La quantificazione rapida di Mitogen indotta blastogenesi in linfociti T per l'identificazione farmaci immunomodulatori

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la potenza di farmaci immunomodulatori utilizzando un contatore cellulare automatico mediante la misurazione della blastogenesi o della trasformazione blastica dei linfociti T. Questo saggio fornisce un metodo rapido per quantificare l'attivazione dei linfociti T mediante un contatore cellulare automatico dotato della capacità di misurare i diametri cellulari. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una misurazione rapida, semplice e diretta a partire da singole cellule, a differenza dei comuni saggi di proliferazione dei linfociti T.

Il trattamento dei linfociti con farmaci immunomodulatori aumenterà o diminuirà la velocità e l'entità della blastogenesi cellulare. Utilizzando il saggio con contatore cellulare, l'estensione di questa blastogenesi può essere misurata in circa quattro minuti per campione. Entro dieci minuti dall'eutanasia, spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70 percento e utilizzare le forbici per praticare un'incisione nel pelo e nella pelle sul lato sinistro dell'animale.

Tenere la pelle separata e tirata all'indietro per esporre il peritoneo. Applicare quindi un clorhexidina al quattro percento sul sito dell'incisione. Utilizzando un secondo paio di forbici e pinze, effettuare un taglio di due-tre centimetri lungo l'addome centrale per aprire il peritoneo.

Quindi, rimuovere le aderenze viscerali e il grasso in eccesso che circondano la milza e trasferire il tessuto in un contenitore di DPBS. Successivamente, aggiungere dieci millilitri di mezzo RPMI 1640 completo in una piastra da coltura da dieci centimetri e frantumare le milze tra due vetrini in vetro smerigliato sterilizzati. Filtrare la sospensione tissutale attraverso un filtro cellulare in nylon sterile da 40 micron in una nuova piastra da coltura da dieci centimetri per rimuovere i tessuti connettivi e i detriti, quindi trasferire la sospensione monocellulare in un tubo conico da 50 millilitri per la centrifugazione.

Risospendere il pellet in 20 millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi. Dopo dieci minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata, raccogliere le cellule mediante un’ulteriore centrifugazione e risospendere il pellet in dieci millilitri di mezzo fresco. Quindi centrifugare nuovamente le cellule per risospendere in due millilitri di mezzo completo a 37 gradi Celsius.

Per purificare le cellule T, lavare dapprima una o due colonne di lana di nylon per milza due volte con cinque millilitri di RPMI completo e posizionare le colonne in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica per un'ora. Al termine dell'incubazione, caricare due millilitri della sospensione di splenociti isolati sulla sommità di ciascuna colonna e lasciare che le cellule attraversino la colonna fino a quando il liquido non raggiunge la parte superiore della lana. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo completo fresco a 37 gradi Celsius sulla sommità delle colonne e lasciare che il mezzo passi attraverso la lana di nylon fino a quando il liquido in cima alla colonna non raggiunge nuovamente la parte superiore della lana.

Ora coprire la lana con tre millilitri di mezzo completo a 37 gradi Celsius e riposizionare la colonna nell'incubatrice per colture cellulari, in modo che le cellule B, i fibroblasti e le cellule accessorie aderiscano alle fibre di lana. Dopo un'ora, in un nuovo tubo conico da 50 millilitri, lavare la colonna due volte con cinque millilitri di mezzo completo fresco per eluire le cellule T non aderenti. Successivamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo aver lavato i linfociti T una volta con dieci millilitri di mezzo completo, risospendere il pellet in due millilitri di mezzo completo fresco. Quindi contare le cellule e diluire la sospensione a una concentrazione di 0,5 × 10⁶ cellule per millilitro in mezzo completo fresco, per la semina in una piastra per colture cellulari a sei o 24 pozzetti, a seconda delle esigenze sperimentali. Entro 24 ore dall'isolamento, attivare i linfociti T isolati mediante colonna di lana di nylon con lo stimolo appropriato e il farmaco sperimentale di interesse.

Dopo 12-72 ore, utilizzare una pipetta da un millilitro per mescolare delicatamente le cellule trattate attivate ed eliminare eventuali aggregati. Per misurare il diametro cellulare mediante contatore cellulare automatico, trasferire un millilitro di cellule trattate da ogni pozzetto in contenitori campione singoli e posizionare i contenitori nel portacampioni del contatore cellulare automatico. Inserire l'ID del campione e le informazioni sul tipo cellulare per registrare i campioni e iniziare l'analisi.

Dopo aver mescolato il blu di tripano con la sospensione cellulare, le cellule vengono fatte passare su un campo di imaging fino a raccogliere circa 100 immagini cellulari per ogni campione. Il software traccia un cerchio attorno a ciascuna cellula rilevata, colorata o non colorata con il blu di tripano, per determinarne il diametro. Una volta misurate tutte le cellule, i dati vengono esportati in un foglio di calcolo che mostra i risultati come conteggi totali e vitali per ogni diametro misurato.

I dati possono quindi essere presentati come istogrammi. Dopo due giorni di stimolazione con PMA e ionomicina, si osserva un significativo spostamento della mediana della distribuzione di frequenza verso diametri cellulari maggiori, con una corrispondente riduzione del numero di linfociti T con diametri più piccoli. A una concentrazione fissa di ionomicina di 250 nanomolar, l'effetto del PMA non cambia significativamente aumentando la concentrazione dello stimolo di attivazione da due a 250 nanogrammi per millilitro.

Neppure si osserva una differenza apprezzabile nella proliferazione dei linfociti T. I farmaci inibitori della calcineurina sopprimono parzialmente sia la blastogenesi che la proliferazione dei linfociti T. Il trattamento dei linfociti T con composti immunosoppressori che bersagliano il fattore nucleare dei linfociti T attivati dipendente dalla calcineurina inibisce la risposta blastogenica di circa il 72 percento.

La rapamicina e l'FTY720 mostrano effetti moderati ma statisticamente significativi sulla blastogenesi. Mentre il TRAM34 apparentemente non influisce sulla proliferazione dei linfociti T murini, nemmeno a concentrazioni di 700 nanomolari. Quando la rapamicina e la ciclosporina A vengono utilizzate insieme, la blastogenesi è completamente inibita.

Si osservano risultati simili con linfociti T murini attivati mediante microsferette magnetiche coniugate con anti-CD3 e anti-CD28. Questo saggio può essere utilizzato per quantificare con successo gli effetti di diversi farmaci immunomodulatori, fornendo una valutazione più accurata della potenza del farmaco rispetto ai tipici saggi di proliferazione, che includono anche il contributo di cellule apoptotiche e necrotiche. Con questo metodo, è possibile misurare fino a 15 campioni in entrata e in uscita, consentendo la quantificazione simultanea e successiva sia del tasso di blastogenesi sia di quello di proliferazione.

A volte delle bolle d'aria possono entrare nella cella di flusso, rendendo la misurazione inutilizzabile; pertanto, tutte le immagini devono essere esaminate alla ricerca di bolle d'aria prima di accettare i dati di ogni prova per l'analisi. Un limite di questo procedimento è che, se nel campione è presente troppo materiale di scarto, la misurazione potrebbe considerare tale materiale come cellule vitali. Con opportune modifiche, questo saggio potrebbe essere adattato per studiare la variazione della dimensione cellulare nei neutrofili e negli epatociti.