PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare
3 luglio 2018
MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l'estrazione di miRNA, trascrizione d'inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo diagnostico, come ad esempio se i micro RNA sono biomarcatori validi nelle malattie cardiovascolari. Rispetto alla PCR quantitativa in tempo reale, la PCR digitale presenta qualità tecniche superiori per quantificare i microRNA in circolazione. Poiché il campione è diviso in circa 20.000 goccioline, non sono necessarie misurazioni duplicate e non è necessaria alcuna curva standard per la quantificazione.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla quantificazione dei microRNA nei pazienti cardiovascolari, può essere applicato anche ad altri pazienti e malattie, poiché altri microRNA si sono dimostrati promettenti come biomarcatori nella progressione del cancro, può essere applicato anche ai pazienti oncologici. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le goccioline generate sono fragili e devono essere maneggiate con cura. Dopo aver isolato l'RNA dai campioni di siero, continuare con la trascrizione inversa per ottenere un DNA complementare più stabile per la dPCR.
Per iniziare, scongelare il kit di trascrizione inversa con ghiaccio. Quindi far girare gli enzimi e i primer verso il basso. Successivamente, preparare la miscela master come descritto nel protocollo di testo.
Combinare 10 microlitri della miscela master con cinque microlitri di RNA estratto in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi centrifugare la piastra a 2.000xg a quattro gradi Celsius per due minuti. Procedi con la trascrizione inversa come dettagliato nel protocollo di testo.
Innanzitutto, scongelare la miscela commerciale di dPCR, i primer di cDNA e PCR su ghiaccio e centrifugare immediatamente prima dell'uso. Preparare quindi il master mix come descritto nel testo protocollo. Aggiungere 1,33 microlitri di volume di prodotto di trascrizione inversa a 18,67 microlitri di volume della miscela master e centrifugare brevemente.
Utilizzando una pipetta, trasferire 20 microlitri di campione in ciascun pozzetto della fila media di una cassetta da otto pozzetti. Quindi versare 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline nei pozzetti dell'olio della cassetta. Quindi, posizionare una guarnizione sopra la cassetta e posizionarla nel generatore di gocce.
Chiudere il generatore di gocce e attendere che le tre spie siano verdi fisse. Utilizzando una pipetta, trasferire con cura 40 microlitri del campione formato da goccioline in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Quindi sigillare la piastra con un foglio dPCR a 180 gradi Celsius per quattro secondi.
Posizionare la piastra PCR sigillata nel ciclatore e seguire le istruzioni per il ciclo descritte nel protocollo di testo. Togliere la piastra dal termociclatore e trasferirla sulla base di un portapiatti. Quindi posizionare la parte superiore del supporto della piastra sulla piastra PCR.
Infine, avvia il software commerciale dPCR. In questo protocollo, la PCR digitale è stata utilizzata per quantificare i microRNA nel siero di pazienti con malattie cardiovascolari. I campioni sono stati prelevati da 16 pazienti prima, otto ore dopo e 16 ore dopo l'intervento percutaneo.
I pazienti con infarto miocardico con sopraslivellamento del tratto ST hanno mostrato un aumento significativo dei livelli di miR-499 rispetto ai pazienti con malattia coronarica stabile. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora per la formazione di goccioline di 96 campioni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente di maneggiare le goccioline con cura.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire correttamente la PCR digitale, la corretta formazione delle goccioline, il ciclo, la lettura e l'analisi.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per l'estrazione e la quantificazione di microRNA circolanti come possibili biomarcatori per le malattie cardiovascolari. Utilizzando la PCR digitale, il metodo mira a migliorare l'accuratezza della misurazione dei miRNA in campioni di siero provenienti da pazienti con patologie cardiovascolari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Malattie cardiovascolari
- Biomarcatori
- Analisi dei microRNA
Sfondo
- I microRNA sono piccoli RNA non codificanti coinvolti nella regolazione genica.
- Si sono rivelati potenziali biomarcatori per varie malattie, inclusi i disturbi cardiovascolari.
- La PCR digitale offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali per la quantificazione dei microRNA.
- La comprensione dei profili di miRNA può contribuire alla diagnosi e alla gestione delle malattie cardiovascolari.
Scopo dello studio
- Validare i microRNA come biomarcatori per le malattie cardiovascolari.
- Dimostrare l'efficacia della PCR digitale nella quantificazione dei miRNA circolanti.
- Fornire un protocollo affidabile per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Estrazione di miRNA da campioni di siero.
- Trascrizione inversa per sintetizzare il DNA complementare.
- PCR digitale per la quantificazione assoluta di miRNA.
- Confronto tra PCR digitale e PCR quantitativa in tempo reale.
Risultati principali
- La PCR digitale ha dimostrato una precisione superiore nella quantificazione degli miRNA.
- Il metodo consente l'analisi di migliaia di goccioline senza la necessità di curve standard.
- L'applicabilità potenziale del metodo si estende oltre le malattie cardiovascolari ad altre condizioni come il cancro.
- Sono stati osservati delle difficoltà nel manipolare le goccioline fragili da parte dei nuovi utilizzatori della tecnica.
Conclusioni
- Lo studio supporta l'uso dei microRNA circolanti come biomarcatori per le malattie cardiovascolari.
- La PCR digitale è uno strumento promettente per la quantificazione precisa dei miRNA.
- Ulteriori ricerche potrebbero ampliare l'applicazione di questo metodo ad altre malattie.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione di microRNA circolanti mediante PCR digitale fornisce un approccio riproducibile e ad alta sensibilità per la validazione di biomarcatori nella ricerca sulle malattie cardiovascolari. Questo metodo supporta la validazione degli obiettivi e lo sviluppo di saggi consentendo una quantificazione assoluta senza curve standard, riducendo la variabilità negli studi multicentrici. La tecnica aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta collegando l'espressione di miRNA alla patologia, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nella verifica di ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando miRNA specifici per la malattia, come miR-499 nell'infarto miocardico acuto (AMI).
- Valore operativo: Fornisce il numero assoluto di copie di miRNA senza l'uso di curve standard, migliorando la riproducibilità tra diversi siti.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli basata su biomarcatori collegando i livelli di miRNA alla patologia cardiovascolare.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Genera sistemi biologici validati (cDNA da RNA sierico) per flussi di lavoro di screening successivi.
- Valore operativo: Fornisce risultati con elevata linearità e bassa variabilità, adatti alla standardizzazione dei saggi.
- Scalabilità: Consente l'elaborazione di 96 campioni in circa un'ora una volta ottimizzato, supportando lo screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la quantificazione di miRNA nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso biomarcatori sierici rilevanti per la malattia.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità nella validazione del target correlando l'espressione di miRNA con il danno cardiovascolare.
- Allineamento del biomarcatore: Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali quantificando miRNA con elevata specificità tissutale e per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi all'identificazione del composto attivo, fornendo dati quantitativi sui miRNA che informano sul livello di confidenza del bersaglio e sulla prontezza del saggio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando il rilascio di miRNA da cellule cardiovascolari in circolo.
- Screening: Produce output standardizzati pronti per il saggio, con elevata sensibilità per la valutazione di candidati biomarcatori.
- Analisi: Permette il confronto diretto dei livelli di miRNA tra diverse condizioni mediante quantificazione assoluta, senza l'uso di curve standard.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità del biomarcatore collegando i profili di miRNA circolanti alla patologia cardiovascolare.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di quantificazione riutilizzabile applicabile in ambito cardiovascolare e oncologico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sulla validità del biomarcatore grazie a una quantificazione degli miRNA a bassa variabilità e ad alta sensibilità.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione mediante il partizionamento in goccioline, eliminando misurazioni duplicate.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle relazioni tra biomarcatore e bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento proporzionato al rischio grazie a dati quantitativi sugli miRNA associati alla patologia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento dell'RNA, nella trascrizione inversa e nella manipolazione delle goccioline per prevenire la perdita di campione.
- Necessita di attrezzature per la generazione di goccioline, termociclatori per PCR e software per dPCR per una quantificazione accurata.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nei protocolli di formazione e sigillatura delle goccioline per ottenere risultati riproducibili.
- Comprende considerazioni di adattamento quando si applica a tipi di campioni diversi dal siero, come plasma o lisati tessutali.
- Presenta limitazioni pratiche, come la manipolazione delicata delle goccioline, che potrebbe influire sulla produttività per gli utenti inesperti.
