Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

Das übergeordnete Ziel der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ist es, die Adhäsionskraft und die Art der Wechselwirkungen zwischen Aminosäuren oder Peptiden mit unterschiedlichen Oberflächen zu bestimmen. Diese Frage kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Oberflächenchemie zu beantworten und für die Entwicklung neuer Komposite und Chordatiere verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Informationen über die Wechselwirkung zwischen dem gewünschten Molekül und den Oberflächen auf Einzelmolekülebene liefert.

Kaufen Sie zunächst Siliziumnitrid-AFM-Ausleger, die mit Siliziumspitzen mit einem nominalen Cantilever-Radius von zwei Nanometern ausgestattet sind. Montieren Sie die Spitze an der Halterung. Reinigen Sie jeden der AFM-Ausleger, indem Sie sie 20 Minuten lang in Ethanol tauchen und dann bei Raumtemperatur trocknen.

Legen Sie dann die Spitzen in eine Plasmakammer und behandeln Sie die Ausleger, indem Sie sie fünf Minuten lang Sauerstoffplasma aussetzen. Bereiten Sie eine Lösung her, die 15 Teile Methyltriethoxysilan und einen Teil drei Aminopropyltriethoxysilan enthält, und hängen Sie die Canithebel drei Zentimeter über der Lösung, während Sie sich in einer inerten Atmosphäre befinden. Es ist wichtig, dass die Spitzen und die Halterung das Silangemisch nicht berühren.

Darüber hinaus ist das Silan sehr feuchtigkeitsempfindlich, so dass diese Spitzen in einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden müssen. Nach dem Versiegeln schließen Sie den Exsikkator an eine Vakuumpumpe an und legen Sie zwei Stunden lang ein Vakuum an, um eine Monoschicht aus den beiden Arten von gemischten Silanverbindungen auf der Oberfläche der Ausleger zu bilden. Entfernen Sie vorsichtig die Spitzen und legen Sie sie auf eine auf 70 Grad Celsius vorgeheizte Platte.

Lassen Sie die Spitzen 10 Minuten trocknen. Kühlen Sie die Spitzen bei Raumtemperatur ab, bevor Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in eine Lösung aus Fmoc-PEG-NHS tauchen. Tauchen Sie dann die Spitzen fünf Minuten lang in Chloroform und dann weitere fünf Minuten in DMF.

Nach der Inkubation in DMF die Femoc-Gruppen der angehängten PEG-Moleküle entschützen, indem die Spitzen 30 Minuten lang in 20%ige Piperidinlösung in DMF getaucht werden. Tauchen Sie die Spitzen erneut vier Minuten lang in DMF und dann weitere vier Minuten in N-Methyl-2-pyrrolidon. Um Aminosäuren an die Spitzen zu koppeln, tauchen Sie diese eineinhalb Stunden lang in eine Aminosäure-Kopplungslösung mit einer Gesamtkonzentration von 30 Millimolaren und fünf Millilitern N-Methyl-2-pyrrolidon.

Um die verbleibenden freien oder nicht reaktanten PEG-Rückstände durch die Acetylgruppe zu schützen, tauchen Sie die Spitzen 30 Minuten lang in eine 0,65 molare Mischung aus vier Teilen Essigsäureanhydrid und einem Teil Diisopropylethylamin und N-Methyl-2-pyrrolidon. Tauchen Sie dann die mit Peptid-Aminosäure funktionalisierten Spitzen nacheinander jeweils vier Minuten lang in NMP, Chloroform, 50%Ethanol und Wasser, bevor Sie die Spitze schließlich an der Luft trocknen. Befestigen Sie die gewünschte Prüffläche an einer metallischen Halterung des AFM mit handelsüblichem Epoxidharz.

Setzen Sie dann den metallischen Halter in den Glashalter des AFM ein, der die Form einer kleinen Petrischale hat. Füllen Sie den Glashalter mit TRIS-Puffer. Platzieren Sie dann den metallischen Halter auf dem AFM-Tisch unterhalb des Spitzenhalters.

Montieren Sie als Nächstes die AFM-Spitze auf dem optischen Glas des AFM. Setzen Sie den optischen Glasblock in den AFM-Kopf ein. Und den AFM-Kopf auf die Bühne stellen.

Kalibrieren Sie als Nächstes die AFM-Ausleger mit Federkonstanten im Bereich von 10 bis 30 Pikonewton pro Nanometer. Eine typische Kraftmessung ergibt eine Kraft-Weg-Kurve, wie sie hier gezeigt wird. Der erste Blick zeigt unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und der Oberfläche an, und der zweite Blick bezieht sich auf das spezifische Adhäsionsereignis.

Aus mehreren hundert Kraft-Abstands-Kurven ist es möglich, ein Histogramm zu erstellen, indem die Anzahl der Adhäsionsereignisse in Abhängigkeit von der Kraft aufgetragen wird. Durch Anwenden einer Gaußschen Anpassung auf diese Histogramme wird die wahrscheinlichste Kraft bestimmt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man AFM-Spitzen chemisch mit Aminosäuren oder Peptiden modifiziert und wie man Einzelmolekül-Kraftspektroskopie mit AFM durchführt.