Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata
23 giugno 2018
Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.
Questo metodo può aiutare a risolvere le principali sfide nel trapianto di isole pancreatiche, come l'immunorigetto, la rivascolarizzazione post-trapianto e la sopravvivenza. I principali vantaggi di questa tecnica è che questo approccio facile da adottare consente l'ingegneria di superficie delle cellule viventi rimodellando il paesaggio cellulare delle isole pancreatiche, migliorando la funzione dell'innesto, la sopravvivenza e, in ultima analisi, l'efficacia terapeutica del trapianto di isole. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie cellulari perché l'esito terapeutico delle terapie cellulari è limitato anche dalla bassa ritenzione cellulare e dalla scarsa sopravvivenza.
A dimostrare questa procedura è Jingyi Yang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prima cosa, pesare 6,9 grammi di eparina e scioglierla in 2 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo Eppendorf. Sciogliere 0,23 grammi di NHS in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in una provetta Eppendorf.
Quindi, sciogliere 0,77 grammi di EDC in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo conico da 50 millilitri. Miscelare le soluzioni NHS ed EDC in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver lasciato la soluzione miscelata a temperatura ambiente per 30 minuti, centrifugarla a 12.000 giri/min per 10 minuti per rimuovere l'EDC e l'NHS in eccesso.
Successivamente, aggiungere 30 millilitri di etanolo freddo alla soluzione e centrifugare a 12.000 giri/min per 10 minuti. Ora, aggiungi 1 millilitro di coadiuvante starPEG MI al 10% a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere 0,67 millilitri di soluzione di eparina NHS al 10% allo stesso tubo conico da 50 millilitri.
Mettere la soluzione miscelata in un incubatore a 25 gradi Celsius per 20 minuti per ottenere una soluzione viscosa e limpida. Prelevare 200 isole di topo precedentemente estratte al microscopio da dissezione e trasferirle in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di PBS alle isole e centrifugare a 1.200 giri/min per un minuto a quattro gradi centigradi.
Rimuovere il surnatante, aggiungere 250 microlitri della soluzione di eparina PEG e mettere il composto sul ghiaccio per 10 minuti. Pipettare su e giù per consentire alle isole di mescolarsi bene con la soluzione di eparina PEG. Successivamente, centrifugare la miscela a 1, 200 giri/min per un minuto.
Quindi, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di PBS. Pipettare su e giù per mescolare bene. Dopo aver centrifugato a 1, 200 giri/min per un minuto, rimuovere il surnatante e conservare le isole per un ulteriore utilizzo.
Successivamente, aggiungere uno o due millilitri di RPM I 1640, integrato con il 10% di FBS alle isole rivestite. E trasferisci queste isole in una piastra di coltura batterica sterile non carica. Infine, osservare la morfologia e i segnali fluorescenti delle isole rivestite di FAM-eparina-PEG al microscopio a fluorescenza invertita.
Picchi caratteristici di eparina, corrispondenti ai gruppi HYDROXAL, sono stati osservati nello spettro FTIR del nanorivestimento eparina-PEG. La diminuzione dell'ampiezza di questi picchi rappresenta la coniugazione tra i gruppi ammidici coadiuvanti stella-PEG MI e il gruppo carbonico eparina. Anche il picco corrispondente alla vibrazione di stiramento ammidico carbonale è stato ridotto, indicando una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato di eparina con il sucinimiato succinimiale e l'ammina coadiuvante star-PEG.
La scansione di dati al microscopio elettronico mostra la struttura porosa altamente interconnessa del nanorivestimento eparina-PEG, suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza cellulare durante la somministrazione in vivo. Un sottile strato di nanorivestimento, mostrato dalla fluorescenza verde, è stato depositato uniformemente sulla superficie delle isole rivestite, senza causare cambiamenti evidenti sul volume o sulle dimensioni delle isole. Le isole di topo rivestite di eparina PEG hanno mostrato una robusta vitalità delle isole in coltura.
Una formazione vascolare significativamente più avanzata era evidente dalle cellule endoteliali delle isole che sono state co-coltivate con isole rivestite di eparina-PEG, indicate da strutture allungate simili a microvasi e strutture vascolari a rete. Un basso livello di secrezione di insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando le isole sono state perfuse con una soluzione salina fisiologica, integrata con un livello substimolante di glucosio. Quando le isole sono state stimolate con un livello superfisiologico di glucosio, è stato osservato un aumento della secrezione di insulina.
Una volta padroneggiato, il rivestimento può essere eseguito in un minuto se viene eseguito correttamente per preservare la vitalità dell'isola.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per l'ingegnerizzazione di superficie degli isolotti pancreatici utilizzando un nano-rivestimento starPEG incorporato di eparina. Questa tecnica mira a migliorare gli esiti del trapianto di isolotti migliorando la funzione e la sopravvivenza dell'innesto.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Terapie basate sulle cellule
- Biologia del trapianto
- Ingegneria di superficie
Sfondo
- Il trapianto di isolotti pancreatici affronta sfide come l'immuno-rigetto e la scarsa sopravvivenza degli isolotti.
- Migliorare il panorama cellulare degli isolotti può aumentare l'efficacia terapeutica.
- Il nano-rivestimento eparina-PEG offre una potenziale soluzione a queste sfide.
- Questo metodo è facile da adottare e può essere eseguito rapidamente.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica di rivestimento che migliora la sopravvivenza e la funzione degli isolotti pancreatici.
- Affrontare i problemi legati alla bassa ritenzione cellulare nelle terapie basate sulle cellule.
- Dimostrare l'efficacia del nano-rivestimento eparina-PEG nel migliorare gli esiti del trapianto di isolotti.
Metodi utilizzati
- Preparazione di soluzioni di eparina e NHS.
- Miscuglio di soluzioni NHS ed EDC per il nano-rivestimento.
- Rivestimento degli isolotti di topo con la soluzione eparina-PEG.
- Osservazione della morfologia e della vitalità degli isolotti sotto un microscopio a fluorescenza.
Risultati principali
- Gli isolotti rivestiti con eparina-PEG hanno mostrato una migliore vitalità in coltura.
- È stata osservata una formazione vascolare migliorata nelle cellule endoteliali degli isolotti in co-coltura.
- La secrezione di insulina era reattiva alla stimolazione del glucosio negli isolotti rivestiti.
- Il rivestimento non ha alterato significativamente il volume o la dimensione degli isolotti.
Conclusioni
- Il nano-rivestimento eparina-PEG è un metodo promettente per migliorare il trapianto di isolotti.
- Questa tecnica potrebbe migliorare l'efficacia delle terapie basate sulle cellule.
- Le applicazioni future potrebbero estendersi ad altri tipi di cellule che richiedono ingegnerizzazione di superficie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
