Name: Isolamento di proteine filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate allinvecchiamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Impara un protocollo biochimico per isolare proteine filamentose intermedie da tessuti multipli di topo. Questo metodo consente di studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento in modo rapido e riproducibile.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH concede NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] e P30 DK034987 [alla UNC-Chapel Hill]. Gli autori ringraziano Deekshita Ramanarayanan per l&#39;assistenza con qPCR e western blot experiments.

Il protocollo è approvato e svolto in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali (IACUC) presso l&#39;Università della Carolina del Nord. 1. Preparativi <ol><li> Preparare il tampone Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA), portare il volume in soluzione salina fosfata (PBS), pH 7,4). Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL ciascuno di Triton X-100 e 500 mM EDTA in 490 mL di PBS, pH 7,4. Conservare la soluzione tampone Triton-X a 4 ° C. </li><li> Preparare il bucato di sale elevato (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, portare volume in doppia distillazione (dd) H 2 O). Per ottenere 500 ml: mescolare 10 ml di 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml di 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml di 0,5 M EDTA e 2,5 ml di Triton X-100, regolare il volume a 500 ML utilizzando doppia acqua distillata). Conservare la soluzione ad alto contenuto di butadiene a 4 ° C. </li><li> Appena prima dell&#39;uso, aggiungere una quantità appropriata di Triton-X e High Buffer di sale ( <em&gt; Ad esempio 1 mL per ogni campione di tessuto da 25 mg) con un cocktail di proteasi o proteasi / fosfatasi e scartare qualsiasi tampone non utilizzato che contiene gli inibitori. </li><li> Preparare 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL di 0,5 M EDTA in 495 mL di 1x PBS, pH 7,4. </li><li> Isolare diversi organi del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, pancreas, colon, intestino, rene, milza) utilizzando protocolli approvati conformi alle linee guida veterinarie e norme istituzionali 23 . La procedura di raccolta dei tessuti dovrebbe durare non più di 5 minuti per preservare l&#39;integrità di RNA e proteine ​​dei tessuti ricchi di proteasi ( ad esempio, il pancreas dovrebbe essere trattato in primo luogo). </li><li> Tagliare una piccola quantità di tessuto (~ 5-20 mg) e collocare nella soluzione di RNA per la successiva estrazione di RNA, la sintesi di cDNA e l&#39;analisi quantitativa PCR in tempo reale per l&#39;espressione del gene IF. Collocare i tubi della soluzione di stoccaggio RNA con tessuto a 4 ° C per una notte e seguire il protocollo del produttore per ulteriori sTorage e isolamento. </li><li> Tagliare il resto del tessuto in frammenti più piccoli ( p. Es. 0,5 cm) e collocare in crioviale. Fissare a freddo e conservare flaconi a -80 ° C o azoto liquido per conservare a lungo termine. </li></ol> 2. IF Gene Expression Analysis <ol><li> Estrarre l&#39;RNA dai tessuti conservati nel reagente della soluzione di storage RNA. Utilizzare qualsiasi metodo di estrazione appropriato / preferito secondo il protocollo del produttore. </li><li> Quantificare la concentrazione di RNA e utilizzare 2 μg di RNA per generare cDNA usando un idoneo kit di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore. </li><li> Utilizzando i primer genetici specifici del cDNA e del mouse del mouse, sono state create reazioni qPCR, tra cui tre repliche tecniche di ciascun campione, nonché un controllo in bianco secondo il protocollo del produttore. </li><li> Quantifica l&#39;espressione genica IF come un cambiamento pieghevole confrontando condizioni diverse ( ad esempio, giovani rispetto ai vecchi tessuti). </li></ol> 3. PRiparazione di lysati totali di tessuto per immunoblot <ol><li> Omogeneizzare 25 mg di tessuto in 1 mL di tampone di campione SDS non riducente. Uscire il colorante blu bromofenolo dal campione di tampone se si deve eseguire un test di proteina colorimetrico per quantificare la concentrazione proteica. </li><li> Aggiungere 5% (v / v) di 2-mercaptoetanolo (2-ME) per ottenere campioni ridotti. A 200 μL di campioni non riducenti, aggiungere 10 μL di 2-ME. </li><li> Determinare la concentrazione proteica usando un dosaggio proteico compatibile con detergente e agente riducente. Se la tintura è già inclusa nel buffer di campionamento, la quantità di proteine ​​può essere stimata dopo l&#39;esecuzione di un gel attraverso una serie di tecniche, tra cui la macchia 24 a base di Coomassie. </li><li> Vortex tutti i campioni e calore a 95 ° C per 5 min. </li><li> Effettuare la blotting occidentale in condizioni sia riducenti che non riducenti. La membrana espositiva brevemente (&lt;1 min) rivela specie monomeriche e più a lungo (&gt; 1 min) per rivelare complessi di massa molecolare alta contengonoNg di proteine ​​IF. Se monitorare l&#39;aggregazione, esamini intero gel / membrana (compresi i fondi dei pozzetti di gel). </li><li> Eseguire un gel parallelo e macchia con una macchia proteica come un controllo di caricamento 24 . In modelli di malattia o esperimenti di lesioni, la proteina totale di proteine ​​dovrebbe essere utilizzata come un controllo di caricamento, a differenza di immunoblots per le proteine ​​di &quot;pulizia&quot; ( ad esempio, actina, GAPDH) perché quest&#39;ultimo cambia in condizioni di stress differenti. </li></ol> 4. Preparazione di estratti solubili in detersivo e ad alto sale di IFs specifici per tessuti <ol><li> Aggiungere 1 ml di triturazione Triton X-100 ghiacciata in un omogeneizzatore di tubo di vetro e metterlo in ghiaccio. </li><li> Rimuovere un piccolo pezzo di tessuto (~ 25 mg) dall&#39;ammasso di azoto liquido e collocare direttamente nell&#39;omogenizzatore di vetro. Utilizzare un pestello di politetrafluoroetilene per omogeneizzare (50 colpi) e evitare di fare bollicine. Tenere l&#39;omogeneizzatore e il freddo lysate in ogni momento. </li><li> Trasferire il lisato in un micron da 1,5 mlCondensare il tubo di ghiaccio e centrifugare a 20.000 xg per 10 min in una centrifuga pre-raffreddata (4 ° C). </li><li> Raccogliere la frazione supernatante in un tubo separato. Questa è la frazione solubile in Triton X, che può essere usata per l&#39;immunoprecipitazione (ip) e l&#39;analisi del pool detergente-solubile di proteine ​​IF. Si noti che le fasi 4.1-4.4 possono essere ripetute per ottenere un estratto più pulito IF dal tessuto cerebrale. </li><li> Aggiungere 1 mL di alti bufsi di sale al pellet di tessuto, trasferire in un omogeneizzatore pulito e scaricare 100 colpi. Trasferire l&#39;omogenato al tubo di microcentrifuga e mettere il tubo su un agitatore rotante nella stanza fredda per 1 ora. </li><li> Centrifugare gli omogeneati a 20.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di bufalo PBS / EDTA al pellet e omogeneizzare il pellet (20 colpi) in un omogeneizzatore pulito come fase finale di pulizia *. Trasferire in un nuovo tubo e centrifugare a 20.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per ottenere la proteina IF-Ricco di estratto di sale elevato (HSE). * Facoltativamente, vortice invece di omogeneizzazione a questo punto. </li><li> Scartare il surnatante e sciogliere i pellet in 300 μL di buffer di campionamento SDS non ridotto che è stato pre-riscaldato. Rilasciare inizialmente il pellet pipettando e vorticando, quindi riscaldare i campioni per 5 minuti a 95 ° C. </li><li> Vortex e pipetta come necessario per garantire che il pellet sia sciolto. Può richiedere alcuni minuti per dissolvere completamente i pellet. </li><li> Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino all&#39;analisi. </li></ol> 5. Lisi di tessuto automatizzato per l&#39;estrazione di proteine ​​IF in esperimenti ad alto volume <ol><li> Per l&#39;estrazione di RNA, inserire il tampone di lisi (600 μL di tampone per 25 mg di tessuto) in un tubo contenente la matrice di lisi D (utilizza piccole sfere ceramiche) e impulsi due volte per 25 s nel lyser tissutale. Separare il lisato dalla matrice per centrifugazione a 20.000 xg e procedere alla fase successiva in isolamento. </li><li> Per l&#39;estrazione proteica, posizionare TritSu un tubo di lysing con la matrice di lysing SS (utilizzare un singolo tallone in acciaio inossidabile) su X-100 (o buffer SDS campione per preparare il lisato totale). Dopo aver testato più matrici, questo è stato selezionato perché produce estratti di proteine ​​IF che sono di qualità simile al metodo di ribaltamento tradizionale. Si noti che il metodo automatizzato non è ottimale per il pancreas e la milza e deve essere utilizzato il protocollo di omogeneizzazione standard per questi tessuti. </li><li> Per procedere alla preparazione di High Salt Extract, rimuovere il tallone dell&#39;acciaio inossidabile dal tubo usando un magnete e centrifugare i tubi a 20.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Continuare con il punto 4.4 (sopra) del protocollo manuale. </li><li> Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino all&#39;analisi. </li></ol> 6. Immuno-arricchimento delle proteine ​​IF modificate post-traslazione <ol><li> Preparare il buffer PBST (0,02% Tween-20 in PBS). Per ottenere 50 ml, aggiungere 10 μL di Tween-20 a 50 ml di PBS, pH 7,4. </li><li> Preparare l&#39;anticorpo PTMSoluzione (1-10 μg di anticorpi in 200 μL di PBST). In generale, 3 μg di anticorpo / reazione è una buona condizione di partenza che può essere ulteriormente ottimizzata se necessario. </li><li> Per ogni reazione, aliquota 50 μL di perline magnetiche in un tubo di microcentrifuga, posto sul magnete e aspirare la soluzione di stoccaggio del tallone. </li><li> Coniugare le perle all&#39;anticipo di immunoprecipitazione ri-sospendere nella soluzione anticorpale e incubare su rotatore (end-over-end, per assicurare la miscelazione di piccoli volumi) a temperatura ambiente per 20 minuti. </li><li> Posizionare i tubi sulla magnete e aspirare la soluzione anticorpale. </li><li> Sciacquare le perle coniugate con anticorpi una volta in 200 μl di PBST e rimuovere il tampone di lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,6-1 ml del lisato tissutale alle perle, mescolare con pipetta dolce e incubare per 3 ore su rotatore in una stanza fredda. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete, rimuovere lysate e lavare le perle cinque volte con 200 μL di PBST. Dopo l&#39;ultimo passo di lavaggio, raccogliere le perle in 100 _6, L di PBS (no Tween-20) e trasferire in un nuovo tubo pulito. Mettere il tubo sul magnete. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 100 μl di buffer di campionamento non riducente. Rimuovere 50 μL e aggiungere 2-ME (5%) per ridurre i campioni. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5 min. </li><li> Separare la frazione ip dalle perle sul magnete e raccoglierla in un nuovo tubo. </li><li> Conservare i campioni a -20 ° C fino all&#39;analisi. </li></ol> 7. Preparazione di campioni di proteine ​​IF per l&#39;analisi della spettrometria di massa <ol><li> Pianificare una consultazione con un esperto di proteomica prima di avviare uno studio poiché ci sono significativi tempi e costi con l&#39;analisi della spettrometria di massa. </li><li> Prendere precauzioni speciali per evitare contaminazioni. Maneggiare tutti i gel con guanti puliti e incubare in contenitori puliti, lavati solo con ddH 2 O (evitare sapone). </li><li> Eseguire 20-50 μL del campione HSE (dalle sezioni 4 e 5) su un gel SDS-PAGE secondo le condizioni standard. </li&gt; <li> Macchiare con una macchia proteica per 1 h. Sciacquare più volte e de-macchia in ddH 2 O durante la notte. Le bande di proteine ​​IF devono essere facilmente visibili dopo la de-colorazione. </li><li> Posizionare il gel tra i protettori in lamiera di plastica, eseguire la scansione e contrassegnare le bande che verranno escise e inviate per l&#39;analisi. </li><li> Accisa le bande di proteine ​​IF usando un nuovo rasoio pulito. </li><li> Posizionare le bande di gel in tubi di microcentrifuga puliti e trasferire in un impianto di spettrometria di massa. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I metodi che permettono la caratterizzazione biochimica delle proteine ​​IF possono essere utili per comprendere numerosi fenomeni patofisiologici nei sistemi mammiferi, in quanto le proteine ​​IF sono entrambi marcatori e modulatori dello stress cellulare e del tessuto 29 . Il principio dietro il metodo attuale si basa sulle procedure iniziali sviluppate negli anni &#39;70 e &#39;80 per isolare, separare e ricostituire proteine ​​IF dalle cellule e dai tessuti, generalmente impiegando soluzioni ...

<html> Gli IF sono una famiglia di proteine ​​che sono umane codificate da 73 geni e sono classificate in sei tipi principali: i tipi I-IV sono citoplasmatici ( ad esempio cheratine epiteliali e capelli (K), miocite desmin, neurofilamenti, proteina acido fibrillare gliale (GFAP) e altri); Tipo V sono i lamini nucleari; E il tipo VI sono IF nella lente di occhio 1 . In termini di organizzazione molecolare, le proteine ​​IF hanno tre domini comuni: un dominio &quot;rod&quot; a spirale a spirale altamente conservato e domini globali &quot;testa&quot; e &quot;tail&quot;. IF si assemblano per formare precursori di filamenti brevi, che vengono infine incorporati in filamenti maturi che formano strutture dinamiche citoscheletriche e nucleoscheletriche coinvolte nella protezione meccanica 2 , stress sensing 3 , 4 , regolazione della trascrizione 5 e crescita e altre funzioni cellulari critiche&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . L&#39;importanza funzionale del sistema IF è evidenziata dall&#39;esistenza di molte malattie umane causate da mutazioni missense nei geni IF, comprese le neuropatie, le miopatie, i disturbi della fragilità cutanea, le disfunzioni metaboliche e le sindromi di invecchiamento precoce 8 . Alcune mutazioni del gene IF non causano, ma predispongono i loro carrier alla progressione della malattia, come le semplici keratine epiteliali nella malattia epatica 9 . Quest&#39;ultima è dovuta alle funzioni critiche di protezione dello stress di IF in epitelio. Le IF sono in genere tra le proteine ​​cellulari più abbondanti in condizioni basali, ma sono inoltre fortemente indotte durante vari tipi di stress 10 . Ad esempio, studi recenti che valutano le variazioni del proteome nel nematode C. elegans hanno dimostrato che IF multipli sono altamente regolati e soggetti ad aggregatiDurante l&#39;invecchiamento organico 11 , 12 . Poiché la manutenzione di una corretta struttura IF è essenziale per la resistenza cellulare a varie forme di stress 10 , l&#39;aggregazione IF può anche contribuire al declino funzionale durante l&#39;invecchiamento. Tuttavia, mancano gli studi sul livello organico che esaminano più proteine ​​di mammiferi IF nei diversi tessuti sottoposti a stress. Le IF sono strutture altamente dinamiche che si adattano per soddisfare le esigenze cellulari. Le cheratine, ad esempio, subiscono un ciclismo indipendente dalla biosintesi tra il pool solubile (non filamentoso) e quello insolubile (filamentoso) 13 . In normali condizioni fisiologiche, circa il 5%, la piscina totale K8 / K18 può essere estratta in tampone privo di detersivo, rispetto a circa il 20% che può essere solubilizzata nel detergente non ionico Nonidet P-40, biochimicamente paragonabile a Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 . Durante la mitosi c&#39;è un notevole aumento della solubilità dell&#39;epitelio di tipo semplice K8 e K18 14 , che è meno evidente nelle cheratine epidermiche ma più evidente in vimentin e in altre proteine ​​di tipo III IF 15 e 16 . Le proprietà di solubilità delle proteine ​​IF sono fortemente regolate dalla fosforilazione, una modifica post-traduzionale chiave (PTM) per il riarrangiamento del filamento e la solubilità 17 , 18 , 19 , 20 . La maggior parte degli IF sono sottoposti ad una vasta regolazione da parte di un certo numero di PTM nei siti conservati, con conseguenti modifiche funzionali 17 . Lo scopo di questo metodo è introdurre gli investigatori che sono nuovi al campo IF per l&#39;estrazione biochimica e metodi analitici per lo studio delle proteine ​​IF attraverso diversi tessuti del topo. SpecificaCi concentriamo sull&#39;isolamento delle proteine ​​IF usando un metodo di estrazione ad alto sale e la valutazione dei cambiamenti nei PTM tramite spettrometria di massa e da anticorpi di targeting PTM. Questi metodi si basano su procedure precedentemente pubblicate21 ma includono modifiche per estrarre diversi tipi di proteine ​​IF per scoprire il meccanismo comune per la regolazione nella famiglia IF. Ad esempio, l&#39;acetilazione K8 in un residuo di lisina specifico regola l&#39;organizzazione del filamento, mentre l&#39;iperacetilazione favorisce l&#39;insolubilità di K8 e la formazione di aggregati 22 . I recenti studi di profilom proteomici globali hanno inoltre evidenziato che la maggior parte delle proteine ​​IF del tessuto-specifico sono anche obiettivi per l&#39;acetilazione e che la maggior parte dei siti di acetilazione IF sono limitati al dominio asta altamente conservato. Ciò evidenzia la necessità di metodi adatti alla profilazione globale del sistema IF. Introduciamo anche un rapido metodo di isolamento delle proteine ​​IF dai tessuti multipli utilizzando l&#39;omogeneizzazione automatizzata in optiMatrice di lysazione. I preparati risultanti sono adatti per l&#39;analisi PTM a valle tramite spettrometria di massa e altri metodi.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>perle di immunoprecipitazione</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>per tamponi</td></tr><tr><td>Purelink RNA mini kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12183018</td><td>l'estrazione dell'RNA dal tessuto</td></tr><tr><td>Purelink DNAse set ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>12185010A</td><td>su colonna Digestione</td></tr> <tr>del DNA<td>Magnete Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>per l'uso con dynabeads</td></tr><tr><td>Reagente colorante GelCode Blue ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>24592</td><td>Colorazione gel compatibile con la spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>per l'uso in western blot</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368813</td><td>per l'uso nell'analisi dell'espressione genica</td></tr><tr><td>Sistema PCR Proflex 3 x 32 pozzetti</td> Sistema <td>PCR</td><td>4484073</td><td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>Membrana di trasferimento PVDF&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td><td>per western blot</td></tr><tr><td>Power Up SYBR master mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td><td>per analisi qPCR</td></tr><tr><td>Soluzione RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td>per la conservazione dei tessuti prima dell'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Gel proteico prefabbricato</td></tr><tr><td>Anti-cheratina 8 anticorpo (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>per la rilevazione di western blot di K8</td></tr><tr><td>Anti-Vimentina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>per la rilevazione di western blot di vimentina</td></tr><tr><td>Tris Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>per il trasferimento a umido di gel proteici</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td>per la preparazione campioni di gel proteico</td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td><td>per la corsa di gel proteici</td></tr><tr><td>Perle di lisi - Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>Perle di lisi e provette per matrice per la disgregazione dei tessuti e l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Perle di lisi - Matrix SS</td><td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td><td>Perle di lisi e provette per matrici per la disgregazione dei tessuti e l'estrazione di proteine</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop Lite</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td>Misura di proteine e acidi nucleici</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Precellys 24</td><td>Bertin</td><td>Instruments EQ03119</td><td>Omogeneizzatore tissutale automatizzato</td></tr></tbody></table>

isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all&#39;invecchiamento

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

I filamenti intermedi (IFs), insieme ai filamenti e ai microtubuli attinici, formano il citoscheletro - elemento strutturale critico di ogni cellula. IFs funzionanti normalmente forniscono le cellule con meccaniche e resistenza allo stress, mentre un citoscheletro IF disfunzionale compromette la salute cellulare e è stato associato a molte malattie umane. Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) regolano criticamente la dinamica IF in risposta a cambiamenti fisiologici e in condizioni di stress. Pertanto, la capacità di monitorare i cambiamenti nella firma PTM di IF può contribuire a una migliore comprensione funzionale e, in ultima analisi, del sistema IF come risposta responsabile dello stress durante le lesioni cellulari. Tuttavia, il gran numero di proteine ​​IF, codificate da più di 70 geni individuali e espresse in maniera dipendente dal tessuto, è una sfida importante nell&#39;eliminare l&#39;importanza relativa di diversi PTM. A tal fine, metodi che consentono il monitoraggio di PTM sulle proteine ​​IFSu un livello organizzativo, piuttosto che per i membri isolati della famiglia, può accelerare il progresso della ricerca in questo settore. Qui presentiamo metodi biochimici per l&#39;isolamento della frazione totale resistente al detergente e resistente ai detergenti delle proteine ​​IF da 9 diversi tessuti del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, piccolo intestino, intestino, pancreas, rene e milza). Inoltre dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rapido isolamento delle proteine ​​IF utilizzando la matrice di lysing e l&#39;omogeneizzazione automatizzata di diversi tessuti del topo. Il protocollo automatizzato è utile per profilare gli IF in esperimenti con un elevato volume di campioni (come ad esempio nei modelli di malattia che coinvolgono più animali e gruppi sperimentali). I campioni risultanti possono essere utilizzati per varie analisi a valle, tra cui la profilazione PTM basata sulla spettrometria di massa. Utilizzando questi metodi, forniamo nuovi dati per dimostrare che le proteine ​​IF nei diversi tessuti del topo (cervello e fegato) subiscono cambiamenti paralleli rispetto al loro espressoLivelli di sione e PTM durante l&#39;invecchiamento.

Un nuovo metodo rapido per l&#39;estrazione elevata di proteine ​​IF dai diversi tessuti del topo usando la matrice di lysazione. Il metodo tradizionale 25 , 26 di isolare la maggior parte della frazione proteica filamentosa intermedia dal tessuto epiteliale è stato modificato qui per includere 9 diversi organi e ...

In questo metodo, presentiamo procedure biochimiche per l&#39;isolamento rapido ed efficace delle proteine ​​del filamento intermedio (IF) dai tessuti multipli del topo. Gli IF isolati possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nelle modificazioni post-traslazionali mediante spettrometria di massa e altri dosaggi biochimici.

Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all&#39;invecchiamento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

L'obiettivo generale di questa procedura biochimica è isolare frazioni arricchite in filamenti intermedi da diversi tessuti murini al fine di studiare le modifiche post-traduzionali delle diverse proteine dei filamenti intermedi specifiche dei tessuti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei filamenti intermedi, come ad esempio in che modo la funzione e la regolazione di queste importanti proteine citoscheletriche protettive contro lo stress vengono influenzate durante l'invecchiamento nei mammiferi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'inclusione di un passaggio automatizzato di lisi tissutale consente agli utenti di processare rapidamente ed in modo efficiente numerosi campioni tissutali.Per iniziare, aggiungere un millilitro di tampone freddo di Triton X-100, integrato con inibitori della proteasi, in un omogeneizzatore in vetro e posizionarlo sul ghiaccio. Prelevare un piccolo pezzo di tessuto dallo stoccaggio in azoto liquido e inserirlo direttamente nell'omogeneizzatore in vetro. Successivamente, mantenendo sempre l'omogeneizzatore e il campione sul ghiaccio, utilizzare circa 50 movimenti di un pestello in politetrafluoroetilene per omogeneizzare il campione, minimizzando al contempo la formazione di bolle.Trasferire il lisato in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio e centrifugare il campione a 20.000 × g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, raccogliere la frazione del sopranatante solubile in Triton X in una provetta separata. Questa frazione può essere utilizzata per l'immunoprecipitazione e l'analisi del pool di proteine IF solubili in detergente.Quindi, aggiungere al pellet di tessuto un millilitro di tampone ad alto contenuto salino integrato con inibitori delle proteasi. Trasferirlo in un omogeneizzatore pulito e omogeneizzare con 100 movimenti. Trasferire l'omogenato nuovamente nel tubo da microcentrifuga e posizionare il tubo su uno shaker rotante in camera fredda per un'ora.Centrifugare gli omogenati a 20.000 ×g a quattro gradi Celsius per 20 minuti e scartare il soprannatante. Aggiungere un millilitro di tampone PBS EDTA freddo a ghiaccio al pellet e trasferirlo in un omogenizzatore pulito come passaggio finale di purificazione. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire il campione in un nuovo tubo e centrifugare a 20.000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti per ottenere l'estratto ricco in sali ad alto contenuto proteico IF, o HSC.Eliminare il soprannatante e sciogliere il pellet in 300 microlitri di tampone campione SDS non riducente preriscaldato. Rompere inizialmente il pellet mediante pipettaggio e vortex. Successivamente, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Agitare con vortex e pipettare secondo necessità, per assicurarsi che il pellet sia completamente disciolto, operazione che può richiedere diversi minuti. Conservare tutti i campioni a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi. Per eseguire l'estrazione dell'RNA, aggiungere il buffer di lisi in un tubo contenente la matrice di lisi D, quindi aggiungere il tessuto campione al tissue lyser ed eseguire due impulsi da 25 secondi ciascuno.Separare il lisato dalla matrice mediante centrifugazione a 20.000 ×g. Per l'estrazione delle proteine, aggiungere il buffer campione con Triton X-100 o SDS se si prepara un lisato totale. In un tubo con lisina contenente la matrice SS. Quindi, aggiungere il tessuto campione. Eseguire una breve pulsazione per mescolare.Per preparare le HSC, utilizzare un magnete per rimuovere la sferetta in acciaio inox dal tubo e centrifugare i tubi a 20.000 × g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Separare le frazioni di sopranatante e di pellet e procedere come mostrato in precedenza nel video. Preparare il buffer PBST aggiungendo 10 microlitri di T20 a 50 millilitri di PBS a pH 7,4.Quindi preparare la soluzione dell'anticorpo PTM aggiungendo da uno a 10 microgrammi di anticorpo a 200 microlitri di PBST. Aliquotare 50 microlitri di microsfere magnetiche in una provetta da microcentrifuga. Posizionarla sul magnete ed aspirare la soluzione di conservazione delle microsfere.Coniugare le perle all'anticorpo per immunoprecipitazione risospendendo le perle nella soluzione di anticorpo e incubando il campione su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 20 minuti. Posizionare i tubi sul magnete ed aspirare la soluzione di anticorpo. Quindi risciacquare una volta le perle coniugate con l'anticorpo con 200 microlitri di PBST ed eliminare la soluzione.Aggiungere da 0,6 a un millilitro del lisato tissutale alle perle. Mescolare pipettando delicatamente e incubare la soluzione su un agitatore rotante in una stanza fredda per tre ore. Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il lisato, quindi utilizzare 200 microlitri di PBST per lavare le perle cinque volte.Dopo l'ultimo passaggio di lavaggio, raccogliere le perle e 100 microlitri di PBS e trasferire le perle in un nuovo tubo pulito. Posizionare il tubo sul magnete, quindi aspirare il PBS. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 100 microlitri di tampone campione non riducente.Aliquotare 50 microlitri dal tubo e combinarli con 5%2ME per ottenere campioni riducenti. Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Con il tubo sul magnete, raccogliere la frazione di IP dalle perle e trasferirla in un tubo nuovo.Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi. Per evitare la contaminazione dei campioni proteici destinati all'analisi mediante spettrometria di massa, utilizzare guanti puliti per manipolare tutti i gel e incubarli in contenitori puliti che siano stati lavati esclusivamente con H2O DD. Eseguire da 20 a 50 microlitri del campione HSE su un gel SDS-PAGE secondo le condizioni standard.Dopo aver colorato il gel secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare il gel tra proteggi-documenti in plastica. Quindi scansionare e contrassegnare le bande che verranno escisse. Utilizzare un rasoio nuovo e pulito per escindere le bande proteiche di IF e collocare le bande in provette microcentrifuga pulite su ghiaccio prima di inviarle per l'analisi in spettrometria di massa.Questa figura mostra un risultato tipico di HSE ottenuto da nove tessuti murini isolati mediante il metodo rapido. Si noti che questo metodo non funziona bene su pancreas e milza, e produce bande aggiuntive in un campione di intestino crasso. Questa analisi dell'espressione genica mostra che la cheratina 8 è regolata positivamente durante l'invecchiamento.Inoltre, i blotting western mostrano che la cheratina 8 è fortemente up-regolata nei fegati dei topi anziani. Qui, un campione di fegato HSE ottenuto utilizzando il protocollo automatizzato dimostra l'arricchimento marcato di cheratine 8 e 18 sul gel. L'analisi mediante spettrometria di massa mostra che K8 e K18 nel fegato di un topo anziano presentano numerosi siti di fosforilazione e acetilazione che non sono presenti nel fegato del topo giovane.Analogo ai cambiamenti della cheratina nel fegato, l'analisi del tessuto cerebrale mediante QPCR rivela un'induzione di cinque volte dell'mRNA di GFAP nei cervelli di topi di 24 mesi rispetto a quelli di tre mesi. Infine, l'analisi proteica degli estratti ad alto contenuto salino mediante colorazione con Coomassie e immunoblot delle frazioni totali e arricchite in lisina acetilata mostra che la proteina GFAP è sovraespressa e acetilata nel cervello del topo anziano. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come il proteomica basata su spettrometria di massa possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali sono le importanti modifiche post-traduzionali e i partner di legame delle proteine dei filamenti intermedi in diverse condizioni fisiologiche e patofisiologiche.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le proteine dei filamenti intermedi da diversi tessuti di mammiferi.

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Questo video mostra un test basato sull'imaging in vivo per determinare il declino della proteostasi dovuto all'invecchiamento. Il test utilizza Caenorhabditis elegans che esprime la proteina di fusione YFP della poliglutammina nei muscoli della parete corporea per misurare l'aggregazione della poliglutammina associata all'età e l'induzione della proteotossicità, che porta alla paralisi.

Saggio di paralisi basato su reporter fluorescente: una tecnica per valutare la formazione progressiva associata all'età di poliglutammina reporter fluorescente e paralisi associata in Caenorhabditis elegans

L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold...

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Per studiare la relazione tra omeostasi proteica, stress e invecchiamento, abbiamo monitorato i cambiamenti nel ripiegamento delle proteine seguendo la disfunzione proteica, la localizzazione delle proteine nella cellula e la stabilità delle proteine a livello di organismo, cellulare e proteico, utilizzando il metazoo geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans come sistema modello.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans come sistema modello per studiare l'omeostasi proteica in un organismo multicellulare

L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l'aggregazione di proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l'età e per determinare l'impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

Questo metodo viene descritto un approccio affidabile e riproducibile per il confronto dei livelli della proteina in tessuti differenti e timepoints inerente allo sviluppo diversi utilizzando un approccio macchiante occidentale quantitativo standardizzato.

Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.

Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans

Qui, proponiamo un metodo per ottenere in modo efficiente le singole fibre muscolari nelle prime fasi dello sviluppo post-natale dal mutante omozygoso lamin modello murino 8, un modello molto severo per la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.

Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

Il protocollo presenta il flusso di lavoro di imaging e computazionale per estrarre e validare la cromatina basata sull'imaging e l'età epigenetica (ImAge).

Misurazione dell'invecchiamento delle singole cellule con un biomarcatore basato sull'imaging della cromatina e dell'invecchiamento epigenetico

Un metodo di blotting nord modificato per misurare N 6 -methyladenosine (m 6 a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.

Un metodo per l&#39;RNA di misura<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

Impara un protocollo biochimico per isolare proteine filamentose intermedie da tessuti multipli di topo. Questo metodo consente di studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento in modo rapido e riproducibile.

Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate allinvecchiamento (Video) | JoVE Journal

Isolamento di proteine filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento

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