Name: Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Scopri l'ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con nanorivestimento StarPEG eparinizzata. Questa tecnica migliora la sopravvivenza e la funzione del trapianto, affrontando il rigetto immunitario e la rivascolarizzazione post-operatoria.

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Siamo grati per il sostegno finanziario del National Natural Science fondi della Cina (31770968) e Tianjin ricerca programma di Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabbricazione di eparina-incorporato Starpeg DFI
<ol><li>
Sintesi di succinato di succinimidyl eparina (eparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesare 0,69 g dell'eparina e sciogliere in 2,0 mL di acqua deionizzata ghiacciata.</li>
		<li>Pesare 0,23 g di NHS e sciogliere in 0,5 mL di acqua deionizzata ghiacciata in un pallone.</li>
		<li>Pesare 0,77 g di EDC e sciogliere in 0,5 mL di acqua deionizzata ghiacciata in un pallone.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni NHS ed EDC in un pallone. Lasciare la soluzione mista in panchina a temperatura ambiente per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare la miscela di EDC NHS a 5.031 x g per 10 min rimuovere l'eccesso EDC e NHS.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL di etanolo freddo per la soluzione di miscela e centrifugare a 5.031 x g per 10 min.<ol>
<li>Ripetere due volte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di DFI starPEG-eparina
	<ol>
<li>Aggiungere 1,0 mL di 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 in un pallone.</li>
		<li>Aggiungere 0,67 mL di 10% (p/v) eparina-NHS il pallone stesso.</li>
		<li>Posizionare la soluzione mista di starPEG-(NH2)8 ed eparina-NHS in un incubatore a 25 ° C per 20 minuti ottenere una soluzione limpida con viscosità. Nota: Per gli esperimenti in cui fluorescente contrassegnato eparina (FAM-eparina) è stato richiesto, la procedura di fabbricazione è lo stesso tranne per il fatto che le stelle (NH2) - PEG -8 è stato dissolto in acqua deionizzata completato con 5, paragrafo 6- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (rapporto molare) di starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione di eparina-PEG DFI di Fourier Transform spettroscopia infrarossa (FT-IR)
	<ol>
<li>Prima di iniziare, è necessario sciacquare il dispositivo di mortaio, pestello e cubettatura di agata (piccoli dischi con diametro di 13 mm) con acetone e acqua deionizzata. Asciugare il vetro in un forno prima dell'uso.</li>
		<li>Campione di eparina-PEG mix circa 0,1-1% con 200 – 250 mg di polvere fine di KBr.</li>
		<li>Posizionare l'eparina-PEG e la miscela di KBr in agata mortaio e polverizzare finemente in piccole palline con diametri di 2 µm.</li>
		<li>Trasferire il composto in un dispositivo d'appallottolamento. Applicare una forza ad alta compressione (8 T/cm2) in un vuoto per 1 – 2 min formare palline trasparenti.</li>
		<li>Tirare delicatamente i pellet di campione dal dispositivo d'appallottolamento. Fare attenzione a non tirare troppo forte di non incorrere in rotture.</li>
		<li>Trasferire il pellet di campione molto attentamente uno spettroscopio infrarosso a trasformata di Fourier trasforma per determinare la struttura chimica del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame delle strutture interne porose di eparina-PEG nanorivestimenti da scansione microscopia elettronica (SEM)
	<ol>
<li>Per le seguenti procedure, preparare pipette e piastra di coltura standard 48-ben celle.</li>
		<li>Dispensare la soluzione di copolimero di eparina-PEG nei pozzetti di una piastra di coltura 48 pozzetti.</li>
		<li>Congelare la piastra a-80 ° C per 24 h.</li>
		<li>Lypophilize i campioni a-50 ° C in ambiente sottovuoto (0,1 Pa) per 24 h.</li>
		<li>Campioni si è diffusa su tutta la superficie appiccicosa di uno stub di alluminio.</li>
		<li>Rivestire i campioni con oro e osservare sotto il microscopio elettronico digitalizzato per osservare le strutture interne di porose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame della superficie nanorivestimenti eparina-PEG di microscopia a forza atomica (AFM)
	<ol>
<li>Pulire le lastre di vetro di silice con soluzione piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C per 40 min.</li>
		<li>Sonicare le diapositive in metanolo per 10 min e poi nel toluene per 10 min.</li>
		<li>Asciugare i vetrini di essiccazione sotto vuoto.</li>
		<li>Lavare i vetrini con un sacco di soluzione 3-aminopropyl-trietossisilano (2% in toluene), agitare delicatamente.</li>
		<li>Sonicare le diapositive in metanolo per 10 min poi nel toluene per 10 min.</li>
		<li>Posto 100 µ l di soluzione di eparina-PEG del 3% su tutta la superficie delle diapositive utilizzando una pipetta standard.</li>
		<li>Esaminare la superficie di eparina-PEG sotto un microscopio a forza atomica (una frequenza di risonanza del 50 – 80 kHz, forza costante di 0,350 N m 21, raggio della punta di 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mouse isolotto Surface Engineering con eparina-PEG DFI
<ol><li>
Rivestimento di superficie dell'isolotto del mouse con eparina-PEG DFI
	<ol>
<li>Estrarre gli isolotti del topo di collagenasi digestione histopaque gradiente purificazione e come precedentemente segnalata in Giove19.</li>
		<li>Accuratamente 200 isolotti sotto un microscopio di dissezione in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di PBS al isolotti e centrifugare a 503 x g per 1 min.</li>
		<li>Prendere il sovranatante ed aggiungere 250 µ l di soluzione di eparina-PEG e mantenere la miscela in ghiaccio per 10 min. pipetta su e giù per consentire gli isolotti mescolare bene con la soluzione di eparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugare a 503 x g per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere 500 µ l di PBS. Pipettare su e giù per amalgamare bene.</li>
		<li>Centrifugare a 503 x g per 1 min e rimuovere il supernatante e mantenere gli isolotti per ulteriore uso. Per l'esame di isolotti di topo rivestito con l'eparina-PEG, FAM-eparina-PEG è stato utilizzato per il rivestimento di isolotto attenendosi alla seguente procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame di isolotti di topo rivestito con la DFI FAM-eparina-PEG
	<ol>
<li>Aggiungere 1 – 2 mL di RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale agli isolotti rivestiti e trasferire questi isolotti in un piatto di coltura batterica sterile non caricati.</li>
		<li>Osservare i segnali di fluorescenza e morfologia di FAM-eparina-PEG rivestite con DFI isolotti sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. funzione di eparina-PEG rivestito isolotti del topo rispetto agli isolotti Non rivestiti
<ol><li>
Redditività di eparina-PEG rivestito isolotti del topo
	<ol>
<li>Accuratamente 20 degli isolotti del mouse eparina-PEG rivestito e inserirli in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti.</li>
		<li>Riempire un totale di 10 pozzi con 20 isolotti di topo di eparina-PEG rivestito per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Accuratamente 20 di isolotti di controllo noncoated e inserirli in un pozzetto della stessa piastra di coltura cellulare 96 pozzetti.</li>
		<li>Riempire un totale di 10 pozzi con 20 isolotti di controllo noncoated per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Mettere 200 µ l di RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale ogni pozzetto della piastra 96 pozzetti che contiene isolotti e mantenere nella cultura per 14 giorni.</li>
		<li>Sostituire i mezzi di coltura dell'isolotto ogni 2 giorni.</li>
		<li>Trattare gli isolotti con un live/dead kit di colorazione alla fine dei 14 giorni nella cultura e osservato sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
		<li>Contare le celle PI+ (rosso) all'interno di ogni isolotto sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rivascolarizzazione del eparina-PEG rivestito del mouse isolotti in vitro
	<ol>
<li>Pre-raffreddare tutta la plastica sperimentale compreso piastra di coltura e puntali almeno 12 ore prima dell'uso.</li>
		<li>Posto un luogo 24 pozzetti su un pad di raffreddamento. Aggiungere 250 µ l di ghiaccio freddo Matrigel ridotto fattore di crescita in tutti i pozzetti di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Posizionare la piastra 24 pozzetti rivestita a 4 ° C per almeno 30 min.</li>
		<li>Mentre la soluzione di matrice è l'impostazione in frigo, tripsinizzano il mouse endoteliale Mile Sven 1 (MS1) le cellule di Langerhans.<ol>
<li>Rimuovere tutti i terreni di coltura nel matraccio di cultura del tessuto. Risciacquare il matraccio con 5 mL di PBS.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 3 min in un incubatore standard.</li>
			<li>Battere leggermente il fondo del matraccio per staccare le cellule e aggiungere 5 mL di siero-completati media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Prendere il sovranatante ed aggiungere 5 mL di PBS. Pipettare su e giù per amalgamare bene.</li>
		<li>Centrifugare a 1.000 x g per 5 min e prendere il sovranatante.</li>
		<li>Aggiungere file multimediali DMEM siero-completati nel tubo e seme 50.000 cellule in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti matrix-soluzione-rivestito.</li>
		<li>Aggiungere 5 isolotti di eparina-PEG rivestito o isolotti di controllo noncoated in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere siero-completati DMEM media in ogni pozzetto per un totale di 500 µ l per pozzetto.</li>
		<li>Osservare la formazione del tubo dopo 4h a 24 h di incubazione sotto un microscopio chiaro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secrezione insulinica glucosio-mediata degli isolotti di eparina-PEG rivestito Nota: Per valutare se nanorivestimenti comprometterebbe la funzione di isolotti del topo, è stata valutata la secrezione insulinica glucosio-mediata di eparina-PEG rivestito e isolotti noncoated.<ol>
<li>Accuratamente 30 isolotti di eparina-PEG rivestito o isolotti di controllo noncoated in una provetta da 1,5 mL. Preparare un totale di 10 tubi per rivestite con isolotti e isolotti noncoated ciascuno.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione salina fisiologica completati con 2 mmol/L glucosio20 e incubare a 37 ° C per 2 h. Nota: Per la ricetta della soluzione salina fisiologica, fare riferimento alla tabella 1. Tenere il cappuccio di tubi allentati durante l'incubazione nell'incubatrice.</li>
		<li>Rimuovere quante più soluzioni possibili.</li>
		<li>Stimolare gli isolotti aggiungendo 600 µ l di soluzione salina fisiologica completati con 20 glucosio di mmol/L a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Raccogliere 200 µ l di supernatante da ciascuna provetta per insulina quantificazione ELISA utilizzando un'insulina commerciale ELISA kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, dimostriamo un approccio "facile da adottare" per vivere superficie cellulare un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI di ingegneria e il gruppi amminici di isole pancreatiche in superficie della membrana. Infatti, i gruppi amminici all'interno delle membrane delle cellule sono altamente reattivi, e di conseguenza, gli studi precedenti hanno segnalato interazioni tra gruppi amminici primari con attivato N- hydroxysuccinimidyl (NHS) estere in condizioni fisiologiche14 ,16,21. Inoltre, ricerche approfondite è segnalato che l'incorporazione di eparina, un glicosaminoglicano altamente solfatata e importante componente della matrice extracellulare, durante l'incapsulamento dell'isolotto, potrebbe portare a una maggiore post-trapianto rivascolarizzazione e ridotta IBMIR22,23. Considerando la biocompatibilità di PEG e multivalente proprietà dell'eparina, abbiamo usato PEG 8-armati per l'eparina massima di caricamento durante la fabbricazione del DFI. L'eparina è stata modificata con -NHS, che avrebbe successivamente reagire con i gruppi di2 -NH sulla membrana delle cellule dell'isolotto. Abilitando la formazione del legame covalente tra -NH2 (della membrana cellulare) e -NHS di Hep-PEG, gli isolotti sarebbero essere prontamente "rivestiti" dalla PEG eparina-incorporato, formando così uno strato sottile di nano (DFI) sulla superficie esterna della del pancreas isolotti.
L'approccio attuale è diverso dai metodi precedentemente pubblicati che hanno selezionato PEG come il polimero più importante per la microincapsulazione di isolotto in quanto chimica di pseudo-bioorthogonal tra il -NHS (di DFI) e -NH2 della cellula dell'isolotto membrana è stata utilizzata. Considerando che la stabilità della cellula dell'isolotto/rivestimento, soprattutto in un ambiente complesso come il plasma, è cruciale alla rivascolarizzazione post-trapianto e sopravvivenza, la formazione tra -NHS e -NH2 sarebbe più stabile rispetto al interazione idrofobica tra PEG e membrana cellulare24, interazioni elettrostatiche9,15,24,25,26 o legame biologico tra biotina streptavidina14.
Inoltre, a differenza dell'isolotto rivestimento approccio che si basa sull'approccio LBL con periodo di gestione estesa dell'isolotto per deposizione multistrato14,16,25, la tecnica attuale anche richiede minimo elaborazione e molto breve periodo di rivestimento degli isolotti isolati. Entrambi questi fattori sono essenziali per la sopravvivenza post-trapianto dell'isolotto poiché isolotti vitalità è spesso già compromessa seguente isolotto isolamento a causa di ECM danneggiati durante la digestione enzimatica. Tuttavia, una limitazione dell'attuale strategia è che, a differenza di LBL, tramite il quale lo spessore del rivestimento esterno potrebbe essere controllato aumentando o riducendo il numero di deposizione di strati, spessore del DFI Hep-PEG non può essere personalizzato per il momento.
Inoltre, a causa della condizione mite dove la reazione chimica tra -NHS e -NH2 si svolge, l'approccio attuale è applicabile per la cellula vivente superficie ingegneria non limitata di isole pancreatiche, ma la maggior parte della terapia cellulare. Inoltre, considerando che l'eparina è noto per interagire con una gamma di citochine e molecole biologicamente attive, il DFI Hep-PEG presenta anche una piattaforma aperta che ha il potenziale per l'incorporazione dei mediatori biologici illimitati così come interfacce per l'ingegneria delle superfici delle cellule più complessa.

L'efficacia terapeutica delle terapie basate sulle cellule è limitata dalla cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza1,2. Al fine di migliorare l'esito delle terapie cellulari, cell ingegneria delle superfici tramite manipolazione enzimatica, coniugazione del peptide, bioorthogonal chimica e fisica incapsulamento con biomateriali è stato sfruttato3,4, 5,6,7,8,9,10. L'attuale protocollo mira a raggiungere ingegneria delle superfici delle cellule viventi, utilizzando un metodo "facile da adottare" applicando un nanorivestimento ultrasottile eparina-incorporato starPEG (eparina-PEG) alla superficie delle cellule. Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici è stato presentato qui come esempio a causa della natura eterogenea delle isole di Langerhans e denigratori risultati del trapianto di insule pancreatiche clinica corrente.
Infatti, il trapianto dell'isolotto clinica attualmente viene eseguito tramite iniezione diretta degli isolotti isolati nella vena portale epatica e questa procedura è disponibile solo per i pazienti selettivi a causa della scarsità di donatori materiali e bassa efficacia terapeutica 11. convenzionalmente, alginato è stato il biomateriale più comunemente usato per l'incapsulamento dell'isolotto e modificazione superficiale, anche se è meno di ideale a causa della instabilità chimica di alginato e fibrosi infiammatorie legate12, 13. Inoltre, rispetto alla dimensione degli isolotti che varia da 100 a 200 µm, le microcapsule di alginato-isolotto sono più grandi, comprese tra 400 e 800 µm, che supera la distanza di diffusione fisiologica dell'ossigeno. Incapsulamento dell'isolotto conformal, vale a dire., incapsulamento isolotti senza alterazione significativa del volume dell'isolotto, è stato poi sviluppato. Così, deposizione di nanomembrane è composta da PEG, tetrafluoroetilene, membrana in silicone o multistrato DFI (noto anche come la tecnica di "strato-da-strato" [LBL]) sono stato segnalato, con conseguente miglioramento in vitro dell'isolotto sopravvivenza14 a ,15,16,17,18, anche se il LBL approccio spesso richiede vasti isolotti consegna periodo per la deposizione di strati multipli, che possono compromettere la vitalità dell'isolotto . Inoltre, instabilità di nanomembrane che si basa su interazioni elettrostatiche o covalente tra strati di biomembrane o interazioni idrofobiche tra Nanomembrane e la superficie dell'isolotto solleva inoltre preoccupazioni9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Un altro fattore limitante che appesantiscono il risultato terapeutico di trapianto dell'isolotto intraportal è istantanea sangue-mediata reazione infiammatoria (IBMIR) causata da contatto diretto degli isolotti impiantati con sangue, con conseguente aggregazione piastrinica, coagulazione ed effetto immune avverso o indesiderati attivazione cellulare9. Per risolvere questi problemi, un nanorivestimento ultra-sottile composto da stella-a forma di polietilene glicole (starPEG) è stato preparato per la sua biocompatibilità stabilito e versatilità come materiale dell'alloggiamento dell'isolotto. Eparina, un glicosaminoglicano altamente solfato, inoltre è stato incorporato nella DFI starPEG per le sue proprietà antinfiammatorie, anti-coagulante e la capacità di facilitare la vascolarizzazione di reclutamento di fattori di crescita pro-angiogenici22, 23.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale</td><td>bovino GIBCO, di Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione cellulare</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 falloidina</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr> Kit per apoptosi <tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium, Tipo XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>PEG a 8 bracci</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carbossifluoresceina N-succinimidil estere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-amminopropil-trietossisilano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione viva/morta</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, matrice della membrana basale, fattore di crescita ridotto</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 99,5%</td> <td>J& K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, 99%, J</td><td>& K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio, 99,7%, reagente ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato, 99%, reagente ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio, 99%, J</td><td>& K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato, 99%, per analisi</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di calcio volumetrica, 1,0 M CaCl2</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA per insulina di ratto/topo</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento starpeg eparinizzata

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingegneria di superficie cellulare può proteggere le cellule impiantate da attacco immune ospite. Esso può anche rimodellare il paesaggio cellulare per migliorare la funzione dell'innesto e sopravvivenza post-trapianto. Questo protocollo mira a raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento ultrasottile eparina-incorporato starPEG (Hep-PEG). Per generare il DFI Hep-PEG per ingegneria delle superfici dell'isolotto pancreatico, succinato di succinimidyl eparina (eparina-NHS) è stato sintetizzato per la prima volta tramite modifica dei gruppi carbossilato tramite-(3-dimethylamino propyl) N -N'-etilico carbodiimide cloridrato (EDC) e N- Idrossisuccinimide (NHS). La miscela di Hep-PEG si formò quindi di reticolazione del amminico funzionalizzati fine otto braccia starPEG (starPEG-(NH2)8) e l'eparina-NHS. Per il rivestimento superficiale dell'isolotto, isolotti del topo sono stati isolati tramite digestione della collagenosi e purificazione sfumatura utilizzando Histopaque. Gli isolotti isolati sono stati quindi trattati con soluzione di Hep-PEG fredda ghiaccio per 10 minuti consentire il legame covalente tra NHS e i gruppi amminici di membrana delle cellule dell'isolotto. DFI con Hep-PEG comporta alterazione minima alla dimensione dell'isolotto e volume ed eparinizzazione degli isolotti con Hep-PEG può anche ridurre la reazione infiammatoria mediata dal sangue immediata durante il trapianto dell'isolotto. Questo approccio "facile da adottare" è abbastanza mite per ingegneria delle superfici delle cellule viventi senza compromettere la vitalità cellulare. Considerando che l'eparina ha mostrato affinità di legame per citochine multiple, il DFI Hep-PEG fornisce anche una piattaforma aperta che consente l'incorporazione dei mediatori biologici funzionali illimitati e superfici multistrate per vivere superficie cellulare Bioingegneria.

Il DFI eparina-PEG fu sintetizzato da coniugazione del starPEG-(NH2)8 e l'eparina con EDC e NHS come accoppiamento agenti (Figura 1). Struttura chimica del DFI eparina-PEG è stato esaminato da FT-IR e come illustrato nella Figura 2, picchi caratteristici dell'eparina ha potuto essere osservati alle 3.300 – 3.600 cm-1, corrispondenti ai gruppi dell'idrossile dell'eparina (Figura 2 rosso). La diminuzione nell'ampiezza del picco a 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 blu) rappresenta la coniugazione tra il starPEG-(NH2)8 gruppi di ammide e il gruppo carbonilico dell'eparina. Ampiezza di picco 1.650 cm-1 corrisponde all'ammide carbonilico stretching vibrazione inoltre è stata ridotta, che indica una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato dell'eparina con succinimidyl succinato e ammina di starPEG-(NH2) 8. struttura superficiale di DFI l'eparina-PEG è stato esaminato secondo microscopia a forza atomica ed è indicato da Lou et al., il DFI era circa 30 nm in altezza e 2 µm di larghezza con piccole caratteristiche porosi (macchie scure) che vanno tra 100 e 200 nm in diametro10. I dati ottenuti dalla scansione microscopia elettronica inoltre confermano la struttura porosa altamente interconnessa del eparina-PEG (Figura 3), suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza delle cellule durante la consegna in vivo.
Rivestimento superficiale di isolotti isolati del topo è stato esaminato e come presentato in Figura 4, sottile strato di DFI, mostrato fluorescenza verde è stato depositato uniformemente su tutta la superficie degli isolotti rivestiti senza causare cambiamenti evidenti su isolotto/dimensione del volume. Durante la verniciatura, si consiglia di tenere gli isolotti sul ghiaccio per mantenere la loro vitalità. Allo stesso modo, il periodo di rivestimento, 10 min in questo caso, è stato anche ottimizzato per consentire il mantenimento della vitalità di isolotti. Vale la pena notare che per una migliore osservazione della nanotecnologia, la microscopia elettronica che esamina le sezioni trasversali degli isolotti rivestiti come precedentemente segnalato9,16 sarebbe più appropriata, anche se i dati verrebbero generati da isolotti fissi e incorporati invece di isolotti di vivere nella cultura.
Per quanto riguarda sopravvivenza e funzione delle funzioni in, rivascolarizzazione delle isole e isolotti rivestiti sono stati valutati in vitro. Considerando le proprietà benefiche dell'eparina, funzionalizzazione di eparina sulla superficie dell'isolotto potrebbe facilitare la rivascolarizzazione delle isole di cultura e di conseguenza la sopravvivenza. Abbiamo osservato che gli isolotti di eparina-PEG rivestito del mouse hanno esibito attuabilità robusto isolotto in cultura (Figura 5). Significativamente più avanzata formazione vascolare era evidente anche dalle cellule endoteliali dell'isolotto (MS1) che sono state co-coltivate con eparina-PEG rivestito isolotti, indicati dalla forma allungata del microvessel-come le strutture e rete-come le strutture vascolari (Figura 6 ).
Il processo di DFI non sostenute capacità secretoria insulinica glucosio-mediata di effetto degli isolotti eparina-PEG rivestito. Basso livello di secrezione dell'insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando isolotti sono stati irrorati con soluzione salina fisiologica completati con sub-stimulatory livello di glucosio (2 mmol/L; Figura 7). Quando gli isolotti sono stati stimolati con un livello di sovra-fisiologiche di glucosio (glucosio 20 mmol/L), aumento della secrezione dell'insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Struttura chimica di Hep-PEG nanorivestimenti per ingegneria delle superfici dell'isolotto pancreatico. Rivestimento dell'isolotto è stata realizzata da reticolazione covalente tra l'eparina-NHS e ammine primarie all'interno della membrana cellulare e stelle - PEG-(NH2)8. Ogni molecola di eparina possiede più gruppi carbossilici, che sono stati modificati per avere un gruppo di NHS. Gruppi carbossilici attivati dal NHS reagiscono con le ammine primarie della proteina di legami ammidici modulo, tramite il quale sono stabilizzato nanorivestimenti Hep-PEG e isolotti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Spettro infrarosso di stelle - PEG-(NH2)8, eparina e nanorivestimenti Hep-PEG in secchi stato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Immagini di microscopia elettronica di Hep-PEG nello stato essiccato digitalizzate. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Immagini rappresentative di eparina-PEG rivestito isolotti con microscopio a fluorescenza. L'eparina è stata pre-etichettata con FAM (mostrata in verde). Immagini sono rappresentative di 100 isolotti. Barra della scala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Isolotti di eparina-PEG rivestito ha esibito attuabilità robusto isolotto. (A) i dati presentati come errore standard mean± di mezzi, n = 50 isolotti per ogni gruppo. (B) le cellule viventi sono state mostrate in verde e morte celle in rosso. Barra della scala = 100 µm. immagini sono rappresentative di 50 isolotti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Eparina-PEG nanorivestimenti facilita intra-isolotto revascularisation. Formazione del MS1 cellule co-coltivate con eparina-PEG rivestito isolette e isolotti di controllo noncoated di tubo di Matrigel. Immagini sono state scattate a barra della scala h. 4 e 24 = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Eparina-PEG DFI non comporta nessun cambiamento sulla funzione di secrezione di insulina dell'isolotto. Eparina-PEG rivestiti isolette e isolotti di controllo noncoated (30) sono stati esposti a 2 mmol/L (barra bianca) o 20 glucosio di mmol/L (barra nera) per 30 min. secrezione di insulina in risposta a 20 mmol/L glucosio era comparabile fra il rivestimento e gli isolotti di controllo. I dati vengono visualizzati come media ± errore standard dei mezzi, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

Questo metodo può aiutare a risolvere le principali sfide nel trapianto di isole pancreatiche, come l'immunorigetto, la rivascolarizzazione post-trapianto e la sopravvivenza. I principali vantaggi di questa tecnica è che questo approccio facile da adottare consente l'ingegneria di superficie delle cellule viventi rimodellando il paesaggio cellulare delle isole pancreatiche, migliorando la funzione dell'innesto, la sopravvivenza e, in ultima analisi, l'efficacia terapeutica del trapianto di isole. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie cellulari perché l'esito terapeutico delle terapie cellulari è limitato anche dalla bassa ritenzione cellulare e dalla scarsa sopravvivenza.A dimostrare questa procedura è Jingyi Yang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prima cosa, pesare 6,9 grammi di eparina e scioglierla in 2 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo Eppendorf. Sciogliere 0,23 grammi di NHS in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in una provetta Eppendorf.Quindi, sciogliere 0,77 grammi di EDC in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo conico da 50 millilitri. Miscelare le soluzioni NHS ed EDC in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver lasciato la soluzione miscelata a temperatura ambiente per 30 minuti, centrifugarla a 12.000 giri/min per 10 minuti per rimuovere l'EDC e l'NHS in eccesso.Successivamente, aggiungere 30 millilitri di etanolo freddo alla soluzione e centrifugare a 12.000 giri/min per 10 minuti. Ora, aggiungi 1 millilitro di coadiuvante starPEG MI al 10% a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere 0,67 millilitri di soluzione di eparina NHS al 10% allo stesso tubo conico da 50 millilitri.Mettere la soluzione miscelata in un incubatore a 25 gradi Celsius per 20 minuti per ottenere una soluzione viscosa e limpida. Prelevare 200 isole di topo precedentemente estratte al microscopio da dissezione e trasferirle in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di PBS alle isole e centrifugare a 1.200 giri/min per un minuto a quattro gradi centigradi.Rimuovere il surnatante, aggiungere 250 microlitri della soluzione di eparina PEG e mettere il composto sul ghiaccio per 10 minuti. Pipettare su e giù per consentire alle isole di mescolarsi bene con la soluzione di eparina PEG. Successivamente, centrifugare la miscela a 1, 200 giri/min per un minuto.Quindi, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di PBS. Pipettare su e giù per mescolare bene. Dopo aver centrifugato a 1, 200 giri/min per un minuto, rimuovere il surnatante e conservare le isole per un ulteriore utilizzo.Successivamente, aggiungere uno o due millilitri di RPM I 1640, integrato con il 10% di FBS alle isole rivestite. E trasferisci queste isole in una piastra di coltura batterica sterile non carica. Infine, osservare la morfologia e i segnali fluorescenti delle isole rivestite di FAM-eparina-PEG al microscopio a fluorescenza invertita.Picchi caratteristici di eparina, corrispondenti ai gruppi HYDROXAL, sono stati osservati nello spettro FTIR del nanorivestimento eparina-PEG. La diminuzione dell'ampiezza di questi picchi rappresenta la coniugazione tra i gruppi ammidici coadiuvanti stella-PEG MI e il gruppo carbonico eparina. Anche il picco corrispondente alla vibrazione di stiramento ammidico carbonale è stato ridotto, indicando una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato di eparina con il sucinimiato succinimiale e l'ammina coadiuvante star-PEG.La scansione di dati al microscopio elettronico mostra la struttura porosa altamente interconnessa del nanorivestimento eparina-PEG, suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza cellulare durante la somministrazione in vivo. Un sottile strato di nanorivestimento, mostrato dalla fluorescenza verde, è stato depositato uniformemente sulla superficie delle isole rivestite, senza causare cambiamenti evidenti sul volume o sulle dimensioni delle isole. Le isole di topo rivestite di eparina PEG hanno mostrato una robusta vitalità delle isole in coltura.Una formazione vascolare significativamente più avanzata era evidente dalle cellule endoteliali delle isole che sono state co-coltivate con isole rivestite di eparina-PEG, indicate da strutture allungate simili a microvasi e strutture vascolari a rete. Un basso livello di secrezione di insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando le isole sono state perfuse con una soluzione salina fisiologica, integrata con un livello substimolante di glucosio. Quando le isole sono state stimolate con un livello superfisiologico di glucosio, è stato osservato un aumento della secrezione di insulina.Una volta padroneggiato, il rivestimento può essere eseguito in un minuto se viene eseguito correttamente per preservare la vitalità dell'isola.

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Bioengineering

Bioingegneria

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