Name: Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri la microdissezione della vascolatura retinica in zebrafish tg(fli:EGFP) adulti per studiare patologie vascolari e neoangiogenesi. Questo metodo standardizzato facilita l'analisi della retinopatia diabetica.

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Gli autori vorrei ringraziare Katrin Bennewitz e Marlene Hausner per zebrafish zootecnica e assistenza tecnica. Gli autori riconoscono il supporto del Core Facility Live Cell Imaging Mannheim presso il centro per la biomedicina e Mannheim di tecnologia medica (DFG INST 91027/9-1). Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (International ricerca formazione gruppo 1874/1 "DIAMICOM", progetto SP5 e SP9; Collaborative Research Centre SFB1118, progetto B1 e Collaborative Research Centre SFB/TR23 progetto Z5).

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Modelli di neoangiogenesi retinica indotta da ipossia mostrano numeri aumentati dei punti di ramificazione, angiogenico germoglia, area vascolare totale e diminuito intercapillary distanza in zebrafish20. Questi risultati supportano l'idea che il pesce zebra è suscettibile di complicazioni microvascolari diabetiche21, come risultati chiave di successivamente retinopatia diabetica includono neoangiogenesi ipossia-mediata, che è fortemente legata alla espressione di VEGF. Cambiamenti indotti dall'iperglicemia nella retina zebrafish portano a spessore maggiorato delle navi ma mantengono la totale patterning22. Alternando l'immersione in soluzioni di glucosio per 30 giorni anche diminuisce lo spessore del IPL e INL23. L'influenza diretta di metaboliti del glucosio in zebrafish come metabolici fautori di vasculopathy anche già è stato indicato. Ulteriori hyperbranching vascolare è stata osservata nel vasculature tronco di embrioni di zebrafish dopo incubazione con methylglyoxal24. Al momento, non c'è nessun modello animale che fornisce tutti i criteri chiavi di retinopatia diabetica. Cambiamenti in anticipo si trovano spesso, ma la progressione di retinopatia diabetica proliferativa manca25. Zebrafish cade anche in questa definizione, come abbiamo visto solo neoangiogenesi ipossia-mediata o cambiamenti indotti dall'iperglicemia fino ad ora. I risultati attuali sostengono l'idea che il pesce zebra è suscettibile di cambiamenti vascolari iperglicemia-mediata e come modello animale potenzialmente può mostrare una progressione di retinopatia diabetica proliferativa. A seconda della forza e l'esposizione all'effetto di iperglicemia-mediata, il modello proprio sperimentale potrebbe condurre ad ischemia in determinate aree della retina zebrafish e promuovere neoangiogenesi come i criteri chiave di retinopatia diabetica proliferativa. Tuttavia, come zebrafish è un giocatore relativamente nuovo nel campo della modellazione a lungo termine patologie microvascolari, diabete prossimi modelli in zebrafish saranno fornire ulteriori informazioni e chiarire la sua importanza rispetto ad altri modelli e le loro patologie. Ad esempio, una in-croce di tg(gata1a:DsRed) zebrafish con eritrociti rosso-etichettati nella linea tg(fli:EGFP) potrebbe essere utilizzata contemporaneamente visualizzare i potenziali emorragie intraoculari in futuro modelli di zebrafish risultati microaneurismi come un predittore di progressione di PDR.
Poiché il sistema vascolare retinico progredisce in una successione di arcate, valutazione della distanza intervascular, numero dei punti di ramificazione e l'area vascolare totale sono correlati alla distanza dall'arteria ottica centrale. Per evitare pregiudizi nei parametri valutati vascolari, un punto di orientamento è necessario. Lo IOC è una struttura ed è altamente rilevante poiché i settori di attività vascolare si trovano nella prossimità spaziale diretta. Per valutazione coerente, la scansione della retina dovrebbe essere diviso in più sezioni di immagine rettangolare con una distanza costante al cio. L'intera retina dovrebbe essere analizzata e immagini numericamente simmetricamente distribuite. La retina di zebrafish Mostra aree con densità capillare ad alta e bassa e un'iniqua distribuzione delle sezioni di immagine può portare a ulteriori pregiudizi.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
Figura 12: presentazione di esempio di parametri vascolari come lettura di visualizzazione del sistema vascolare retinico. Misurazione della distanza intervascular (doppia freccia rossa) vicino l'ottica interna del cerchio (IOC) (A). Tre punti di ramificazione (cerchi rossi) vicino alla IOC (B). Visualizzazione del sistema vascolare retinico di zebrafish con un'area allargata (scatola rossa) mostrando un vaso germinazione (C). Diametro del vaso misurato oltre una certa distanza (doppia freccia bianca) dall'arteria centrale (croce bianca) (D). La densità del vaso è la percentuale di area retinica occupato sovrapponendo le navi (linee rosse diagonali) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per misurare la distanza intervascular, bisogna impostare una certa distanza al cio come standard (Figura 12A, bianca doppia freccia) e disegnare una linea orizzontale immaginaria (Figura 12A, riga bianca orizzontale) parallelo al cio. La distanza tra i vasi su questa linea sommati e aritmeticamente una media corrisponde alla distanza intervascular. Punti di ramificazione sono contati all'interno di ogni immagine, ogni volta che una nave si divide e più lumen vascolare continuare dal punto di origine. Questo include anche collegamenti orizzontali tra i capillari. È importante rimanere coerenti con analisi e decidere quali punti di ramificazioni di contare e mantenere queste regole in tutta l'intero esperimento per ridurre le variazioni non necessari. Germogliatura vascolare, come illustrato nella Figura 12, è un altro parametro che può essere contato in ogni immagine per valutare l'influenza sul sistema vascolare retinico. Angiogenici germogli non seguono la successione di arcade come tra arteria centrale e IOC e messa a fuoco vicino le parti esterne della retina. Per valutare alcuni diametri vaso, un punto di orientamento è sempre necessaria da cui una distanza impostata segna la misurazione spot. Origine di arteria centrale all'interno della retina fornisce tali orientamenti per i vasi del fusto principale (Figura 12D, croce bianca). L'area occupata da vasi (Figura 12E, linee diagonali rosse) come percentuale dell'area intera retinica è la densità vascolare e indirettamente correla alla zona avascolare.
Una completa scansione confocale di un campione dovrebbe essere composto da più immagini ad alto dettaglio per permettere la visualizzazione di piccole hypersprouting capillare. Per ottimizzare tempo e risorse spese in questa fase, una procedura di lavorazione automatizzata deve essere utilizzata con una profondità di scansione generale per ogni piastrella. Montaggio irregolare della retina può aumentare notevolmente il tempo impiegato per eseguire la scansione del sistema vascolare con un microscopio confocale. In un approccio ottimale uno vorrebbe solo scansione strato vascolare (Figura 13B, scatola bianca), ma l'inclusione parziale del GCL è spesso necessario.Lasciando una lunghezza in eccesso del nervo ottico dopo il troncamento, come pure i tagli per ottenere il piatto-mount essendo troppo breve, può portare a montaggio irregolare.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
Figura 13: confronto di lui macchiatura e autofluorescenza nella retina zebrafish adulto. Sistema vascolare retinico a fuoco sopra la GCL (A). Vasculature retinico (scatola bianca) mostrando verde un segnale EGFP e strati retinici esibendo forte autofluorescenza ((B)). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come la preparazione adeguata del vasculature retinico di zebrafish ha bisogno di una formazione preliminare, un campione di piccole dimensioni con dissettore inesperti e fortemente di variazione risultati di preparazione sono una limitazione principale della tecnica. Mentre la preparazione del tg(fli:EGFP) dello zebrafish dà veloce informazioni sullo stato del sistema vascolare, la tecnica utilizza ancora circa 20 min di tempo lavoro per retina per un ricercatore esperto. Tutti questi passaggi di preparazione per il sistema vascolare retinico devono essere eseguiti sotto un microscopio per dissezione e dissettori necessità di rimanere concentrato tutto il tempo come un passo incauto può potenzialmente indurre rottura del vaso. Il dissettore dovrebbe praticare regolarmente come assenza prolungata dalla preparazione riduce la probabilità di un dissettore di mantenimento dell'integrità del vaso.
Inoltre, ulteriore lettura tramite immunoistochimica (IHC) è ancora limitata, come solo un piccolo numero di anticorpi convalidati sul tessuto umano e del roditore stanno lavorando con il danio zebrato. Gli sperimentatori interessati in IHC si consiglia di cercare gli anticorpi specifici di zebrafish, specialmente quando si lavora con nuovi obiettivi. In alternativa, si consiglia di utilizzare linee di reporter di zebrafish aggiuntive che sono utili per studiare le cellule di là del sistema vascolare nell'occhio. Questa strategia, tuttavia, è che richiede tempo, come ci vogliono un paio di mesi per generare linee di zebrafish adulto che trasportano più giornalisti transgenici.
Tuttavia, il pesce zebra pone una serie di vantaggi. Sono relativamente piccoli e si riproducono facilmente. Possono crescere rapidamente a stadi adulti e i loro embrioni sono ottimali per lo screening di stupefacenti. Il campo è prontamente in crescita e più letteratura è sempre accessibile. Con la capacità di generare knockouts gene ad una velocità rapida e un'abbondanza di linee di transgene fluorescenza reporter, la scelta per zebrafish è trattenuta solo dalla domanda di ricerca selezionate.

Il diabete mellito è una malattia metabolica definita dall'iperglicemia derivanti dalla secrezione di insulina disfunzionali o risposta inadeguata dei tessuti ad insulina secreta. L'OMS stima che 422 milioni di adulti erano affette da diabete mellito in 20141 e la prevalenza del diabete in tutto il mondo è destinata ad aumentare a 8-10% della popolazione fino al 20352, rendendo diabete uno dei settori chiave della ricerca nella prossimi decenni. Vivere con alta glicemia cronica conduce alle complicazioni microvascolari a lungo termine, compreso la polineuropatia, la nefropatia e la retinopatia diabetica. La gestione e la prevenzione di queste complicazioni sono difficili; Infatti, il diabete sta diventando la causa più frequente della malattia renale di stadio finale (ESRD), che conduce alla dialisi2, e il diabete è la principale causa di cecità fra gli adulti di mezza età3.
Le cause iniziali di danno microvascolare in occhio diabetico sono iperglicemia cronica, alterazioni metaboliche, nonché a determinati fattori di rischio (ad es., ipertensione, dislipidemia), che conducono alla disfunzione endoteliale vascolare, Pericita dropout, e regressione capillare che si traduce in maniche vascolare acellulare. La risultante ischemia retinica è la causa della neovascolarizzazione e aumento della permeabilità vascolare promuovendo lo sviluppo di retinopatia diabetica proliferativa (PDR)4. Retinopatia diabetica generalmente è stata rilevata nel 37% dei pazienti affetti da diabete, mentre avvistare-minacciosa la retinopatia diabetica è stata accertata nel 12% della coorte europea bianco schermato in UKADS Studio5. Il trattamento attuale può solo impedire ulteriori complicazioni e non è in grado di ripristinare completamente il danno già indotto. Il photocoagulation di panretinal, oltre al controllo glicemico, è la terapia standard per retinopatia diabetica proliferative (PDR) ma colpisce il tessuto sano adiacente pure. Gli interventi anti-VEGF mostrano risultati promettenti come alternative al laser trattamento6,7, ma in ultima analisi, terapia specializzata, mirata e nuovi farmaci sono necessari per gestire il crescente numero di pazienti a rischio di perdita di visione.
I modelli di ricerca animale di retinopatia diabetica non condividono tutti gli aspetti della fisiopatologia umana. L'utilizzazione delle specie corretta per soddisfare i requisiti specifici della questione ricerca scientifica è una delle parti più notevoli del setup sperimentale. L'embrione di pesce zebra (Danio rerio) è già ampiamente usato nella ricerca inerente allo sviluppo e fornisce uno sfondo di pratico ottimo per atterramento o knockout specifici geni via morpholinos o la tecnica CRISPR/Cas98. Questi metodi possono essere facilmente utilizzati in zebrafish per studiare i geni, che sono stati identificati dagli studi di associazione genome-wide su larga scala (GWAS), generando visioni particolari meccanismi di progressione di malattia e di suscettibilità9. Breve tempo generazionale, grandi quantità di prole, facile e basso costo gestione e un crescente supporto di dosaggio hanno aumentato la rilevanza del modello zebrafish, soprattutto dato il suo grande potenziale per la modellazione di malattia metabolica. Conservazione dei meccanismi biologici in zebrafish è stato indicato come base per lo sviluppo di terapie farmacologiche. Ad esempio, la metformina della droga antidiabetica e ipocolesterolemizzante simvastatina sono stati indicati per "trattare" le condizioni in modelli di campo/desametasone-indotto alto PEPCK espressione e ricca in colesterolo ipercolesterolemia indotta da dieta10 , 11 , 12. questa intuizione avanza in overarching meccanismi metabolici conservati è ulteriormente supportata dal crescente numero di modelli di diabete di zebrafish, attraverso esperimenti come: alternando incubazione in soluzioni di glucosio, Streptozotocin-indotti ablazione delle cellule beta, ablazione nitroreductase-mediata delle cellule beta utilizzando il metronidazolo profarmaco, diabete monogenico mediato via atterramento gene pdx1 o ad eliminazione diretta, nonché modelli di resistenza di insulina aumentata in muscolo scheletrico 12. questi già stabiliti i protocolli, le specifiche di cui sopra della specie, e la capacità di manipolare in modo efficiente il genoma in un gran numero di campioni tutti dimostrare i vantaggi di zebrafish per studiare i meccanismi Guida di processi complessi di malattia come pure la capacità alla schermata per interventi farmacologici.
Una conoscenza generale dell'anatomia dell'occhio zebrafish base (Figura 1) è necessaria per il dissettore per utilizzare zebrafish come modello per Angiopatia retinica. L'occhio di zebrafish ha sei muscoli estrinseci, quattro retto e due muscoli obliqui che inserire sulla parte esterna del globo a sclera13. La cornea è il tessuto trasparente che copre la lente e continua direttamente nella sclera, che costituisce il guscio esterno dell'occhio. La sclera non è trasparente, ha una superficie riflettente parzialmente chiaro ed è fortemente pigmentata. Lo stesso obiettivo è più sferica rispetto alla controparte umana. La retina è costituita da tre strati nucleari delle cellule neuronali mentre il vasculature retinico fornendo ossigeno è associato molto attentamente con lo strato delle cellule del ganglio interna ma non forma una rete subretinal. Vasi coroideali, al contrario, si trovano tra la sclera e la retina e sono associati con l'epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa rete capillare fornisce ossigeno alla parte esterne della retina14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
Figura 1: rappresentazione schematica dell'occhio adulto zebrafish. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Semplice visualizzazione del vasculature retinico può avvenire tramite utilizzazione del zebrafish transgenici tg(fli:EGFP) linea15. La proteina fluorescente verde espressa sotto il controllo del promotore fli in cellule endoteliali del sistema vascolare è la base per la visualizzazione tramite un microscopio in successivi passaggi di scansione laser. Questo risultato è ottenuto tramite la dissezione della retina zebrafish e intero-montaggio del tessuto. Questo modello transgenico consente una lettura veloce vascolare senza alcuna applicazione di etichettatura intravascolare o intero-monta immunohistochemistry. Per analizzare la retinopatia diabetica in zebrafish, una routine di preparazione passo dopo passo e standardizzato deve essere utilizzata da ogni dissettore.Il seguente protocollo di preparazione fornisce altri gruppi di ricerca la possibilità di valutare facilmente i cambiamenti vascolari nei vasi esposti dell'occhio adulto zebrafish e fornire indicazioni per stabilire una routine di dissezione ottimizzata per la retina di zebrafish.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Sodio diidrogeno fosfato</td><td>Roth</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato sale metanosolfonato (MS-222,Tricaina)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo-Fischer</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Greiner Bio one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a sei pozzetti</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Ago</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinzetta</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Forbice per microdissezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Carl Roth</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 22mmx22mm</td><td>neoLab</td><td></td><td></td>103512222</tr><tr><td>bisturi</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Illumination</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza MZ10 F</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser SP5 DS</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio M80</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Linea Zebrafish: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td><td>NA</td><td>NA vedi</td><td>riferimento 15</td></tr><tr><td>Mayer' s ematossilina</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0,5% eosina</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9% etanolo</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Merck</td><td>1,071,501,000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

lo studio diabete through the eyes of un pesce: microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:egfp) adulto vasculature retinico zebrafish

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

La retinopatia diabetica è la principale causa di cecità fra gli adulti di mezza età. La crescente prevalenza del diabete in tutto il mondo farà la prevenzione delle complicazioni microvascolari diabetiche uno dei settori chiave della ricerca dei prossimi decenni. Terapia specializzata, mirata e droghe terapeutiche novelle sono necessarie per gestire il crescente numero di pazienti a rischio di perdita di visione. Zebrafish è un modello animale stabilito per le domande di ricerca inerente allo sviluppo con l'aumento di rilevanza per la modellazione di processi metabolici di malattia multifattoriale. I vantaggi della specie consentono una visualizzazione ottimale e approcci, combinati con la forte capacità di sfondamento di geni di interesse di screening di stupefacenti a resa elevata. Qui, descriviamo un protocollo che permetterà di facilitare l'analisi del vasculature retinico adulto tg(fli:EGFP) zebrafish come una lettura veloce nelle impostazioni delle patologie vascolari a lungo termine collegate a danno di neoangiogenesi o nave. Questo risultato è ottenuto tramite la dissezione della retina zebrafish e intero-montaggio del tessuto. Visualizzazione dei vasi esposti è quindi ottenuta tramite microscopia confocale del reporter EGFP verde espresso nel vasculature retinico adulto. Corretta gestione del tessuto porterà a risultati migliori e meno rottura del vaso interno per assicurare la visualizzazione della struttura vascolare inalterata. Il metodo può essere utilizzato nei modelli di zebrafish di vasculopatia retinica collegata ai cambiamenti nell'architettura della nave, nonché di neoangiogenesi.

Qui dimostriamo due esempi tipici morfologici del vasculature retinico in zebrafish adulto tg(fli:EGFP): una volta visualizzato con un microscopio a fluorescenza (Figura 9A) e una volta con un laser confocale a scansione microscopio (figura 9B). La struttura retinica rivelata Mostra un modello altamente organizzato. Forte autofluorescenza è visto nella retina zebrafish, quando visualizzato con un microscopio a fluorescenza. Dunque, una visualizzazione del solo livello vascolare tramite una scansione confocale è consigliata di ridurre la fluorescenza di fondo ed aumentare il contrasto. Acquisizione di foto e situazioni in cui i dati qualitativi sono abbastanza più rapida, il microscopio a fluorescenza è un'alternativa attraente.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
Figura 9: immagini rappresentative del sistema vascolare retinico di zebrafish adulto tg(fli:EGFP). Sono mostrati due esempi tipici morfologici del vasculature retinico: l'arteria ottica centrale si diffonde nei vasi principali 5-7, che poi la diramazione in un susseguirsi di portici. Tutte le maggiori navi drenaggio nella vena della circonferenza (CV) limitando la parte esterna di ogni petalo. Visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza a 2,5 x ingrandimento (A). Visualizzazione del vasculature retinico di laser confocale microscopia attraverso una scansione di mattonelle di 5 x 5 singola immagine combinata (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'arteria ottica penetra la retina alla testa del nervo ottico e, nella maggior parte dei campioni, si diffonde in 5-7 vasi principali (Figura 10A). I vasi principali quindi la diramazione in un susseguirsi di portici e connettersi a ottico cerchio interno (IOC), chiamato anche la vena della circonferenza (CV), che circondano il disco ottico nella periferia della retina montata piatta (Vedi figura 10B). Il cio è il vaso venoso che drena il sangue arterioso al bordo interno del globo oculare (bulbus oculi). Il sistema vascolare retinico di zebrafish Mostra anche aree di elevata attività vascolare con ramificazione dei capillari e angiogenici germogliatura (Figura 10). Questa attività vascolare è per lo più situata nei pressi del cio. È importante notare che lo stesso occhio può dimostrare sia alta e bassa vascolare attività in diverse regioni della retina (confronta figura 10B e Figura 10). In generale, il sistema vascolare retinico di zebrafish Mostra avascular più spazio e meno capillari tra i rami principali rispetto a, per esempio, la retina di topi17. Entrambi gli occhi di ogni campione devono essere analizzati perché il sistema vascolare può variare in mezzo e singolare ispezione può portare a pregiudizi.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
Figura 10: ingrandita aree di visualizzazione di sistema vascolare retinico zebrafish adulto tg(fli:EGFP). L'arteria ottica ramificazione in vasi principali (A). Capillari retinici in un'area di bassa attività vascolare collegamento parte della cerchia di ottica (IOC) nella parte inferiore dell'immagine (B). Capillari retinici in un'area di alta attività vascolare collegamento allo IOC (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Un'architettura altamente conservata di un neurone strati è già presente in zebrafish da circa 72 h post fertilizzazione (hpf) in poi18. La retina di zebrafish adulto Mostra i seguenti strati dall'interno verso l'esterno (Figura 11): strato delle cellule del ganglio (GCL), strato plessiforme interno (IPL), strato nucleare interno (INL), strato plexiform esterno (OPL), strato nucleare esterno (ONL), strato di fotoricettore (PL), e l'epitelio pigmentato retinico (RPE). La stima dei parametri vascolari da visualizzazione sistema vascolare retinico è illustrata nella Figura 12. Sistema vascolare retinico interno è situato sul livello delle cellule del ganglio (GCL) (Figura 13B, scatola bianca) mentre il coroidico capillari sarebbe associati con l'epitelio pigmentato retinico (RPE).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
Figura 11: egli macchiatura dell'occhio adulto zebrafish. Panoramica della sezione trasversale dell'occhio intero dopo la rimozione della lente (A). Strati retinici di zebrafish adulto eye19 (B). Indicazione (freccia nera) del naturale punto di rottura in PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Discutiamo qui, un protocollo di metodo che vi permetterà una facile analisi del vasculature retinico adulto tg(fli:EGFP) zebrafish come una lettura veloce nelle impostazioni delle patologie vascolari a lungo termine legate alla neoangiogenesi e cambiamenti strutturali.

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di dissezione per il sistema vascolare retinico adulto di zebrafish è quello di fornire una lettura rapida in contesti di patologie vascolari a lungo termine legate alla neoangiogenesi e ai cambiamenti strutturali tramite fluorescenza o microscopia confocale a scansione laser. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle complicanze microvascolari come lo sviluppo della retinopatia diabetica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intera retinovascolarizzazione può essere presentata e analizzata in processi fisiologici e patologici senza alcuna applicazione di fluorescenza intervascolare in modo relativamente veloce e standardizzato.Per iniziare, trasferisci sei millilitri di soluzione di PFA PBS al quattro percento appena preparata per campione nei pozzetti di sei piastre a pozzetti. Dopo l'eutanasia del pesce zebra adulto secondo il protocollo di testo, posizionarlo su carta assorbente fresca e asciugarlo. Usa un bisturi e taglia le teste dietro l'opercolo.Trasferite poi le teste direttamente nei pozzetti del fissativo appena preparato. Conservare le piastre contenenti le teste dei pesci a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore per garantire che il fissativo penetri negli strati retinici più profondi. Con il due percento di agarosio riscaldato, riempire una capsula di Petri fino a un terzo e attendere che l'agar sia sodo.Coprire la piastra di agar con un X PBS per creare uno spazio di lavoro per sezionare gli occhi. Trasferire il campione fissato nella piastra di Petri. E tenendo la testa sulla superficie tagliata con una pinzetta, inserisci un'altra pinzetta appuntata insieme sotto il bulbo oculare nella cavità orbitale.Apri lentamente la pinzetta sotto l'occhio e afferra il nervo ottico. Quindi strappare e staccare con cura l'occhio. Per rimuovere uno qualsiasi dei quattro muscoli retti e due muscoli extraoculari obliqui collegati all'occhio, nonché il tessuto extraoculare residuo che collega l'occhio alla cavità orbitale, trattenere l'occhio attraverso una pinzetta semichiusa e afferrare la struttura con l'altra pinzetta utilizzare un movimento diametrale per strapparla dolcemente.Quindi, utilizzare un ago usa e getta calibro 27 per perforare la cornea nella gamma esterna. Attraverso questa apertura, usa entrambe le pinzette per tenere la cornea e strapparla leggermente. Quindi lavora attentamente per creare una lacrima centrata delle dimensioni della rispettiva pupilla.Applicare pressione sul lato corneale del globo oculare in corrispondenza del bordo corneale esterno sopra l'iride. Questo creerà una piccola ammaccatura e spingerà la lente all'altezza della lacrima corneale. Quindi fai scorrere le pinzette sotto l'obiettivo e rimuovilo.Quindi, capovolgi l'occhio con il nervo ottico rivolto verso l'alto. Si noti che la sclera e la cornea sono collegate e formano la tunica fibrosa del bulbo oculare per proteggere la retina a forma di coppa. Questo guscio, indicato come corneosclera, risparmia l'area intorno al nervo ottico.Inserire un ago in questa interruzione per creare un'apertura tra la sclera e la retina. Quindi, utilizzando questo accesso con entrambe le pinzette, strappare con cura la sclera assialmente in strisce per aumentare l'apertura attorno al nervo ottico. Fare attenzione a mantenere intatta la corneosclera nel passaggio alla circonferenza laterale corneale.Prima di rimuovere la corneosclera dal tessuto intraoculare rimanente, cerca di sedurre eventuali connessioni, poiché l'attaccamento ad altre strutture sarà un punto critico. Quindi tenere la sclera con una pinzetta e, afferrando il nervo ottico con l'altro e tirandolo via, rimuovere completamente la corneosclera dall'occhio e gettarla. Questo passaggio fornirà una struttura a forma di coppa costituita dall'uvea e dalla retina contenente il sistema vascolare retinico.Quindi, crea una rottura nello strato coroideale e RPE tenendo un ago calibro 27 lateralmente alla coppetta rimanente mentre raschia la superficie esterna con il bordo della punta dell'ago. Usa la rottura come punto di accesso per afferrare lo strato coroideale e RPE e usa entrambe le pinzette per strapparlo a strisce mantenendo intatta la connessione con l'iride. Successivamente, fai scorrere una pinzetta sotto l'iride e spostala in un circuito dall'esterno, creando tensione tirando lo strato coroideale e RPE fuori produzione e staccando la struttura combinata.Se parti dell'iride non possono essere rimosse e rimangono collegate alla retina a forma di coppa dopo la rimozione dello strato coroideale e RPE, utilizzare un altro punto di rottura naturale che l'occhio adulto del pesce zebra mostra all'interno dello strato dei fotorecettori. In modo simile è stato appena dimostrato di rimuovere l'iride. Raschiare la retina a forma di coppa rimanente per indurre interruzioni nello strato dei fotorecettori.Quindi utilizzare l'accesso creato per rimuovere il livello mantenendo intatta la possibile connessione con l'iride. Successivamente, fai scorrere le pinzette sotto l'iride e continua in un circuito come mostrato in precedenza in questo video per staccare la struttura combinata. È fondamentale scollegare l'iride dal suo tessuto sottostante in modo sensato in quanto bloccherà la fluorescenza direttamente sopra il cerchio ottico interno durante la visualizzazione dei vasi.Un approccio troppo diretto può portare alla rottura del vaso. Quindi utilizzare le forbici a molla per microdissezione con un tagliente dritto di due punte da cinque millimetri per tagliare il nervo ottico il più vicino possibile alla retina. Ciò consentirà un migliore montaggio piatto del tessuto.Per montare e visualizzare il sistema vascolare retinico, utilizzare un X PBS per lavare la retina sezionata due volte per cinque minuti ciascuna. Metti una goccia di PBS su un vetrino. Quindi, utilizzando una spatola da laboratorio con l'estremità di un microcucchiaio, trasferisci la retina nella gocciolina.Con una pinzetta mantieni il tessuto in posizione mentre usi un bisturi per tagliare la struttura a forma di coppa per creare una forma piatta a quattro o cinque petali, a seconda delle dimensioni della retina. Con un foglio di carta sottile aspirare il PBS rimasto, facendo attenzione a non toccare la retina. Quindi rivestire la retina montata piatta con un mezzo di montaggio e coprirla con il vetrino coprioggetti.Fai attenzione a non creare schiuma poiché le bolle d'aria possono distorcere la visualizzazione dei vasi retinici. Usa lo smalto per unghie per sigillare il coperchio. Infine, eseguire la microscopia a fluorescenza o a scansione laser per visualizzare la vascolarizzazione retinica.Qui è mostrato un esempio morfologico della vascolarizzazione retinica nel pesce zebra EGFP della mosca transgenica adulta visualizzato con un microscopio a fluorescenza e un secondo esempio ripreso con un microscopio a scansione laser confocale che riduce la fluorescenza di fondo. La struttura retinica rivelata mostra un modello altamente organizzato. L'arteria ottica penetra nella retina in corrispondenza della testa del nervo ottico e, nella maggior parte dei campioni, si diffonde in cinque o sette vasi principali.I vasi principali si ramificano quindi in una successione di arcate e si collegano al cerchio ottico interno o IOC, chiamato anche vena circonferenziale, che circonda il disco ottico alla periferia della retina montata piatta. La retina adulta del pesce zebra è composta dai seguenti strati dall'interno verso l'esterno. Lo strato delle cellule ganglionari, lo strato plessiforme interno, lo strato nucleare interno, lo strato plessiforme esterno, lo strato nucleare esterno, lo strato fotorecettore e l'epitelio pigmentato retinico.La stima dei parametri vascolari dalla visualizzazione della vascolarizzazione retinica è mostrata qui. Il sistema vascolare retinico interno è situato sullo strato di cellule gangliari mentre i capillari cordiali sarebbero associati all'epitelio pigmentato della retina. Una volta allenata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 20 minuti se eseguita correttamente.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di esercitarsi regolarmente poiché l'assenza prolungata dalla preparazione riduce l'esito dell'integrità del vaso. A seguito di questa procedura, il diabete e le patologie neurovascolari possono essere analizzati nel pesce zebra adulto.

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