Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Questo metodo può aiutare a risolvere le principali sfide nel trapianto di isole pancreatiche, come l'immunorigetto, la rivascolarizzazione post-trapianto e la sopravvivenza. I principali vantaggi di questa tecnica è che questo approccio facile da adottare consente l'ingegneria di superficie delle cellule viventi rimodellando il paesaggio cellulare delle isole pancreatiche, migliorando la funzione dell'innesto, la sopravvivenza e, in ultima analisi, l'efficacia terapeutica del trapianto di isole. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie cellulari perché l'esito terapeutico delle terapie cellulari è limitato anche dalla bassa ritenzione cellulare e dalla scarsa sopravvivenza.

A dimostrare questa procedura è Jingyi Yang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prima cosa, pesare 6,9 grammi di eparina e scioglierla in 2 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo Eppendorf. Sciogliere 0,23 grammi di NHS in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in una provetta Eppendorf.

Quindi, sciogliere 0,77 grammi di EDC in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo conico da 50 millilitri. Miscelare le soluzioni NHS ed EDC in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver lasciato la soluzione miscelata a temperatura ambiente per 30 minuti, centrifugarla a 12.000 giri/min per 10 minuti per rimuovere l'EDC e l'NHS in eccesso.

Successivamente, aggiungere 30 millilitri di etanolo freddo alla soluzione e centrifugare a 12.000 giri/min per 10 minuti. Ora, aggiungi 1 millilitro di coadiuvante starPEG MI al 10% a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere 0,67 millilitri di soluzione di eparina NHS al 10% allo stesso tubo conico da 50 millilitri.

Mettere la soluzione miscelata in un incubatore a 25 gradi Celsius per 20 minuti per ottenere una soluzione viscosa e limpida. Prelevare 200 isole di topo precedentemente estratte al microscopio da dissezione e trasferirle in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di PBS alle isole e centrifugare a 1.200 giri/min per un minuto a quattro gradi centigradi.

Rimuovere il surnatante, aggiungere 250 microlitri della soluzione di eparina PEG e mettere il composto sul ghiaccio per 10 minuti. Pipettare su e giù per consentire alle isole di mescolarsi bene con la soluzione di eparina PEG. Successivamente, centrifugare la miscela a 1, 200 giri/min per un minuto.

Quindi, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di PBS. Pipettare su e giù per mescolare bene. Dopo aver centrifugato a 1, 200 giri/min per un minuto, rimuovere il surnatante e conservare le isole per un ulteriore utilizzo.

Successivamente, aggiungere uno o due millilitri di RPM I 1640, integrato con il 10% di FBS alle isole rivestite. E trasferisci queste isole in una piastra di coltura batterica sterile non carica. Infine, osservare la morfologia e i segnali fluorescenti delle isole rivestite di FAM-eparina-PEG al microscopio a fluorescenza invertita.

Picchi caratteristici di eparina, corrispondenti ai gruppi HYDROXAL, sono stati osservati nello spettro FTIR del nanorivestimento eparina-PEG. La diminuzione dell'ampiezza di questi picchi rappresenta la coniugazione tra i gruppi ammidici coadiuvanti stella-PEG MI e il gruppo carbonico eparina. Anche il picco corrispondente alla vibrazione di stiramento ammidico carbonale è stato ridotto, indicando una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato di eparina con il sucinimiato succinimiale e l'ammina coadiuvante star-PEG.

La scansione di dati al microscopio elettronico mostra la struttura porosa altamente interconnessa del nanorivestimento eparina-PEG, suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza cellulare durante la somministrazione in vivo. Un sottile strato di nanorivestimento, mostrato dalla fluorescenza verde, è stato depositato uniformemente sulla superficie delle isole rivestite, senza causare cambiamenti evidenti sul volume o sulle dimensioni delle isole. Le isole di topo rivestite di eparina PEG hanno mostrato una robusta vitalità delle isole in coltura.

Una formazione vascolare significativamente più avanzata era evidente dalle cellule endoteliali delle isole che sono state co-coltivate con isole rivestite di eparina-PEG, indicate da strutture allungate simili a microvasi e strutture vascolari a rete. Un basso livello di secrezione di insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando le isole sono state perfuse con una soluzione salina fisiologica, integrata con un livello substimolante di glucosio. Quando le isole sono state stimolate con un livello superfisiologico di glucosio, è stato osservato un aumento della secrezione di insulina.

Una volta padroneggiato, il rivestimento può essere eseguito in un minuto se viene eseguito correttamente per preservare la vitalità dell'isola.