Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i microRNA circolanti e i fluidi biologici, come il plasma o il siero, utilizzando la tecnologia PCR digitale a goccioline. Il metodo può aiutare a rispondere alle domande nel campo dei biomercati. Identificando il cancro diagnostico e prognostico, biomarketing.

Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata sensibilità. Può essere utilizzato per quantificare anche i microRNA meno abbondanti senza richiedere un gene di riferimento androgino. Le implicazioni di questo metodo si estendono alla diagnostica del cancro perché ha il potenziale per identificare le persone con cancro in fase iniziale.

Può essere applicato anche ad altre malattie come disturbi neurologici o cardiaci. In generale, gli individui devono prestare attenzione alla manipolazione delle goccioline prima della fase del ciclo termico per evitare la loro interruzione. Pertanto, una dimostrazione visiva della generazione di goccioline è fondamentale perché le goccioline possono essere distrutte da una manipolazione incauta o da un pipettaggio troppo veloce.

Inizia questa procedura isolando i microRNA plasmatici o sierici. Quindi trascriverli in senso inverso e diluirli come descritto nel documento di accompagnamento. Rimuovere il set di primer per microRNA EvaGreen e il cDNA dal congelatore e lasciarli scongelare a temperatura ambiente.

Dopo che si è scongelato, capovolgere più volte il tubo di miscelazione master. E poi centrifugare tutti i reagenti. Preparare una soluzione di lavoro digitale per goccioline o miscela ddPCR secondo le istruzioni nel documento di accompagnamento.

Preparare una quantità sufficiente per un massimo di otto campioni con un controllo senza modello per ogni condizione più un eccesso del 10%Una volta assemblato, mescolare accuratamente e centrifugare la miscela ddPCR. Si noti che le repliche tecniche non sono necessarie a causa dell'elevata riproducibilità di questa tecnologia. Dopo la centrifuga, erogare 12 microlitri di miscela ddPCR in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.

Aggiungere otto microlitri di modello di cDNA diluito a ciascun pozzetto. Quindi inserire la cartuccia del generatore di gocce nel supporto della cartuccia. Nella fila centrale della cartuccia del generatore di gocce, trasferire con cura 20 microlitri di ciascun campione preparato.

Evitare di introdurre bolle d'aria sul fondo del pozzo. Riempi ciascuno dei pozzi petroliferi nella fila inferiore con 70 microlitri di olio generatore di goccioline. Agganciare la guarnizione al supporto della cartuccia.

Inserire nel generatore di gocce e chiudere il coperchio per avviare la generazione di goccioline. Al termine della generazione di goccioline, aprire il coperchio, rimuovere la cartuccia dal generatore di gocce e rimuovere la guarnizione monouso. I pozzetti superiori della cartuccia contengono le goccioline.

Trasferire lentamente e senza intoppi 40 microlitri da ciascuno degli otto pozzetti superiori in una singola colonna di una piastra PCR a 96 pozzetti. Sigillare immediatamente la piastra con un foglio per evitare l'evaporazione. Entro 30 minuti dalla sigillatura della piastra, iniziare il ciclo termico utilizzando il protocollo PCR descritto nella tabella tre del documento di accompagnamento.

Accendere il lettore di gocce. Quindi spostare la piastra dal termociclatore al lettore di gocce. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti contenente le goccioline post-PCR nella base del supporto della piastra nel lettore di gocce.

Posizionare la parte superiore del supporto della piastra sulla piastra PCR. Premere con decisione entrambe le linguette di rilascio verso il basso per fissare la piastra PCR nel supporto. Avviare il software QuantaLife dal PC di sistema. Fare clic su Imposta e aprire il file di dati del modello che contiene informazioni sui campioni, i geni target e i saggi.

Dalla barra di spostamento a sinistra, seleziona Esegui. Verrà visualizzata una finestra Opzioni di esecuzione. Dal menu Set di coloranti, selezionare EVA e fare clic su OK per avviare la lettura delle goccioline.

Una volta completata la corsa, utilizzare il grafico dell'ampiezza 2D nel software di analisi per selezionare le goccioline positive. Per selezionare le goccioline positive, utilizzare lo strumento lazo dalla barra di navigazione sul lato sinistro. Quindi, fai clic sulla scheda Eventi per controllare il numero di goccioline positive e totali.

Di solito si ottiene un numero totale di 18.000 goccioline con la ddPCR senza sonda. Quindi fare clic sulla scheda Concentrazione per visualizzare il campione finale di concentrazione. Infine usa l'opzione Esporta.

CSV per esportare i valori di concentrazione dei microRNA. L'mRNA miR-181a-5p è stato quantificato in due campioni di plasma, S1 e S2, utilizzando una concentrazione di primer di 0,5 e un microlitro a temperature di ricottura di 58 e 60 gradi Celsius. Questa figura presenta le copie di microRNA per microlitro nella reazione di amplificazione per ciascuna condizione.

goccioline positive alla PCR per ciascun campione sono mostrate in blu e le goccioline negative sono mostrate in nero. Come si può vedere qui, il campione di controllo non ha goccioline positive come previsto. L'esecuzione della PCR a 60 gradi Celsius con l'utilizzo di 0,5 o un microlitro di primer ha portato a una migliore separazione delle goccioline positive e negative.

In questa figura, le barre di errore rappresentano l'intervallo di confidenza di Poisson del 95%. E qui, il numero di goccioline positive mostrate in blu, viene confrontato con il numero totale di goccioline, mostrato in verde. Presi insieme, questi dati dimostrano che la PCR digitale a goccioline può essere utilizzata per determinare il numero assoluto di copie di microRNA per microlitro di un fluido biologico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire una quantificazione dell'mRNA utilizzando la PCR digitale a goccioline. Una volta padroneggiati, 96 campioni possono essere analizzati in poche ore, il che è un risultato ottimale per un ambiente clinico. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada al campo della biopsia liquida per esplorare i microRNA e altri acidi nucleici come biomarcatori della malattia.