Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

L'obiettivo generale di questo protocollo di dissezione per il sistema vascolare retinico adulto di zebrafish è quello di fornire una lettura rapida in contesti di patologie vascolari a lungo termine legate alla neoangiogenesi e ai cambiamenti strutturali tramite fluorescenza o microscopia confocale a scansione laser. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle complicanze microvascolari come lo sviluppo della retinopatia diabetica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intera retinovascolarizzazione può essere presentata e analizzata in processi fisiologici e patologici senza alcuna applicazione di fluorescenza intervascolare in modo relativamente veloce e standardizzato.

Per iniziare, trasferisci sei millilitri di soluzione di PFA PBS al quattro percento appena preparata per campione nei pozzetti di sei piastre a pozzetti. Dopo l'eutanasia del pesce zebra adulto secondo il protocollo di testo, posizionarlo su carta assorbente fresca e asciugarlo. Usa un bisturi e taglia le teste dietro l'opercolo.

Trasferite poi le teste direttamente nei pozzetti del fissativo appena preparato. Conservare le piastre contenenti le teste dei pesci a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore per garantire che il fissativo penetri negli strati retinici più profondi. Con il due percento di agarosio riscaldato, riempire una capsula di Petri fino a un terzo e attendere che l'agar sia sodo.

Coprire la piastra di agar con un X PBS per creare uno spazio di lavoro per sezionare gli occhi. Trasferire il campione fissato nella piastra di Petri. E tenendo la testa sulla superficie tagliata con una pinzetta, inserisci un'altra pinzetta appuntata insieme sotto il bulbo oculare nella cavità orbitale.

Apri lentamente la pinzetta sotto l'occhio e afferra il nervo ottico. Quindi strappare e staccare con cura l'occhio. Per rimuovere uno qualsiasi dei quattro muscoli retti e due muscoli extraoculari obliqui collegati all'occhio, nonché il tessuto extraoculare residuo che collega l'occhio alla cavità orbitale, trattenere l'occhio attraverso una pinzetta semichiusa e afferrare la struttura con l'altra pinzetta utilizzare un movimento diametrale per strapparla dolcemente.

Quindi, utilizzare un ago usa e getta calibro 27 per perforare la cornea nella gamma esterna. Attraverso questa apertura, usa entrambe le pinzette per tenere la cornea e strapparla leggermente. Quindi lavora attentamente per creare una lacrima centrata delle dimensioni della rispettiva pupilla.

Applicare pressione sul lato corneale del globo oculare in corrispondenza del bordo corneale esterno sopra l'iride. Questo creerà una piccola ammaccatura e spingerà la lente all'altezza della lacrima corneale. Quindi fai scorrere le pinzette sotto l'obiettivo e rimuovilo.

Quindi, capovolgi l'occhio con il nervo ottico rivolto verso l'alto. Si noti che la sclera e la cornea sono collegate e formano la tunica fibrosa del bulbo oculare per proteggere la retina a forma di coppa. Questo guscio, indicato come corneosclera, risparmia l'area intorno al nervo ottico.

Inserire un ago in questa interruzione per creare un'apertura tra la sclera e la retina. Quindi, utilizzando questo accesso con entrambe le pinzette, strappare con cura la sclera assialmente in strisce per aumentare l'apertura attorno al nervo ottico. Fare attenzione a mantenere intatta la corneosclera nel passaggio alla circonferenza laterale corneale.

Prima di rimuovere la corneosclera dal tessuto intraoculare rimanente, cerca di sedurre eventuali connessioni, poiché l'attaccamento ad altre strutture sarà un punto critico. Quindi tenere la sclera con una pinzetta e, afferrando il nervo ottico con l'altro e tirandolo via, rimuovere completamente la corneosclera dall'occhio e gettarla. Questo passaggio fornirà una struttura a forma di coppa costituita dall'uvea e dalla retina contenente il sistema vascolare retinico.

Quindi, crea una rottura nello strato coroideale e RPE tenendo un ago calibro 27 lateralmente alla coppetta rimanente mentre raschia la superficie esterna con il bordo della punta dell'ago. Usa la rottura come punto di accesso per afferrare lo strato coroideale e RPE e usa entrambe le pinzette per strapparlo a strisce mantenendo intatta la connessione con l'iride. Successivamente, fai scorrere una pinzetta sotto l'iride e spostala in un circuito dall'esterno, creando tensione tirando lo strato coroideale e RPE fuori produzione e staccando la struttura combinata.

Se parti dell'iride non possono essere rimosse e rimangono collegate alla retina a forma di coppa dopo la rimozione dello strato coroideale e RPE, utilizzare un altro punto di rottura naturale che l'occhio adulto del pesce zebra mostra all'interno dello strato dei fotorecettori. In modo simile è stato appena dimostrato di rimuovere l'iride. Raschiare la retina a forma di coppa rimanente per indurre interruzioni nello strato dei fotorecettori.

Quindi utilizzare l'accesso creato per rimuovere il livello mantenendo intatta la possibile connessione con l'iride. Successivamente, fai scorrere le pinzette sotto l'iride e continua in un circuito come mostrato in precedenza in questo video per staccare la struttura combinata. È fondamentale scollegare l'iride dal suo tessuto sottostante in modo sensato in quanto bloccherà la fluorescenza direttamente sopra il cerchio ottico interno durante la visualizzazione dei vasi.

Un approccio troppo diretto può portare alla rottura del vaso. Quindi utilizzare le forbici a molla per microdissezione con un tagliente dritto di due punte da cinque millimetri per tagliare il nervo ottico il più vicino possibile alla retina. Ciò consentirà un migliore montaggio piatto del tessuto.

Per montare e visualizzare il sistema vascolare retinico, utilizzare un X PBS per lavare la retina sezionata due volte per cinque minuti ciascuna. Metti una goccia di PBS su un vetrino. Quindi, utilizzando una spatola da laboratorio con l'estremità di un microcucchiaio, trasferisci la retina nella gocciolina.

Con una pinzetta mantieni il tessuto in posizione mentre usi un bisturi per tagliare la struttura a forma di coppa per creare una forma piatta a quattro o cinque petali, a seconda delle dimensioni della retina. Con un foglio di carta sottile aspirare il PBS rimasto, facendo attenzione a non toccare la retina. Quindi rivestire la retina montata piatta con un mezzo di montaggio e coprirla con il vetrino coprioggetti.

Fai attenzione a non creare schiuma poiché le bolle d'aria possono distorcere la visualizzazione dei vasi retinici. Usa lo smalto per unghie per sigillare il coperchio. Infine, eseguire la microscopia a fluorescenza o a scansione laser per visualizzare la vascolarizzazione retinica.

Qui è mostrato un esempio morfologico della vascolarizzazione retinica nel pesce zebra EGFP della mosca transgenica adulta visualizzato con un microscopio a fluorescenza e un secondo esempio ripreso con un microscopio a scansione laser confocale che riduce la fluorescenza di fondo. La struttura retinica rivelata mostra un modello altamente organizzato. L'arteria ottica penetra nella retina in corrispondenza della testa del nervo ottico e, nella maggior parte dei campioni, si diffonde in cinque o sette vasi principali.

I vasi principali si ramificano quindi in una successione di arcate e si collegano al cerchio ottico interno o IOC, chiamato anche vena circonferenziale, che circonda il disco ottico alla periferia della retina montata piatta. La retina adulta del pesce zebra è composta dai seguenti strati dall'interno verso l'esterno. Lo strato delle cellule ganglionari, lo strato plessiforme interno, lo strato nucleare interno, lo strato plessiforme esterno, lo strato nucleare esterno, lo strato fotorecettore e l'epitelio pigmentato retinico.

La stima dei parametri vascolari dalla visualizzazione della vascolarizzazione retinica è mostrata qui. Il sistema vascolare retinico interno è situato sullo strato di cellule gangliari mentre i capillari cordiali sarebbero associati all'epitelio pigmentato della retina. Una volta allenata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 20 minuti se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di esercitarsi regolarmente poiché l'assenza prolungata dalla preparazione riduce l'esito dell'integrità del vaso. A seguito di questa procedura, il diabete e le patologie neurovascolari possono essere analizzati nel pesce zebra adulto.