Quantificazione delle cellule CD4 specifiche dell'antigene umano che proliferano utilizzando Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Questo protocollo fornisce una piattaforma per lo studio delle risposte delle celle CD4T che sono spesso deboli e difficili da rilevare. Questa tecnica consente il rilevamento, l'enumerazione e l'isolamento delle celle CD4T senza alcuna conoscenza preliminare della presentazione dell'antigene. Il vantaggio principale è l'analisi delle cellule CD4T che sono abbastanza spesso popolazioni rare associate a condizioni autoimmuni come il diabete di tipo uno.

Dopo aver ottenuto il campione di sangue periferico da un donatore sano, diluire il sangue in PBS in almeno uno o due rapporti prima di stratificazione di 35 millilitri di sangue oltre 15 millilitri di mezzo gradiente di densità in un tubo da 50 millilitri. Separare le cellule per centrifugazione del gradiente di densità e rimuovere circa 20 millilitri dello strato plasmatico superiore risultante. Quindi raccogliere lo strato di globuli bianchi facendo attenzione ad evitare il pellet di globuli rossi e lavare le cellule tre volte in PBS fresco.

Dopo il conteggio, diluire le cellule a una cella mononucleare del sangue una volta 10-10 o PBMC per millilitro di concentrazione di PBS. Aggiungere 300 microlitri di celle per ogni controllo in singoli tubi da 10 millilitri. Dopo aver topping ogni tubo con PBS, sedimentare le cellule per centrifugazione e rimosorsi le cellule a una volta 10 alla sesta colonna per millilitro di concentrazione media RP5.

Quindi placcare 100 microlitri di cellule per controllo a ciascuno dei tre pozzi di una piastra di 96 porri contenente 100 microlitri di RP5 medio per pozzo. Posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per sette giorni. Successivamente, trasferire i RESTANTI PBBC in un nuovo tubo da 50 millilitri e aggiungere un microlitro di soluzione di materiale di lavoro CFSE per un millilitro di sospensione cellulare sul lato del tubo.

Invertire rapidamente il tubo più volte per mescolare e posizionare le cellule in un incubatore di coltura cellulare per cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, arrestare la reazione con cinque millilitri di mezzo RP5 e raccogliere le cellule per centrifugazione. Resuspend il pellet a uno per 10 al sesto PBBC per millilitro di mezzo RP5 fresco e aggiungere un millilitro di cellule a un tubo da 10 millilitri per antigene da testare.

Aggiungere quindi 100 microlitri di cellule per antigene a ciascuno dei tre pozzali di un pozzo di 96 piastre contenenti 100 microlitri di mezzo RP5 integrati con l'antigene diluito di interesse per pozzo. Posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per sette giorni. Per macchiare le popolazioni di cellule CD4+T per l'analisi citometrica del flusso, alla fine della coltura trasferire l'intero volume di cellule da ogni pozzo in singoli tubi a celle attivate a fluorescenza o tubi FACS.

Lavare ogni campione con un millilitro di PBS integrato con siero di vitello fetale dello 0,1% o FCS. Resuspend i pellet in un anticorpo CD4 anti-umano appropriato in 100 microlitri di PBS più FCS per tubo. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti protetti dalla luce.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni in un millilitro di PBS fresco più FCS per tubo e rimospendre i pellet in 100 microlitri di PBS fresco più FCS. Immediatamente prima dell'analisi, aggiungere un microlitro di ioduro di propidio a ciascun tubo per consentire l'esclusione delle cellule morte. Gate i linfociti in base alle loro aree di dispersione anteriore e laterale.

Per escludere le cellule apoptotiche, gate l'area di dispersione in avanti rispetto alle cellule negative dello ioduro propidio e utilizzare le celle non macchiate per impostare una linea di base di tensione per le celle non fluorescenti. Impostare le tensioni per il fluoroforo anticorpale CD4 e il segnale CFSE in modo che il segnale fluorescente sia inferiore a 1000 per ciascuno. Utilizzare i campioni CFSE e CD4 a controllo del colore singolo per confermare un segnale fluorescente positivo per ogni colore utilizzando le tensioni impostate con le celle non macchiate.

Poiché CFSE e ioduro di propidio hanno una certa sovrapposizione spettrale, regolare la compensazione per sottrarre la fluorescenza dello ioduro propidio dalla fluorescenza CFSE fino a quando il campione di solo CFSE non produce un segnale nel canale del propidio ioduro. Quando tutti i campioni sono stati analizzati, calcolare l'indice di divisione cellulare dividendo il numero di cellule divise per 5000 cellule indivise dal gruppo stimolato dall'antigene per il numero medio di cellule divise per 5000 cellule indivise dalle cellule coltivate senza antigene. Quasi tutti i donatori dimostrano una forte risposta delle cellule T al tossoide di Tetano dopo la stimolazione in vitro perché i donatori sono stati vaccinati rendendo il tossoide tetano un utile antigene di controllo positivo.

La proliferazione delle cellule CD4+T da PBBC non stimolati è tuttavia minima. Dopo sette giorni di stimolazione con C-peptide pro-insulina umana, le cellule CD4+T specifiche del C-peptide pro-insulina possono essere rilevate nel sangue periferico di un individuo con diabete di tipo uno. Anche il PBMC stimolato con la proteina della matrice virale influenzale A dimostra la proliferazione.

Nel loro insieme, questi dati dimostrano che il saggio può essere eseguito utilizzando proteine a figura intera e brevi peptidi sintetici. Il componente FACS di questo metodo può essere eseguito utilizzando un citometro del flusso di ordinamento delle celle. Utilizzando uno smistatore di celle, le cellule T specifiche dell'antigene possono essere isolate a livello di singola cella per l'analisi a valle.

Questo metodo ha permesso la scoperta di risposte cellulari CD4T in individui con diabete di tipo uno ad esordio precoce. L'analisi di queste rare popolazioni di cellule T utilizzando altri metodi presenta varie sfide tecniche.