Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado

O objetivo geral desta técnica de imagem de células vivas é acompanhar processos celulares como a captação e distribuição de agentes quimioterápicos sem a necessidade de fixação. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como: como os agentes quimioterápicos, na forma livre ou encapsulados em nanopartículas, são absorvidos pelas células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que estamos fazendo imagens de células vivas, evitando artefatos de fixação e permitindo a avaliação dinâmica em tempo real.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando observamos que os nanoparciais quebravam durante a fixação, o que levava a uma interpretação errônea da entrega do medicamento. Para montar a câmara de imagem, coloque uma lamínula de 25 milímetros na parte inferior da câmara e aparafuse a parte superior na parte inferior. Não aperte com muita força, pois o vidro pode quebrar.

Autoclave toda a câmara. Para revestir as células, remova a câmara de imagem da bolsa de esterilização em um gabinete de fluxo laminar. Aperte cuidadosamente a câmara e coloque-a em uma placa de Petri.

Cubra o vidro da câmara de imagem com um mililitro de gelatina estéril a 0,1% por 20 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Depois de remover o meio dos frascos de cultura de células, lave as células uma vez com 1x PBS e separe as células usando 0,25% de tripsina. Inative a tripsina adicionando meio de cultura celular.

Em seguida, colete as células e gire-as a 1.100 Gs por cinco minutos. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultura celular. Depois de contar as células conforme descrito no protocolo de texto, aspire a gelatina e coloque as células em uma diluição que permita uma cobertura máxima de 70% em 24 horas.

Deixe as células aderirem a cinco por cento de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Realize uma avaliação das células ao microscópio quanto à confluência, morfologia celular e contaminação. Em seguida, ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador.

Conecte o aquecedor da lente à objetiva e ajuste-o para 35 graus. Prepare a unidade de incubação conforme mostrado no protocolo de texto. Coloque a unidade de incubação no microscópio stage e conecte o tubo de dióxido de carbono de entrada e saída.

Abra a válvula principal de dióxido de carbono e ligue o controlador de dióxido de carbono. Verifique se o controlador está configurado para cinco por cento de dióxido de carbono. Condições adequadas de cultura celular, como temperatura, CO2, pH, umidade e esterilidade, são cruciais para imagens celulares de longo prazo.

Portanto, para cada incubadora, isso precisa ser testado adequadamente. Defina a temperatura do palco para 37 graus Celsius. Permita que a unidade de incubação atinja a temperatura selecionada e a porcentagem de dióxido de carbonotage.

Pegue a câmara de imagem da incubadora principal de dióxido de carbono e transporte a câmara em uma placa de Petri para a sala de microscopia. Coloque a câmara de imagem em um suporte de platina de 35 milímetros de diâmetro feito sob medida e feche a câmara com uma tampa de vedação feita sob medida. Abra a unidade de incubação e trabalhe o mais rápido possível para evitar o resfriamento das células; Substitua o adesivo vermelho pela câmara de imagem e feche a unidade.

Certifique-se de que nenhum cabo esteja preso entre a platina e o microscópio. Deixe a unidade se aclimatar por 30 minutos. Em seguida, abra o software e ligue o laser.

Crie um novo banco de dados clicando em Novo"na guia Arquivo. Nomeie e salve o banco de dados. Defina a configuração clicando em Config"na guia Adquirir.

Selecione Modo de canal "e Trilha única" para avaliar um único fluoróforo. Selecione Multi Track"para vários fluoróforos. Em seguida, escolha os filtros de banda passados apropriados, combinando com o fluoróforo.

Selecione o canal de campo claro em uma das trilhas. A varredura fica comprometida entre o sinal fluorescente dos compostos e a qualidade da imagem. A superexposição, o fotobranqueamento, a relação sinal-ruído, a qualidade das células, os compostos adicionados são fatores que podem influenciar os resultados e precisam ser devidamente testados.

Defina o controle de varredura clicando em Digitalizar"na guia Adquirir. Em seguida, clique em Modo"para definir o tamanho do quadro, a velocidade de digitalização, a direção da varredura e a média de varredura. Clique em Canais" para definir o orifício, o ganho e o deslocamento e a potência do laser.

Salve essas configurações clicando em Config"na guia Configuração e salve-as no banco de dados de configuração. Defina o lapso de tempo clicando em Muti TimeX"na guia Macro. Clique em Local único.

Aplique a configuração salva clicando em Trilha única"e role até a configuração necessária no banco de dados de configuração. Defina o intervalo de tempo e o número de varreduras. Carregue a configuração clicando em Load Conf.

Nomeie o lapso de tempo no Nome do arquivo base e selecione o banco de dados clicando em Base de dados de imagem" para salvar o lapso de tempo. Defina uma pasta temporária clicando em Pasta de imagem temporária"Em seguida, abra a unidade de incubação, levante o anel de imagem, adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva e feche a unidade o mais rápido possível. Foque e selecione uma posição na câmara de imagem.

No Gabinete de Fluxo Laminar, dilua o medicamento livre ou nanopartículas a uma concentração de cinco microgramas por mililitro de medicamento ou 0,05 micromoles de lipídios em meio de cultura celular. Filtre através de um filtro de seringa de 0,22 mícron se o medicamento ou as nanopartículas não forem estéreis. Abra a câmara de incubação e levante a tampa do teto.

Em seguida, remova o meio das células, adicione um mililitro de droga diluída ou nanopartículas e feche a unidade o mais rápido possível. Concentre-se nas células e faça uma varredura rápida clicando em Único"na guia Controle de varredura. Quando a imagem de campo claro mostrar células focadas, inicie o lapso de tempo clicando em Hora de início" na macro Multi TimeX.

O número de repetições e o tempo restante são mostrados na Macro e nas imagens. Verifique regularmente se as células ainda estão focadas ou use o foco automático. O programa salva automaticamente o lapso de tempo no banco de dados.

Não feche o banco de dados enquanto o programa estiver em execução. Este é um lapso de tempo de três horas de células expostas à doxorrubicina livre. Observe a captação e a translocação imediata da doxorrubicina fluorescente vermelha para o núcleo.

Aqui, as células são incubadas por três horas com doxorrubicina encapsulada. O sinal fluorescente é muito menor e está localizado no citoplasma. O sinal dificilmente é visível no núcleo.

Transportando estes filmes em time-lapse para a Imagem J, é possível desenhar uma região de interesse em torno do núcleo e medir a densidade de pixels. O gráfico aqui apresentado mostra a diferença na captação nuclear ao longo do tempo em células incubadas com doxorrubicina livre ou encapsulada. Aqui estão as células incubadas com doxorrubicina encapsulada, mostradas em vermelho.

O sinal roxo representa o portador e os lisossomos são corados com um marcador verde de células vivas. A comparação dos dois tipos de células mostra uma diferença na distribuição lisossômica. Os lisossomos nas células B16BL6 são distribuídos por todo o citoplasma.

Considerando que, os lisossomos nas células BLM estão localizados perto do núcleo. No entanto, ambas as linhagens celulares mostram uma alta colocalização do sinal vermelho e roxo nos lisossomos, indicando que a doxorrubicina e seu transportador estão presos nessas organelas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens da absorção de agentes quimioterápicos e outros marcadores fluorescentes em células vivas por várias horas ou até dias.