Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di utilizzare l'isolamento immunomagnetico per selezionare oligodendrociti O4 positivi da cuccioli di topi neonati per la loro analisi in coltura in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle scienze neurali relative allo studio delle malattie che colpiscono la mielina e la mielinizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita la preparazione della coltura finale di oligodendrociti di purezza superiore all'80% in circa un'ora di ora.

Inizia usando piccole forbici da dissezione per tagliare la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto di un topo del quinto o sette giorni dopo il parto. Ritrarre il lembo cutaneo per esporre il cranio e tagliare con cura il cranio lungo la linea mediana dall'apertura nella parte posteriore all'area frontale. Dall'apertura nella parte posteriore del cranio, tagliare verso ciascuna orbita oculare lungo la base dell'osso e utilizzare una pinza sottile per allontanare delicatamente le cortecce dal mesencefalo.

Quindi, trasferire le cortecce in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri contenente sette millilitri di B-27 Neurobasal A Medium. Quando tutti i cervelli sono stati raccolti, trasferisci le cortecce in una nuova piastra di coltura tissutale da 60 millimetri contenente cinque millilitri di tampone di dissociazione e usa una lama di bisturi numero 15 per tagliare le cortecce in pezzi di un millimetro cubo. Incubare i pezzi di cervello in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 per 20 minuti.

Quindi, aggiungere un millilitro di siero per la crescita bovina per fermare la reazione enzimatica. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, trasferire il liquame di tessuto in una provetta conica da 15 millilitri e dissociare delicatamente il tessuto cerebrale da sei a otto volte con il pipettaggio. Lascia che i pezzi di tessuto dissociati si depositino per due o tre minuti.

Quindi, trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Successivamente, aggiungere ai tessuti tre millilitri di Neurobasal A Medium, integrato con siero per la crescita bovina e DNasi I, e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per dissociare delicatamente i tessuti con più pipettaggio. La forza di pipettaggio appropriata è fondamentale per garantire un'elevata resa di cellule vitali.

Se il pipettaggio è troppo duro, la vitalità potrebbe essere bassa. Mentre se il pipettaggio è troppo delicato, la resa cellulare potrebbe essere bassa. Lascia che i pezzi di tessuto si depositino per altri due o tre minuti.

Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere al tessuto tre millilitri di Neurobasal A Medium fresco, integrato con siero per la crescita bovina e DNasi I. Dissociare delicatamente il tessuto cerebrale con un puntale per pipetta P-1000 fino a quando non rimane più un grosso pezzo di tessuto, facendo attenzione a evitare bolle. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per filtrare la soluzione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron in una provetta conica da 50 millilitri e portare il volume finale della sospensione unicellulare a 30 millilitri con un terreno Neurobasal A fresco, integrato con siero per la crescita bovina e DNasi I. Dividere la sospensione cellulare in due provette coniche da 15 millilitri, e pellettare le cellule neurali mediante centrifugazione.

Rimuovere tutti tranne gli ultimi 5-10 microlitri di surnatante torbido e aggiungere alle cellule tre millilitri di Neurobasal A Medium integrato con siero per la crescita bovina. Risospendere con cura il pellet cellulare e portare il volume finale fino a 15 millilitri con il terreno fresco Neurobasal A contenente il 10% di siero per la crescita bovina. Filtrare la soluzione cellulare attraverso un colino cellulare da 40 micron in una nuova provetta conica da 50 millilitri e portare il volume finale fino a 30 millilitri con un nuovo terreno neurobasale A contenente il 10% di siero per la crescita bovina.

Quindi, dividere la sospensione cellulare filtrata tra due provette coniche da 15 millilitri per la centrifugazione e risospendere i pellet in 2,5 millilitri di tampone di smistamento magnetico per celle ghiacciato prima di raggruppare le cellule. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le celle e risospendere il pellet in 90 microlitri di tampone di smistamento cellulare magnetico fresco per una volta per 10 per le sette celle.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di perline anti-04 per una volta 10 alle sette celle e mescolare la soluzione cellulare con un leggero colpo. Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius con un leggero movimento ogni cinque minuti, aggiungere delicatamente due millilitri di tampone di selezione delle celle magnetiche per una volta 10 alle sette celle per un lavaggio mediante centrifugazione e scartare il surnatante con un'attenta aspirazione a vuoto. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di selezione a celle magnetiche fresco per ogni volta da 10 a sette celle e posizionare una colonna di selezione di biglie magnetiche di dimensioni adeguate nel separatore magnetico corrispondente.

Posizionare un filtro da 40 micron sulla colonna e pre-risciacquare il filtro con tre millilitri di tampone di selezione a celle magnetiche, lasciando che il tampone scorra attraverso la colonna senza lasciare che la colonna si asciughi. Aggiungere le celle al colino, quindi lavare con un millilitro di tampone di selezione magnetico. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di selezione cellulare magnetico per lavaggio e una volta con il terreno di proliferazione degli oligodendrociti.

Quindi, trasferire la colonna in una provetta da 15 millilitri e utilizzare lo stantuffo per far scorrere immediatamente cinque millilitri di terreno di proliferazione degli oligodendrociti freschi attraverso la colonna. Dopo il conteggio, diluire le cellule a una densità di placcatura appropriata e sostituire la laminina dai vetrini di copertura pre-rivestiti in una piastra a 24 pozzetti con 100 microlitri di terreno di proliferazione degli oligodendrociti. Incubare gli oligodendrociti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per non più di 45 minuti per favorire l'adesione degli oligodendrociti ai vetrini.

Quindi, inondare ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno di proliferazione degli oligodendrociti per un'incubazione di 24 ore. Il giorno successivo, sostituire i surnatanti con il terreno di differenziazione degli oligodendrociti e rimettere le cellule nell'incubatrice fino a quando non sono pronte per la fissazione. 24 ore dopo la piastra, le cellule sembrano essere bipolari o tripolari al microscopio a contrasto di fase, una caratteristica degli oligodendrociti proliferanti allo stadio iniziale.

La colorazione in immunofluorescenza mostra che 24 ore dopo la piastra, la maggior parte di questi pre-oligodendrociti dimostra anche la marcatura NG2 e O4, mentre la marcatura con GFAP e anticorpi anti-01 sono molto meno comuni, suggerendo che la maggior parte delle cellule in questa fase ha pre-oligodendrociti con pochi oligodendrociti immaturi o maturi. A 72 ore, la morfologia degli oligodendrociti sembra essere più complessa rispetto a 24 ore e c'è una frequenza molto più bassa di cellule positive per il marcatore precoce degli oligodendrociti, NG2. Inoltre, la maggior parte delle cellule dimostra la marcatura dell'O4 e quasi la metà delle cellule è colorata per l'anticorpo 01 in questa fase, suggerendo che le cellule si stanno differenziando in un fenotipo più maturo.

In particolare, la presenza di astrociti rimane estremamente bassa. Questi risultati indicano che, nel tempo, gli oligodendrociti isolati immunomagneticamente sono in grado di differenziarsi in vitro fino allo stadio tre di maturazione con una contaminazione molto ridotta di altri tipi di cellule, come gli astrociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare gli oligodendrociti primari da cuccioli di topo neonatale utilizzando l'isolamento immunomagnetico.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore, se eseguita correttamente. Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.