Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento

L'obiettivo generale di questa procedura biochimica è isolare frazioni arricchite di filamenti intermedi da più tessuti di topo al fine di studiare le modificazioni post-traduzionali delle diverse proteine dei filamenti intermedi specifici del tessuto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei filamenti intermedi, come ad esempio come la funzione e la regolazione di queste importanti proteine del citoscheletro protettive dallo stress siano influenzate durante l'invecchiamento dei mammiferi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'incorporazione di una fase di lisi tissutale automatizzata consente agli utenti di elaborare più campioni di tessuto in modo rapido ed efficiente.

Per iniziare, aggiungere un millilitro di tampone Triton X-100 ghiacciato integrato con inibitori della proteasi in un omogeneizzatore in provette di vetro e metterlo sul ghiaccio. Rimuovere un piccolo pezzo di tessuto dal deposito di azoto liquido e metterlo direttamente nell'omogeneizzatore di vetro. Quindi, mantenendo l'omogeneizzatore e il campione sempre in ghiaccio, utilizzare circa 50 colpi di una pastiglia di politetrafluoroetilene per omogeneizzare il campione riducendo al minimo la formazione di bolle.

Trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio e centrifugare il campione a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, raccogliere la frazione surnatante solubile Triton X in una provetta separata. Questa frazione può essere utilizzata per l'immunoprecipitazione e l'analisi del pool solubile di proteine IF solubili con detergente.

Quindi, al pellet di tessuto aggiungere un millilitro di tampone ad alto contenuto di sale integrato con inibitori della proteasi. Trasferiscilo in un omogeneizzatore pulito e fai 100 colpi. Trasferire nuovamente l'omogeneizzato nella provetta da microcentrifuga e posizionare la provetta su uno shaker rotante nella cella frigorifera per un'ora.

Centrifugare gli omogeneizzati a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius per 20 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone PBS EDTA ghiacciato al pellet e trasferirlo in un omogeneizzatore pulito come fase finale di pulizia. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire il campione in una nuova provetta e centrifugarlo a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti per ottenere l'estratto ad alto contenuto di sale ricco di proteine IF, o HSC.

Scartare il surnatante e sciogliere il pellet in 300 microlitri di tampone per campioni SDS preriscaldato e non riducente. Rompere inizialmente il pellet mediante pipettaggio e vortex. E poi riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Vortice e pipetta secondo necessità, per assicurarsi che il pellet sia completamente sciolto, il che potrebbe richiedere diversi minuti. Conservare tutti i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi. Per eseguire l'estrazione dell'RNA, aggiungere il tampone di lisi in una provetta contenente la matrice di lisina D, quindi aggiungere il tessuto campione al lisizzatore tissutale e pulsare due volte per 25 secondi ciascuno.

Separare il lisato dalla matrice mediante centrifugazione a 20.000 volte G.Per l'estrazione delle proteine, aggiungere Triton X-100 o tampone campione SDS se si prepara il lisato totale. In una provetta di lisina con matrice di lisina SS. Quindi, aggiungere il tessuto campione. Pulsare brevemente il campione per mescolare.

Per preparare l'HSC, utilizzare un magnete per rimuovere la perlina di acciaio inossidabile dal tubo e centrifugare le provette a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Separare le frazioni di surnatante e pellet e procedere come mostrato in precedenza nel video. Preparare il tampone PBST aggiungendo 10 microlitri di T20 a 50 millilitri di PBS pH 7,4.

Quindi preparare la soluzione di anticorpi PTM aggiungendo da uno a 10 microgrammi di anticorpi a 200 microlitri di PBST. Aliquotare 50 microlitri di perle magnetiche in una provetta per microcentrifuga. Posizionarlo sul magnete e aspirare la soluzione per la conservazione delle perline.

Coniugare le perle all'anticorpo di immunoprecipitazione risospendendo le perle nella soluzione anticorpale e incubando il campione su un rotatore a temperatura ambiente per 20 minuti. Posizionare i tubi sul magnete e aspirare la soluzione anticorpale. Quindi utilizzare 200 microlitri di PBST per sciacquare una volta le perle coniugate con anticorpi e rimuovere la soluzione.

Aggiungere da 0,6 a un millilitro di lisato tissutale alle perline. Miscelare pipettando delicatamente e incubare la soluzione su un rotatore in una cella frigorifera per tre ore. Posiziona i tubi sul magnete e rimuovi il lisato, quindi usa 200 microlitri di PBST per lavare le perle cinque volte.

Dopo l'ultima fase di lavaggio, raccogliere le perle e 100 microlitri di PBS e trasferire le perle in un nuovo tubo pulito. Posizionare il tubo sul magnete, quindi aspirare il PBS. Rimuovere la provetta dal magnete e aggiungere 100 microlitri di tampone campione non riducente.

Aliquotare 50 microlitri dalla provetta e combinarlo con 5%2ME per ottenere campioni riducenti. Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Con il tubo sul magnete, raccogli la frazione IP dalle perle e trasferiscila in un tubo nuovo.

Conservare i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi. Per evitare la contaminazione dei campioni proteici per l'analisi della spettrometria di massa, utilizzare guanti puliti per maneggiare tutti i gel e incubarli in contenitori puliti che sono stati lavati solo con DD H2O. Eseguire da 20 a 50 microlitri di campione HSE su un gel SDS secondo le condizioni standard.

Dopo aver colorato il gel secondo il protocollo di testo, posizionare il gel tra le protezioni in fogli di plastica. Quindi scansiona e contrassegna le bande che verranno asportate. Utilizzare un rasoio nuovo e pulito per asportare le bande proteiche IF e posizionare le bande in provette da microcentrifuga pulite sul ghiaccio prima di sottoporle all'analisi della spettrometria di massa.

Questa figura mostra un risultato tipico di HSE da nove tessuti murini isolati con il metodo rapido. Si noti che questo metodo non funziona bene sul pancreas e sulla milza e produce bande aggiuntive in un campione di intestino crasso. Questa analisi dell'espressione genica mostra che la cheratina 8 è sovraregolata durante l'invecchiamento.

Inoltre, i western blot mostrano che la cheratina 8 è fortemente sovraregolata nel fegato di topi anziani. Qui, un fegato HSE ottenuto utilizzando il protocollo automatizzato dimostra il forte arricchimento di cheratine 8 e 18 sul gel. L'analisi della spettrometria di massa mostra che K8 e K18 nel fegato di un topo anziano hanno più siti di fosforilazione e acetilazione che non sono presenti nel fegato del topo giovane.

Analogamente ai cambiamenti della cheratina nel fegato, l'analisi del tessuto cerebrale mediante QPCR rivela un'induzione di cinque volte dell'mRNA GFAP nel cervello di topi di 24 mesi rispetto ai topi di tre mesi. Infine, l'analisi proteica degli estratti ad alto contenuto di sale mediante colorazione di Coomassie e immuno blot delle frazioni arricchite con acetil lisina totale e rivela che la proteina GFAP è sovraregolata e acetilata nel cervello di topo invecchiato. Seguendo questa procedura, altri metodi come la miscela proteo basata sulla spettrometria di massa possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali sono le importanti modifiche post-traduzionali e i partner di legame delle proteine dei filamenti intermedi durante diverse condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le proteine dei filamenti intermedi da diversi tessuti di mammifero.