La quantificazione rapida di Mitogen indotta blastogenesi in linfociti T per l'identificazione farmaci immunomodulatori

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la potenza dei farmaci immunomodulatori utilizzando un contatore cellulare automatizzato misurando la blastogenesi dei linfociti T o la trasformazione blastica. Questo test fornisce un metodo rapido per quantificare l'attivazione dei linfociti T utilizzando un contatore di cellule automatizzato in grado di misurare i diametri cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione rapida, semplice e diretta da singole cellule, a differenza dei comuni saggi di proliferazione dei linfociti T.

Il trattamento dei linfociti con farmaci immunomodulatori aumenterà o diminuirà la velocità e l'estensione della blastogenesi cellulare. Utilizzando il test del contatore cellulare, l'entità di questa blastogenesi può essere misurata in circa quattro minuti per campione. Entro dieci minuti dal sacrificio, spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo e usare le forbici per praticare un'incisione nel pelo e nella pelle sul lato sinistro dell'animale.

Tenere la pelle divaricata e indietro per rivelare il peritoneo. Quindi applicare una clorexidina al quattro percento sul sito di incisione. Usando un secondo set di forbici e pinze, fai un taglio di due o tre centimetri lungo l'addome centrale per aprire il peritoneo.

Quindi, rimuovere gli attacchi viscerali e il grasso in eccesso che circonda la milza e trasferire il tessuto in un contenitore di DPBS. Quindi, aggiungere dieci millilitri di terreno RPMI 1640 completo a un piatto di coltura di dieci centimetri e schiacciare la milza tra due vetrini di vetro smerigliato sterilizzati. Filtrare l'impasto tissutale attraverso un colino sterile in nylon da 40 micron in un nuovo piatto di coltura da dieci centimetri per rimuovere i tessuti connettivi e i detriti e trasferire la sospensione a singola cellula in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione.

Risospendere il pellet in 20 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi. Dopo dieci minuti a temperatura ambiente con un leggero oscillamento, raccogliere le celle con un'altra centrifugazione e risospendere il pellet in dieci millilitri di terreno fresco. Quindi centrifugare nuovamente le cellule per la risospensione in due millilitri di terreno completo a 37 gradi Celsius.

Per purificare le cellule T, lavare prima una o due colonne di lana di nylon per milza due volte con cinque millilitri di RPMI completo e posizionare le colonne in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per un'ora. Al termine dell'incubazione, caricare due millilitri della sospensione di splenociti isolati sulla parte superiore di ciascuna colonna e lasciare che le cellule passino attraverso la colonna fino a quando il liquido non raggiunge la parte superiore della lana. Quindi, aggiungi due millilitri di terreno completo fresco a 37 gradi Celsius nella parte superiore delle colonne e lascia che il terreno passi attraverso la lana di nylon fino a quando il liquido nella parte superiore della colonna raggiunge la parte superiore della lana.

Ora copri la lana con tre millilitri di terreno completo a 37 gradi Celsius e rimetti la colonna nell'incubatore di coltura cellulare a tutte le cellule B, ai fibroblasti e alle cellule accessorie per aderire alle fibre di lana. Dopo un'ora, in una nuova provetta conica da 50 millilitri, lavare la colonna due volte con cinque millilitri di terreno completo fresco per eluire le cellule T non aderenti. Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo aver lavato una volta le cellule T con dieci millilitri di terreno completo, risospendere il pellet in due millilitri di terreno completo fresco. Quindi contare le cellule e diluire la sospensione a una concentrazione di 0,5 volte dieci o sei cellule per millilitro in terreno fresco completo per la semina in una piastra di coltura cellulare a sei o 24 pozzetti, come sperimentalmente appropriato. Entro 24 ore dal loro isolamento, attivare le cellule T isolate con lo stimolo appropriato e il farmaco sperimentale di interesse.

Dopo 12-72 ore, utilizzare una pipetta da un millilitro per mescolare delicatamente le cellule trattate attivate per rimuovere eventuali grumi. Per misurare i diametri delle celle con il contatore di cellule automatizzato, trasferire un millilitro di cellule trattate da ciascun pozzetto in tazze per campioni individuali e posizionare le coppette per campioni nel carosello dei campioni del contatore di celle automatizzato. Immettere l'ID del campione e le informazioni sul tipo di cella per registrare i campioni e iniziare a eseguire i campioni.

Dopo aver mescolato il blu di tripano con la sospensione cellulare, le cellule vengono passate su un campo di imaging fino a quando non vengono raccolte circa 100 immagini cellulari da ciascun campione. Il software disegna un cerchio attorno a ciascuna cellula colorata in blu di tripano rilevata e non colorata per determinare il diametro della cella. Quando tutte le celle sono state misurate, i dati vengono esportati in un foglio di calcolo che mostra i risultati come il conteggio totale e vitale delle cellule per ogni diametro misurato.

I dati possono quindi essere presentati come istogrammi. Dopo due giorni di stimolazione con PMA e ionomicina, si osserva uno spostamento significativo della mediana della distribuzione di frequenza verso diametri cellulari più grandi, con il numero di cellule T con diametri più piccoli ridotto di conseguenza. A una concentrazione fissa di 250 nanomolari di ionomicina, l'effetto PMA non viene modificato in modo significativo aumentando la concentrazione dello stimolo di attivazione da due a 250 nanogrammi per millilitro.

Né si osserva una differenza apprezzabile nella proliferazione delle cellule T. I farmaci inibitori della calcineurina sopprimono parzialmente sia la blastogenesi che la proliferazione delle cellule T. Il trattamento con cellule T con composti immunosoppressori che prendono di mira il fattore nucleare della calcineurina delle cellule T attivate inibisce la risposta blastogenica di quasi il 72%.

La rapamicina e l'FTY720 mostrano effetti moderati ma statisticamente significativi sulla blastogenesi. Mentre TRAM34 apparentemente non influenza la proliferazione delle cellule T murine anche a concentrazioni di 700 nanomolari. Quando la rapamicina e la ciclosporina A vengono utilizzate insieme, la blastogenesi è completamente inibita.

Risultati simili si osservano con le cellule T murine attivate con biglie magnetiche coniugate anti-CD3 e anti-CD28. Questo test può essere utilizzato per quantificare con successo gli effetti di vari farmaci immunomodulatori, fornendo una migliore valutazione della potenza del farmaco rispetto ai tipici test di proliferazione che includono anche contributi da cellule apoptotiche e necrotiche. Con questo metodo, è possibile misurare fino a 15 campioni in entrata e in uscita, consentendo la quantificazione simultanea e successiva sia della blastogenesi che dei tassi di proliferazione.

Occasionalmente le bolle d'aria possono entrare nella cella di flusso rendendo la misurazione inutilizzabile, pertanto tutte le immagini devono essere esaminate per verificare la presenza di bolle d'aria prima che i dati di ogni prova siano accettati per l'analisi. Una limitazione di questa procedura è che se ci sono troppi detriti nel campione, la misurazione può trattare i detriti come cellule vitali. Con le opportune modifiche, questo test ha il potenziale per essere adattato per studiare il cambiamento delle dimensioni cellulari nei neutrofili e negli epatociti.