Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

L'obiettivo generale di questo avvolgitore meccanico di cellule a otto canali è quantificare l'effetto del trattamento sulla migrazione cellulare utilizzando il test di guarigione delle ferite in modo rapido e semi-alto senza l'uso di apparecchiature costose e complicate. La migrazione cellulare è un importante processo cellulare in diverse condizioni fisiologiche e potenti condizioni fisiologiche. I saggi in vitro per la guarigione delle ferite sono utilizzati in diversi studi, tra cui studi sul cancro, sul salvataggio e dermatologici.

Il vantaggio principale di questo metodo è che l'effetto sulla migrazione cellulare può essere monitorato su una pagina a 96 binari, consentendo di osservare contemporaneamente diverse condizioni di trattamento. A dimostrare la procedura sarà Ka Chun Ng, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per iniziare l'esperimento, preparare il portaspilli fissando i perni di avvolgimento a distanze uguali.

Tenere i puntali della pipetta e muovere i perni di avvolgimento regolabili su e giù per regolare l'altezza del puntale. Quindi, montare la barra di guida regolabile su marche diverse su piastre di coltura a 96 pozzetti e assicurarsi che l'area di ferita sia in una posizione fissa. Fissare il perno di avvolgimento regolabile serrando la vite esagonale.

Fissare la barra di guida in posizione serrando i cappucci a testa esagonale su entrambe le estremità. Utilizzare una chiave esagonale M5 per allentare i cappucci a testa esagonale. Inserire un numero adeguato di anelli di regolazione su entrambi i lati del portaperni in modo che le barre di guida si adattino perfettamente alla larghezza della piastra di coltura a 96 pozzetti.

Quindi serrare i cappucci a testa esagonale per fissare la barra di guida. Iniziare a regolare le barre di guida inserendo i perni di avvolgimento con puntali sterili per pipette in plastica da 10 microlitri. Quindi, allentare i cappucci a testa esagonale con la chiave esagonale M5.

Tenere la feritrice e immergere i perni di ferita in una colonna di una piastra di coltura a 96 pozzetti. Quindi regolare l'altezza delle barre di guida fino a quando tutte le punte toccano appena il fondo dei pozzetti. Serrare i cappucci a testa esagonale.

Assicurarsi che l'avvolgitore si adatti perfettamente alla piastra di coltura e che i perni siano ben posizionati al centro dei pozzetti. Tenere l'avvolgitore perpendicolarmente a una superficie piana e sterile, come una capsula di Petri e allentare tutte le viti esagonali con la chiave esagonale M3. Picchiettare la feritrice fino a quando tutte le punte toccano uniformemente la superficie.

Dopo che le punte hanno toccato uniformemente la superficie, serrare nuovamente le viti esagonali per bloccare i perni in posizione. Quindi controllare l'uniformità di ciascuna punta picchiettando delicatamente la feritrice sulla superficie piana sterile. Seminare cellule endoteliali vascolari ombelicali umane su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti rivestita di gelatina allo 0,1%.

Cellule di coltura nel terreno 199 integrate con il 20% di siero fetale bovino inattivato termicamente, l'1% di penicillina streptomicina e 0,09 grammi per litro di eparina. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per una notte prima di utilizzarle. Una volta che le cellule hanno ricevuto il 100% di confluenza, posizionare le punte della ferita sul lato più a sinistra di ciascun pozzetto all'interno della stessa colonna della piastra di coltura.

Far scorrere la feritrice sull'altro lato del pozzo. Assicurati che le punte delle ferite tocchino il fondo del pozzo. Per garantire che la ferita in ogni pozzetto della cellula molinarare sia centrata e nella stessa onda, far oscillare la feritrice che si estende attraverso il pozzetto fino all'altra estremità.

Ripetere il graffio per tutte le colonne. Dopo la ferita, scartare il terreno in ogni pozzetto e sostituirlo con un terreno fresco contenente composti di prova. Si passa poi all'acquisizione dei dati e all'analisi delle immagini.

Le immagini rappresentative di una fila e di una colonna di pozzetti subito dopo il graffio consentono un'analisi quantitativa della larghezza di ciascuna ferita. Le immagini della ferita sono state ottenute da cellule endoteliali della vena ombelicale umana e da blasti di fibre dermiche umane. La linea tratteggiata indica l'area della ferita e la linea continua indica l'area di migrazione cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo dispositivo per eseguire un test di guarigione delle ferite in una pagina da 96 pozzetti in modo semi-alto e per assicurarti che ogni pozzetto venga graffiato dal feritore.