 and efficacy measurements from serial agonist additions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, time-resolved impedance readouts for agonist and antagonist mode profiling.
- Operational Value: Compatible with automated liquid handling for serial dilution preparation in microtiter plate formats.
- Assay Standardization: Enables consistent baseline normalization and maxima detection across sequential dosing steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to recombinant and endogenous GPCR expression levels in physiologically relevant models.
- Translational Biomarker: Supports mechanistic de-risking by correlating impedance changes with receptor activation states.
- Preclinical Model Continuity: Facilitates screening readiness in organ-on-chip and microfluidic systems with limited sample availability.
Pipeline & Workflow Integration
The serial dosing method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, particularly where sample conservation and assay throughput are critical.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via real-time monitoring of GPCR activation kinetics.
- Screening: Enables high-content agonist profiling with reduced well consumption, improving plate utilization efficiency.
- Analytics: Provides quantitative impedance maxima as dependent variables for four-parameter logistic modeling of dose-response relationships.
- Translational Research: Connects to preclinical advancement by generating reliable agonist potency data from low-cell-number systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable impedance-based platform for serial ligand addition across multiple GPCR targets and coupling types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through comprehensive agonist characterization from single populations.
- Operational Value: Enhances throughput and cost-efficiency by minimizing disposable electrode array usage per dose-response curve.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid SAR exploration with limited biological material.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reproducible EC50 determination in early-stage screening campaigns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in preparing precise serial dilutions of GPCR ligands at working concentrations.
- Dependent on impedance analyzer compatibility with single-well temporal recording and baseline subtraction capabilities.
- Necessitates standardized timing intervals between agonist additions to ensure equilibration and response stability.
- Involves optimization of addition volume and frequency to prevent fluidic disturbance or receptor overstimulation.
- Includes considerations for antagonist pre-incubation protocols to assess competitive binding and rightward shift in dose-response curves.
