Un test di codifica a barre per la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie

Iniziare con campioni di prova contenenti cellule immunitarie stimolate e fissate.

La stimolazione induce l'espressione di marcatori specifici nelle cellule, mentre la fissazione preserva i marcatori fenotipici, compresi gli antigeni di superficie cellulare, e i marcatori di stato funzionale, comprese le citochine.

Aggiungere una combinazione unica di anticorpi coniugati con isotopi di metalli pesanti a ciascun campione.

Questa tecnica codifica in modo univoco più campioni, distinguendo ogni campione per la sua combinazione di isotopi di metalli pesanti.

Gli anticorpi si legano a un epitopo comune, codificando a barre tutte le cellule nei campioni.

Combina tutti i campioni con codice a barre in un'unica provetta, per l'elaborazione a valle.

Aggiungere un cocktail di anticorpi coniugati con metallo per colorare gli antigeni della superficie.

Aggiungere un tampone di permeabilizzazione per aumentare la permeabilità della membrana cellulare per la colorazione intracellulare.

Aggiungere un'altra serie di anticorpi metallo-coniugati per colorare le citochine intracellulari.

Il barcoding consente la colorazione e l'acquisizione simultanea dei campioni aggregati tramite citometria di massa. Questa tecnica massimizza l'efficienza del saggio, migliorando la valutazione dei marcatori di stato fenotipico e funzionale.

Per codificare a barre le celle fisse lisate, scongelare i campioni dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius, lentamente sul ghiaccio. Diluire il tampone permanente 10x con PBS da 1 a 10 e preparare abbastanza tampone per 3 millilitri per campione.

Riempire una mangiatoia non sterile con CSM e una con il tampone permanente 1x per codici a barre. Quindi, aggiungere 1 millilitro di CSM ghiacciato ai campioni appena scongelati. Miscelare accuratamente e trasferire nelle rispettive provette cluster in polipropilene pre-marcate.

Ora, prelevare un campione da 10 microlitri e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Normalizzare la conta delle cellule in ciascuna provetta a grappolo rimuovendo il volume delle cellule in eccesso. Quindi, centrifugare le celle a 600 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 millilitro di tampone per permanente 1x con codice a barre con una pipetta multicanale e centrifugare a 600 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare il surnatante.

Allineare le provette a grappolo su un rack nello stesso ordine indicato sulla chiave del codice a barre, in modo che il campione corrisponda al relativo codice a barre. Aggiungere 800 microlitri di tampone per permanente 1x barcoding con pipetta multicanale a tutti i campioni nelle provette a grappolo, senza toccare il pellet cellulare per ridurre la perdita cellulare.

Quindi, mettere da parte il rack con le provette a grappolo. Rimuovere le strisce di provette del kit per codici a barre in palladio da 20 plex da meno 20 gradi Celsius e scongelarle a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di tampone permanente 1x per codici a barre, mescolare accuratamente e trasferire 120 microlitri della miscela per codici a barre risospesa nei campioni cellulari corrispondenti nelle provette a grappolo.

Miscelare accuratamente con la pipetta multicanale, in modo che non vi siano contaminazioni incrociate tra i singoli campioni con codice a barre. Incubare le provette a grappolo per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire ai codici a barre di etichettare le cellule. Dopo 30 minuti, centrifugare i campioni a 600 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante. Quindi, risospenderli in 1 millilitro di CSM. Successivamente, centrifugare e risospendere nuovamente in CSM.

Successivamente, centrifugare a 600 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Con una singola pipetta e utilizzando lo stesso puntale, trasferire tutti i pellet cellulari e circa 70-80 microlitri di volume residuo in una provetta di polistirene. Non espellere il puntale della pipetta. Mettere da parte la pipetta singola con questo puntale.

Con una pipetta multicanale e nuovi puntali, aggiungere 100 microlitri di CSM a ciascuna provetta cluster originale per massimizzare il recupero cellulare. Utilizzando la pipetta singola con il puntale che è stato messo da parte, trasferire tutti i pellet cellulari in 100 microlitri di volume residuo nella stessa provetta di polistirene. Aggiungere CSM per completare il tubo di polistirolo a circa 3 millilitri. Contare e registrare il numero di cella del set di codici a barre in pool. Quindi, centrifugare a 600 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Procedere alla colorazione dei campioni con codice a barre lo stesso giorno.