PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo diagnostico, come ad esempio se i micro RNA sono biomarcatori validi nelle malattie cardiovascolari. Rispetto alla PCR quantitativa in tempo reale, la PCR digitale presenta qualità tecniche superiori per quantificare i microRNA in circolazione. Poiché il campione è diviso in circa 20.000 goccioline, non sono necessarie misurazioni duplicate e non è necessaria alcuna curva standard per la quantificazione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla quantificazione dei microRNA nei pazienti cardiovascolari, può essere applicato anche ad altri pazienti e malattie, poiché altri microRNA si sono dimostrati promettenti come biomarcatori nella progressione del cancro, può essere applicato anche ai pazienti oncologici. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le goccioline generate sono fragili e devono essere maneggiate con cura. Dopo aver isolato l'RNA dai campioni di siero, continuare con la trascrizione inversa per ottenere un DNA complementare più stabile per la dPCR.

Per iniziare, scongelare il kit di trascrizione inversa con ghiaccio. Quindi far girare gli enzimi e i primer verso il basso. Successivamente, preparare la miscela master come descritto nel protocollo di testo.

Combinare 10 microlitri della miscela master con cinque microlitri di RNA estratto in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi centrifugare la piastra a 2.000xg a quattro gradi Celsius per due minuti. Procedi con la trascrizione inversa come dettagliato nel protocollo di testo.

Innanzitutto, scongelare la miscela commerciale di dPCR, i primer di cDNA e PCR su ghiaccio e centrifugare immediatamente prima dell'uso. Preparare quindi il master mix come descritto nel testo protocollo. Aggiungere 1,33 microlitri di volume di prodotto di trascrizione inversa a 18,67 microlitri di volume della miscela master e centrifugare brevemente.

Utilizzando una pipetta, trasferire 20 microlitri di campione in ciascun pozzetto della fila media di una cassetta da otto pozzetti. Quindi versare 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline nei pozzetti dell'olio della cassetta. Quindi, posizionare una guarnizione sopra la cassetta e posizionarla nel generatore di gocce.

Chiudere il generatore di gocce e attendere che le tre spie siano verdi fisse. Utilizzando una pipetta, trasferire con cura 40 microlitri del campione formato da goccioline in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Quindi sigillare la piastra con un foglio dPCR a 180 gradi Celsius per quattro secondi.

Posizionare la piastra PCR sigillata nel ciclatore e seguire le istruzioni per il ciclo descritte nel protocollo di testo. Togliere la piastra dal termociclatore e trasferirla sulla base di un portapiatti. Quindi posizionare la parte superiore del supporto della piastra sulla piastra PCR.

Infine, avvia il software commerciale dPCR. In questo protocollo, la PCR digitale è stata utilizzata per quantificare i microRNA nel siero di pazienti con malattie cardiovascolari. I campioni sono stati prelevati da 16 pazienti prima, otto ore dopo e 16 ore dopo l'intervento percutaneo.

I pazienti con infarto miocardico con sopraslivellamento del tratto ST hanno mostrato un aumento significativo dei livelli di miR-499 rispetto ai pazienti con malattia coronarica stabile. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora per la formazione di goccioline di 96 campioni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente di maneggiare le goccioline con cura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire correttamente la PCR digitale, la corretta formazione delle goccioline, il ciclo, la lettura e l'analisi.