Name: PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nellinfarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Impara la PCR digitale per quantificare i microRNA circolanti come biomarcatori nelle malattie cardiovascolari. Questo metodo offre maggiore accuratezza rispetto alla PCR in tempo reale, analizzando migliaia di goccioline senza curve standard.

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Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

1. estrazione di miRNA da Plasma/siero
Nota: Al fine di quantificare i miRNA in modo appropriato, l'isolamento di microRNA corretta dal plasma/siero è un passo cruciale. Una cosa fondamentale da tenere a mente, soprattutto perché esistono diversi protocolli, è di aderire al flusso di lavoro stesso durante l'elaborazione dei campioni. In questo protocollo, miRNA è estratta da 50 µ l di siero. Non utilizzare più di 200 µ l come questo limite il processo di estrazione corretta.
<ol><li>Preparare il siero o scongelare i campioni congelati.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l (5 volumi) di reagente di lisi commerciale 50 µ l di siero. Sostenere la lisi nel Vortex. Posizionare il tubo con il lisato sul banco a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Spike il lisato con 3,5 µ l di controllo di spike (1,6 x 107 copie / µ l) e mescolare nel Vortex.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di cloroformio (cioè, un importo pari per quanto riguarda il campione di siero di partenza) per la separazione di fase. Agitare energicamente il tubo per 15 s. posto il tubo sul banco a temperatura ambiente per 2-3 min.</li>
	<li>Per la separazione di fase, centrifugare la provetta a 12.000 x g a 4 ° C per 15 min. Nota: I campioni sono ora separati in una fase acquosa superiore contenente il RNA, un bianco interfase e una fase organica inferiore, rosa.</li>
	<li>Trasferire la fase acquosa superiore (100 µ l) contenente il RNA in un nuovo tubo. Non trasferire qualsiasi materiale bianco interfase come questo falsifica il conteggio corretto di RNA.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l (cioè, 1,5 volte il volume del campione trasferito) di etanolo al 100%. Mescolare i materiali li pipettando su e giù. Non centrifugare li e rapidamente passare al passaggio successivo.</li>
	<li>Pipettare 250 µ l del campione su una colonna commerciale spin in un tubo di raccolta da 2 mL. Chiudere il coperchio. Centrifugare la colonna > 8.000 x g e a temperatura ambiente per 15 s. scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Aggiungere 700 µ l di numero di buffer di lavaggio commerciale 1 nella colonna di selezione. Chiudere il coperchio e centrifugare la colonna > 8.000 x g e a temperatura ambiente per 15 s. scartare il tampone di lavaggio di prova generale.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di numero di buffer di lavaggio commerciale 2 nella colonna di selezione. Chiudere il coperchio e centrifugare colonna in > 8, 000 x g a temperatura ambiente per 15 s. scartare il tampone di lavaggio di prova generale.</li>
	<li>Pipettare 500 µ l di etanolo di 80% per la colonna di spin. Chiudere il coperchio, centrifugare la colonna a > 8, 000 x g e a temperatura ambiente per 2 min. gettare la provetta di raccolta con il flusso continuo.</li>
	<li>Trasferire la colonna di rotazione ad un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare la colonna a tutta velocità con un coperchio aperto ad asciugare la membrana. Gettare la provetta di raccolta con il flusso continuo.</li>
	<li>Trasferire la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta di 1,5 mL. Eluire il RNA applicando 30 µ l di acqua RNAsi-libera direttamente al centro della membrana. Chiudere il coperchio. Centrifugare la colonna a tutta velocità per 1 min.</li>
	<li>Conservare il RNA-70 ° C. Nota: Il deposito di RNA purificato in acqua RNAsi-libera tra-70 ° C a-20 ° C non assicura nessuna degradazione del RNA per 1 anno. Seguendo il protocollo del produttore, l'importo minimo di RNAsi-libera di acqua per diluire il RNA è 10 µ l. utilizzando meno di 10 µ l insufficientemente può idratare la membrana e riducono il rendimento di RNA totale.</li>
</ol>2. trascrizione inversa
Nota: Il DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato utilizzando il seguente protocollo di trascrizione inversa (RT) di 15 µ l (volume di reazione totale).
<ol><li>Scongelare il kit RT sul ghiaccio. Mantenere gli enzimi nel congelatore finchè possibile impedire loro di degradante e loro si sono fermati prima dell'uso. Scongelare i primer RT sul ghiaccio e li spin giù prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare il mix master come descritto nella tabella 1.</li>
	<li>Unire 10 µ l di mix master e 5 µ l di RNA estratto per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Centrifugare la piastra ben a 2.000 x g a 4 ° C per 2 min.</li>
	<li>Utilizzare il protocollo di ciclo termico descritto in tabella 2 per la trascrizione d'inversione. Nota: Come descritto di seguito, cDNA può direttamente essere trattato nella macchina digitale PCR (Vedi Tabella materiali); in alternativa, può essere conservato a-20 ° C.</li>
</ol>3. gocciolina generazione e digitali PCR
Nota: Digital PCR è stata effettuata utilizzando il seguente protocollo di 40 µ l.
<ol><li>Scongelare il mix commerciale dPCR, il cDNA preparato e gli iniettori PCR sul ghiaccio. Centrifugare a loro poco prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare il mix master, come descritto in tabella 3.
</li>
	<li>Aggiungere 1,33 μL/pozzetto del prodotto RT ed e centrifugare.</li>
	<li>Pipettare 20 μL del campione in ciascun pozzetto della cassetta 8 pozzetti (media riga). Nota: Se la cassetta 8 pozzetti non è completamente riempita, riempire i pozzetti rimanenti con controlli non modello (NTCs) che omettono di cDNA (cioè, il prodotto di RT producerat con acqua invece di RNA estratto) o buffer commerciale dPCR. La NTC serve come un controllo di contaminazione. Acqua non deve essere utilizzato nei restanti pozzetti, perché che potrebbe compromettere la qualità della formazione delle gocce.</li>
	<li>Pipettare 70 μL dell'olio di generazione di goccia per le sonde in pozzi di petrolio (riga inferiore) della cassetta 8 pozzetti.</li>
	<li>Posizionare una guarnizione sopra la cassetta 8 pozzetti e inserire la cassetta nel generatore di goccia. Chiudere il generatore di goccia. Attendere che le spie 3 sono verde fisso. Nota: Le goccioline vengono ora generate.</li>
	<li>Lentamente e con cautela trasferire 40 μL del campione formato della gocciolina (riga superiore) in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti di pipettaggio.</li>
	<li>Dopo aver completato la formazione della gocciolina sui campioni, sigillare la piastra PCR con un foglio di dPCR PERFORABILE a 180 ° C per 4 s.</li>
	<li>Posizionare la piastra PCR a lamina-sigillato nel ciclatore e azionarla come descritto nella tabella 4, ad un tasso di rampa di 2,5 ° C/s.</li>
</ol>4. gocciolina lettura e l'analisi
<ol><li>Trasferire la piastra dal termociclatore alla base del proprietario del piatto. Serrare la piastra PCR posizionando ilvertice il portatarga sulla piastra di PCR.</li>
	<li>Avviare il software commerciale dPCR.</li>
	<li>Immettere il nome di esempio, il nome dell'esperimento e il bersaglio nel setup. Selezionare la quantificazione assoluta.</li>
	<li>Avviare la gocciolina lettura facendo clic su Esegui. Selezionare FAM/HEX o FAM/VIC come chimica di rilevamento quando si lavora con sonde di idrolisi. Nota: Il software commerciale dPCR quindi auto-analizzerà i dati.</li>
	<li>Controllare i numeri di goccia nella tabella dei risultati per garantire una generazione corretta della gocciolina.</li>
	<li>Selezionare tutti i pozzetti con la stessa miRNA quantificato e fare clic su analizza. Utilizzare il blot 2D per contrassegnare le goccioline positive e correggere manualmente i dati auto-analizzati (Figura 1).</li>
</ol>5. correggere i calcoli sul campione
<ol><li>Normalizzare l'esempio moltiplicando il campione per il fattore di normalizzazione (NF). NF = mediana [c. elegans miR-39 misure]tutti i campioni/ [c. elegans miR-39]dato campione
</li>
	<li>Calcolare la concentrazione nel siero di miRNA finale, regolazione per fattori di diluizione (DF). [miRNA] finale = [miRNA]valore raw x DFRT x DFdPCR x DFEx Dove: [miRNA] valore non elaborato = il miRNA quantificato dal software commerciale dPCR; DFRT = il fattore di diluizione del modello nella trascrizione d'inversione; DFdPCR = il fattore di diluizione del modello in dPCR; DFEx = il fattore di diluizione nell'estrazione.</li>
</ol>6. serie di diluizioni di Oligonucleotide sintetico
<ol><li>Scongelare i liofilizzati oligonucleotide sintetico sul ghiaccio. Brevemente e centrifugare.</li>
	<li>Diluire il liofilizzato oligonucleotide sintetico in acqua priva di nucleasi a una concentrazione finale di 10 pmol / µ l. brevemente centrifuga esso.</li>
	<li>Diluire in acqua priva di nucleasi come descritto nella tabella 5. Centrifugare la diluizione brevemente tra ogni fase di diluizione a 8.000 x g per 10 s.</li>
	<li>Proseguire con la trascrizione d'inversione come descritto nel passaggio 2 e analizzare i campioni con PCR digitale come descritto nei passaggi 3 e 4.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
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<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
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<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Digitale PCR è un metodo relativamente nuovo end-point di PCR che permette la quantificazione assoluta diretta degli acidi nucleici all'interno di un campione. Il metodo possiede particolari vantaggi, tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana e una sensibilità superiore11,12. Inoltre, dovuto il partizionamento del campione in analisi di endpoint e circa 20.000 singole reazioni, dPCR è più robusto per sostanze interferenti nel...

Mirna circolanti sono stati identificati come promettenti marcatori per un certo numero di malattie, compreso la malattia cardiovascolare1. I miRNA sono piccoli, non codificanti molecole di RNA singolo-incagliato (lunghe circa 22 nucleotidi) sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale attraverso l'alterazione della traduzione di RNA messaggero e d'influenza gene expression2 e vengono rilasciati nella circolazione negli Stati sia fisiologiche che patologiche. L'espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato alla patologia e alcuni miRNA Mostra alto tessuto e malattia specificità1. Nelle malattie cardiovascolari, Mirna sono diventati i candidati attraenti come nuovi biomarcatori perché sono notevolmente stabili nel siero e può facilmente essere quantificati con l'aiuto di PCR metodologia3. Il valore potenziale di Mirna come biomarcatori per infarto del miocardio è stato valutato in piccoli studi, ma una convalida in larghe coorti è carente2. Ad esempio, miR-499 è trovato altamente espressi nel muscolo del miocardio, e ha dimostrato di essere significativamente aumentata in un AMI4,5,6. Inoltre, esso regola programmato la morte delle cellule (apoptosi) e la differenziazione dei cardiomiociti e così è compreso in parecchi meccanismi segue un AMI7. A parte alcuni piccoli studi che riferiscono una superiorità e il valore incrementale di Mirna per la diagnosi di AMI, la superiorità o uguaglianza di alto-sensibilità troponine cardiache non è ancora stato dimostrato in studi su larga scala2,5 ,6,8. Ulteriori studi prospettici in larghe coorti sono, pertanto, necessari per valutare il potenziale valore diagnostico di Mirna. Inoltre, metodi di quantificazione di miRNA devono essere ottimizzate e9di protocolli standardizzati utilizzando comparabili. Analisi standardizzate possono ridurre risultati incoerenti e possono aiutare Mirna a diventare potenziali biomarcatori per l'applicazione clinica di routine, come biomarcatori devono essere quantificati in modo riproducibile per garantire la loro applicabilità clinica.
Recentemente, dPCR è stato introdotto come un'analisi di punto finale. Esso suddivide il campione in circa 20.000 reazioni individuali10. Il sistema di dPCR utilizza quindi una matematico Poisson analisi statistica dei segnali fluorescenti (reazioni positive e negative), che consente una quantificazione assoluta senza una curva standard10. Quando si combinano dPCR con sonde fluorescenti idrolisi, la quantificazione assoluta diretta altamente specifica dei miRNA è reso possibile. Reazione a catena della polimerasi digitale ha dimostrato che mostra qualità tecniche superiori (tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana, un alto grado di linearità e un'alta sensibilità) per quantificare i livelli di miRNA nella circolazione rispetto al quantitativo in tempo reale PCR10,11. Queste qualità tecniche superiori potrebbe contribuire ad per attenuare le attuali limitazioni sull'utilizzo di Mirna circolanti come biomarcatori e può condurre all'istituzione di Mirna come biomarcatori in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center e come metodo diagnostico in generale. In uno studio precedente, abbiamo recentemente applicato dPCR per la quantificazione assoluta di Mirna in pazienti con IMA in circolazione e sono stati in grado di dimostrare il potenziale diagnostico superiore rispetto alla quantificazione dei miRNA qPCR12.
In questa pubblicazione, vogliamo dimostrare che l'utilizzo di dPCR è un metodo accurato e riproducibile per quantificare direttamente la circolazione cardiovascolari Mirna. La quantificazione assoluta di miRNA livelli nel siero, usando la PCR digitale, Mostra il potenziale per l'uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo in dettaglio come eseguire efficacemente PCR digitale e come rilevare il numero di copie di miRNA assoluta nel siero.

<table><tbody><tr><td>RNA-Extraction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)</td><td>Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Kit per l'estrazione di microRNA. Il kit contiene il tampone commerciale RWT (chiamato numero uno nel manoscritto)... e RPE (chiamato numero due nel manoscritto).</td></tr><tr><td>miRNeasy Picco di siero/plasma in controllo; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol</td><td>Qiagen-Campione & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in per la normalizzazione, Sequenza: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td>Trascrizione inversa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA (1000 reazioni)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>Kit 4366597</td><td>per la trascrizione inversa di microRNA</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Saggi utilizzati nella trascrizione inversa</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Numero di test 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Numero di test 000200</td></tr><tr><td>Piastra PCR, 96 pozzetti, segmentata, semi-gonna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AB0900</td><td>Piastra a 96 pozzetti per trascrizione inversa</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; sigillo Seals</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>MSB1001</td><td>Lamina per garantire una corretta conservazione</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler utilizzato per la trascrizione inversa</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p</td><td>Tecnologie DNA integrate Personalizzato</td><td></td><td>Sequenza: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix per sonde (No dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863024</td><td>Supermix utilizzato nella generazione di goccioline</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Saggi utilizzati nella PCR digitale (sonda di idrolisi fluorescente)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Saggio numero 001352, primer commerciali</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Numero di saggio 000200, primer commerciali</td></tr><tr><td>DG8 Cartucce e guarnizioni</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864007</td><td>Cartuccia preleva fino a 8 campioni per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>Cartuccia DG8 Holder</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863051</td><td>Contiene cartucce per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>Olio per la generazione di goccioline per sonde</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863005</td><td>Olio utilizzato per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>ddPCR Piastre a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td></td><td>12001925 Piastra a 96 pozzetti per ddPCR</td></tr><tr><td>PCR Piastra termosaldabile, lamina, perforabile</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814040</td><td>Lamina perforabile, compatibile con il lettore di gocce</td></tr><tr><td>ddPCR Olio per lettore di gocce</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863004</td><td>Olio utilizzato per la lettura delle goccioline</td></tr><tr><td>Generatore di gocce QX100 o QX200</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863002</td><td>Generatore di gocce, genera le goccioline dall'emulsione campione/olio</td></tr><tr><td>PX1 PCR Sigillante per piastre</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814000</td><td>Sigilla la piastra prima della PCR</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler utilizzato per il lettore di gocce ddPCR</td></tr><tr><td>QX100 o QX200</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863003</td><td>Legge goccioline positive e negative alla PCR con un rilevatore ottico</td></tr><tr><td>Controllo tampone ddPCR per sonde</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863052</td><td>Controllo del bianco&nbsp; e per riempire i pozzetti rimanenti di 8-well cassette</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864011</td><td>Programma per la lettura delle goccioline</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td>Programma per l'analisi statistica</td></tr></tbody></table>

pcr digitale per quantificare circolanti microrna nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circolanti nel siero i microRNA (Mirna) hanno indicato la promessa come biomarcatori per la malattia cardiovascolare ed infarto miocardico acuto (AMI), rilasciato dalle cellule cardiovascolari nella circolazione. Mirna circolanti sono altamente stabili e possono essere quantificati. L'espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato per la patologia e alcuni miRNA Visualizza alta tessuto e specificità di malattia. Trovare nuovi biomarcatori per le malattie cardiovascolari è di importanza per la ricerca medica. Abbastanza recentemente, reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) è stata inventata. dPCR, combinato con sonde fluorescenti idrolisi, consente specifica diretta quantificazione assoluta. dPCR esibisce qualità tecniche superiori, tra cui una bassa variabilità, alta linearità e alta sensibilità rispetto alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Così, dPCR è un metodo più accurato e riproducibile per quantificare direttamente Mirna, specialmente per l'uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo come eseguire efficacemente PCR digitale al fine di valutare il numero di copia assoluta nei campioni di siero.

PCR digitale combinato con sonde fluorescenti idrolisi consente ai ricercatori di quantificare direttamente gli importi assoluti di miRNA specifici in copie / µ l. Come l'esempio in dPCR è partizionata in circa 20.000 singole reazioni di PCR, dPCR non richiede tecniche replica10. Il sistema di dPCR utilizza un'analisi statistica di Poisson matematica dei segnali fluorescenti (differiscono tra reazioni positive e negative) che consente una quantificazione assoluta s...

MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l'estrazione di miRNA, trascrizione d'inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.

PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo diagnostico, come ad esempio se i micro RNA sono biomarcatori validi nelle malattie cardiovascolari. Rispetto alla PCR quantitativa in tempo reale, la PCR digitale presenta qualità tecniche superiori per quantificare i microRNA in circolazione. Poiché il campione è diviso in circa 20.000 goccioline, non sono necessarie misurazioni duplicate e non è necessaria alcuna curva standard per la quantificazione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla quantificazione dei microRNA nei pazienti cardiovascolari, può essere applicato anche ad altri pazienti e malattie, poiché altri microRNA si sono dimostrati promettenti come biomarcatori nella progressione del cancro, può essere applicato anche ai pazienti oncologici. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le goccioline generate sono fragili e devono essere maneggiate con cura. Dopo aver isolato l'RNA dai campioni di siero, continuare con la trascrizione inversa per ottenere un DNA complementare più stabile per la dPCR.Per iniziare, scongelare il kit di trascrizione inversa con ghiaccio. Quindi far girare gli enzimi e i pr

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Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Viene descritto un metodo sensibile e accurato per la quantificazione di microRNA privi di cellule utilizzando una chimica basata su coloranti e una tecnologia PCR digitale a goccioline.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR, con o senza pre-amplificazione. Questo protocollo offre una migliore comprensione della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione qualitativa dei dati corrispondenti da diversi studi o laboratori.

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Questo articolo presenta un protocollo per rilevare l'espressione di microRNA nei reni di un modello murino di insufficienza renale acuta utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa in tempo reale. Questo protocollo enfatizza un modello murino di danno renale ischemico e l'attenta estrazione di campioni di microRNA.

Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.

Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Il modello di topo di infarto miocardico acuto (AMI) è utile per studiare la conseguenza di un infarto miocardico sulla funzione cardiaca fisiopatologici e fisiologici.

Infarto acuto del miocardio in topi

Impara la PCR digitale per quantificare i microRNA circolanti come biomarcatori nelle malattie cardiovascolari. Questo metodo offre maggiore accuratezza rispetto alla PCR in tempo reale, analizzando migliaia di goccioline senza curve standard.

PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

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