Name: Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri la quantificazione dei microRNA circolanti nel plasma e nel siero mediante droplet digital PCR con chimica a colorante DNA-binding. Questo metodo altamente sensibile consente di rilevare biomarcatori diagnostici e prognostici nel cancro senza necessità di geni di riferimento.

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Sostenuto da un finanziamento dell&#39;Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) a MF (MFAG 11676) e di MN (Programma Speciale Oncologia Molecolare Clinica -. 5 per mille 9980 n, 2010/15) e dal Ministero Italiano dell&#39;Istruzione, dell&#39;Università e della La ricerca FIRB 2011 al MN (Progetto RBAPIIBYNP).

MicroRNA Isolamento da plasma o siero Nota: Plasma e la preparazione del siero è un passo rilevante in circolazione miRNA quantificazione. Non esiste una procedura preferita per il plasma e preparazione del siero. L&#39;unica cosa importante da considerare è che tutti i campioni dello stesso esperimento devono essere elaborati usando esattamente lo stesso flusso di lavoro. Inizia dal siero 200 ml o plasma. RNA totale può essere isolato dal siero o plasma utilizzando kit disponibili in commercio. 1. Protocollo per RNA totale (compresi i miRNA) Isolamento <ol><li> campioni di siero / plasma Scongelare su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 1 ml di Reagente di Lisi (ad es., QIAzol) a 200 ml di siero / plasma. </li><li> Mescolare nel vortex e posizionare il tubo contenente l&#39;omogeneizzato in panchina a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 3 ml di una soluzione 4.16 nM del sintetico miRNA cel-miR-39-3p da C. elegans. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio. Agitare la provetta con forza per 15 sec. ° postoe tubo in panchina a temperatura ambiente per 2 minuti. </li><li> Centrifugare per 15 min a 12.000 xga 4 ° C per ottenere la separazione fasi: la fase acquosa superiore contiene RNA. </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta, circa 700 ml, evitare il trasferimento di qualsiasi materiale interfase bianco. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 100% e miscelare per inversione. </li><li> Pipettare su 700 ml di campione in una colonna di mini rotazione collocato su un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a 12.000 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Ripetere questa operazione con il campione rimanente. </li><li> Aggiungere 700 microlitri di buffer RWT alla colonna mini rotazione, chiudere il coperchio e centrifugare per 15 secondi a 12.000 xg per lavare la colonna. Gettare il flow-through. </li><li> Dispensare 500 microlitri Buffer RPE nella colonna mini rotazione. Chiudere il coperchio e centrifugare per 15 sec a 12.000 rpm. Gettare il flow-through. Ripetere questo passaggio. </li><li> Centrifugare la colonna di spin mini a tutta velocità per 2 minuti per asciugare la colonna di spinmembrana da etanolo residuo. </li><li> Trasferire la colonna mini centrifuga in una nuova provetta da 1,5 ml raccolta e acqua priva di RNasi pipetta 35 microlitri sulla membrana della colonna. </li><li> Centrifugare per 1 min a 12.000 xg per eluire l&#39;RNA. </li><li> Conservare l&#39;RNA a -80 ° C. Nota: Dal momento che la concentrazione di RNA non può essere determinata con precisione, utilizzare volumi fissi come misura per la quantità di input. </li></ol> 2. MicroRNA trascrizione inversa <ol><li> Scongelare la trascrizione inversa (RT) Componenti miscela reagente: tampone di reazione 5x, acqua priva di nucleasi. Mescolare capovolgendo delicatamente i tubi e posto sul ghiaccio. Immediatamente prima dell&#39;uso, rimuovere la miscela enzimatica dal congelatore e disporli sul ghiaccio. Spin giù tutti i reagenti. </li><li> Preparare la miscela reagente RT su ghiaccio come descritto nella Tabella 1. Preparare almeno il 10% della miscela superiore. </li><li> Mescolare la reazione pipettando, e poi spin down. </li><li> Incubare per 60 min a 42 ° C. </li><li> Heat-inattivare i reverSE trascrittasi per 5 minuti a 95 ° C. </li><li> Immediatamente raffreddare a 4 ° C. </li><li> Conservare il cDNA a -20 ° C. </li></ol> 3. cDNA diluizione <ol><li> Diluire la quantità di cDNA necessari per le reazioni ddPCR previste in acqua priva di nucleasi. Diluire la reazione cDNA tra 1:50 e 1: 500 in acqua, a seconda bersaglio miRNA abbondanza. Conservare il cDNA diluito a -20 ° C. Il cDNA diluito dimostrato di essere stabile per almeno 3 mesi a -20 ° C. </li></ol> 4. Droplet generazione e PCR Nota: generazione gocciolina deve essere eseguita su 8 campioni per volta. Repliche tecniche non sono tenuti, a causa della elevata riproducibilità di questa tecnologia 12,15 .A No Control Template (NTC) campione deve essere eseguito in ogni piatto e per ogni diversa condizione ddPCR. <ol><li> Scongelare ed equilibrare il mix master (ad es., EvaGreen Master Mix), microRNA Primer set e cDNA a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare il Master Mix °oroughly invertendo la provetta diverse volte. Spin giù tutti i reagenti. </li><li> Preparare il mix ddPCR come descritto nella Tabella 2. Quando si eseguono più reazioni ddPCR, preparano una ddPCR mix di lavoro-soluzione. Preparare almeno il 10% superiore a miscela. </li><li> Una volta assemblato, mescolare bene e spin down mix ddPCR. </li><li> Dispensare 12 ml di ddPCR mescolano in un pozzo-96 piastra PCR o provette PCR. </li><li> Aggiungere 8 ml di cDNA diluito in ogni provetta / bene. </li><li> Inserire la cartuccia generatore di gocce nel supporto. </li><li> Trasferire 20 microlitri di ciascun campione preparato ai pozzetti del campione (fila centrale) della cartuccia generatore gocciolina accuratamente evitando bolle d&#39;aria nella parte inferiore del pozzo. </li><li> Riempire ogni pozzo di petrolio (riga in basso) con 70 ml di olio di generatore di goccioline. </li><li> Agganciare la guarnizione sopra il supporto della cartuccia e inserire nel generatore di goccioline. </li><li> Chiudere il coperchio per avviare la generazione delle gocce in base al pr del produttoreotocol. Quando la generazione delle gocce è terminata, aprire il coperchio, rimuovere la guarnizione usa e getta. I primi pozzetti della cartuccia contengono le goccioline. </li><li> Pipettare lentamente ed uniformemente 40 ml di contenuto degli otto migliori pozzetti (le goccioline) in un&#39;unica colonna di una piastra a 96 pozzetti PCR. </li><li> Sigillare la piastra PCR con un foglio subito dopo il trasferimento gocce per evitare l&#39;evaporazione. Utilizzare piastra del foil perforabili che sono compatibili con gli aghi nel lettore gocciolina. </li><li> Iniziare cicli termici (PCR) entro 30 minuti dalla chiusura ermetica del piatto. </li><li> Eseguire il protocollo di ciclismo secondo la Tabella 3. </li></ol> 5. Droplet Reading <ol><li> Accendere il lettore goccia. </li><li> Spostare la piastra dal termociclatore al lettore goccia. </li><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti PCR contenente le goccioline post-PCR nella base del supporto piastra. </li><li> Posizionare la parte superiore del portatarga sulla piastra PCR. Premere con forza entrambe le linguette di rilascioper fissare la piastra PCR nel supporto. </li><li> Avviare il software dal PC sistema. <ol><li> Fare clic su Imposta per definire l&#39;esperimento (quantificazione assoluta) quindi fare clic su Esegui per avviare la lettura delle gocce. </li><li> Quando la lettura delle gocce è completo, fare clic sul pulsante per aprire e analizzare i dati &quot;Analizza&quot;. </li><li> Utilizzare la trama di ampiezza 2D nel software di analisi per selezionare le goccioline positivi (lazo) (Figura 1B). </li><li> Utilizzare la scheda Eventi per verificare il numero di goccioline positivi e totali. Un totale di 18.000 - 21.000 goccioline è di solito realizzato con senza sonda ddPCR. </li><li> Una volta che le goccioline positivi sono selezionati, esportare i valori di concentrazione miRNA utilizzando l&#39;opzione di esportazione CSV dalla scheda di concentramento. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

miRNA circolanti sono presenti nel sangue a concentrazioni estremamente basse e la quantità di RNA che può essere estratto da campioni di plasma e siero è basso. Per questo motivo, sono difficili da quantificare con altre tecniche come microarray e RNA sequencing. Inoltre, vi è una generalizzata mancanza di accordo sulla normalizzazione dei dati e la presenza di endogene miRNA &quot;di riferimento&quot; nel sangue. In questo contesto, una tecnologia sensibile come gocciolina PCR digitale, in grado di contare il numero d...

I microRNA (miRNA) vengono rilasciati nella circolazione sanguigna potenzialmente da tutte le cellule dell'organismo, come conseguenza del rilascio attivo o di processi necrotici e apoptotici. I miRNA liberi da cellule sono stati rilevati nel flusso sanguigno come molecole libere e stabili o legate a lipoproteine o avvolte all'interno di esosomi e microvescicole 1-3. Si ritiene che funzionino come comunicatori da cellula a cellula 4 e la loro quantità cambia in presenza di cancro, disturbi cardiaci o malattie autoimmuni 5-7. La loro quantificazione accurata e riproducibile è la base per la loro valutazione come biomarcatori di malattia. Tuttavia, per diverse ragioni già descritte altrove 8,9, la quantificazione dei miRNA nel siero o nel plasma, così come in altri fluidi corporei, potrebbe essere molto impegnativa 10,11. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo per la quantificazione assoluta dei miRNA circolanti, basato su primer LNA specifici per miRNA e sulla tecnologia PCR digitale con gocce di colorante legante il DNA (ddPCR) 12. Questa metodologia è stata applicata alla validazione dei biomarcatori miRNA del cancro al seno 13,14. 
Dopo il partizionamento di ogni molecola di miRNA trascritta inversamente all'interno di una gocciolina delle dimensioni di un nanolitro, è possibile contare il numero di copie di ogni miRNA in ogni campione, contando sostanzialmente il numero di goccioline fluorescenti verdi, e quindi positive. Non appena si verifica una reazione di PCR, si ottiene un conteggio positivo, senza la necessità di stabilire una curva standard o di tenere conto dell'efficienza della PCR nel calcolo della quantità target, come accade con la RT-PCR quantitativa (RT-qPCR). Inoltre, la ddPCR si è dimostrata più sensibile e accurata della RT-qPCR nella quantificazione dei miRNA circolanti 15. In questo articolo presentiamo il protocollo dettagliato di questa metodologia, discutendo i passaggi più rilevanti e considerando in particolare i campioni clinici di siero e plasma.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Colonne per RNA totale, incluso miRNA, estrazione da siero/plasma</td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p</td><td>Tecnologie DNA integrate</td> Sequenza <td>personalizzata</td><td>: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Kit universale di sintesi del cDNA II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>Kit per la trascrizione inversa</td></tr><tr><td>del microRNA Set di primer per PCR MicroRNA LNA&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx e 2100000-21xxxxx</td><td>Primer per l'amplificazione di miRNA all'interno di goccioline</td></tr><tr><td>QX200 Generatore di goccioline</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>Strumento utilizzato per la lettura delle goccioline</td></tr><tr><td>QX200 Lettore di goccioline</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Strumento utilizzato per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Software per la raccolta e l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Sigillante per piastre PCR PX1</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>Sigillante per piastre</td></tr><tr><td>DG8 generatore di gocce Cartucce e guarnizioni</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Cartucce utilizzate per miscelare campione e olio per generare goccioline</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>QX200 Olio generatore di gocce per colorante EvaGreen</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Olio per generazione di goccioline</td></tr></tbody></table>

di circolazione microrna quantificazione utilizzando dna-binding dye chimica e di gocce digital pcr

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Di circolazione (di cell-free) microRNA (miRNA) vengono rilasciati dalle cellule nel flusso sanguigno. La quantità di microRNA specifici in circolazione è stato collegato a uno stato di malattia e ha il potenziale per essere utilizzato come biomarker della malattia. Un metodo sensibile e preciso per circolazione microRNA quantificazione utilizzando una chimica a base di colorante e di gocce tecnologia PCR digitale è stato recentemente sviluppato. In particolare, utilizzando Locked Nucleic Acid (LNA) a base di primer specifici miRNA con un colorante legante il DNA fluorescente verde in un sistema PCR compatibile gocciolina digitale, è possibile avere la quantificazione assoluta di miRNA specifici. Qui, descriviamo come l&#39;esecuzione di questa tecnica per valutare la quantità di miRNA nei fluidi biologici, come il plasma e il siero, è sia fattibile ed efficace.

La quantità assoluta di miRNA specifici per ml di plasma o siero può essere determinato utilizzando un colorante legame al DNA fluorescente verde e di gocce tecnologia PCR digitale. La figura 1 mostra il processo di selezione positiva-goccioline, che determina la concentrazione finale miRNA (copie / ml ) nella reazione di amplificazione calcolata dal software di analisi. L&#39;importo di ciascuna miRNA nel sangue è molto diversa, essendo alcune specie miRNA più abbondant...

Viene descritto un metodo sensibile e accurato per la quantificazione di microRNA privi di cellule utilizzando una chimica basata su coloranti e una tecnologia PCR digitale a goccioline.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i microRNA circolanti nei fluidi biologici, come il plasma o il siero, utilizzando la tecnologia di PCR digitale a goccioline. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo dei biomarcatori. Identificando biomarcatori diagnostici e prognostici, è possibile ottenere informazioni utili nel contesto del cancro.Il principale vantaggio di questa tecnica risiede nell'elevata sensibilità. Può essere utilizzata per quantificare anche i microRNA meno abbondanti senza richiedere un gene di riferimento androgino. Le implicazioni di questo metodo si estendono alla diagnostica del cancro poiché ha la potenzialità di identificare individui con tumore in stadio precoce.È possibile applicarlo anche ad altre malattie come disturbi neurologici o cardiaci. In generale, gli individui devono prestare attenzione alla manipolazione delle goccioline prima del passaggio di ciclaggio termico per evitarne la rottura. Pertanto, una dimostrazione visiva della generazione delle goccioline è fondamentale poiché queste possono essere distrutte da una manipolazione inaccurata o da un’aspirazione troppo rapida con la pipetta.Iniziare questa procedura isolando i microRNA dal plasma o dal siero. Successivamente, effettuare la trascrizione inversa e diluirli come descritto nel documento allegato. Rimuovere dal congelatore il master mix EvaGreen, il set di primer per microRNA e il cDNA e lasciarli scongelare a temperatura ambiente.Dopo lo scongelamento, capovolgere il tubo del master mix più volte. Quindi centrifugare brevemente tutti i reagenti. Preparare una soluzione di lavoro per la digital droplet PCR, o ddPCR, seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato.Preparare una quantità sufficiente per un massimo di otto campioni, con un controllo senza stampo per ogni condizione più un eccesso del 10%. Una volta assemblata, mescolare accuratamente e centrifugare brevemente la miscela di ddPCR. Si noti che non sono richieste repliche tecniche grazie all'elevata riproducibilità di questa tecnologia. Dopo la centrifugazione, distribuire 12 microlitri di miscela di ddPCR in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.Aggiungere otto microlitri di stampo di cDNA diluito in ogni pozzetto. Inserire quindi la cartuccia del generatore di goccioline nel supporto della cartuccia. Nella fila centrale della cartuccia del generatore di goccioline, trasferire con attenzione 20 microlitri di ogni campione preparato.Evitare di introdurre bolle d'aria nella parte inferiore della pozzetta. Riempire ciascuna delle pozzette di olio della fila inferiore con 70 microlitri di olio per il generatore di gocce. Inserire la guarnizione sull'apposito supporto per cartucce.Inserire nel generatore di goccioline e chiudere il coperchio per avviare la generazione delle goccioline. Al termine della generazione, aprire il coperchio, rimuovere la cartuccia dal generatore di goccioline ed eliminare la guarnizione monouso. I pozzetti superiori della cartuccia contengono le goccioline.Trasferire lentamente e delicatamente 40 microlitri da ciascuno degli otto pozzetti superiori in una singola colonna di una piastra PCR a 96 pozzetti. Sigillare immediatamente la piastra con pellicola di alluminio per evitare l'evaporazione. Entro 30 minuti dal sigillaggio della piastra, iniziare il termociclaggio utilizzando il protocollo PCR descritto nella tabella tre del documento allegato.Accendere il lettore di goccioline. Successivamente, spostare la piastra dal termociclatore al lettore di goccioline. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti contenente le goccioline post-PCR alla base del supporto per piastre nel lettore di goccioline.Posizionare la parte superiore del supporto sulla piastra PCR. Premere saldamente entrambe le linguette di rilascio verso il basso per fissare la piastra PCR nel supporto. Avviare il software QuantaLife dal PC di sistema. Fare clic su Setup e aprire il file di dati modello che contiene le informazioni sui campioni, sui geni bersaglio e sui saggi.Dalla barra di navigazione a sinistra, selezionare Esegui. Verrà visualizzata una finestra Opzioni di esecuzione. Dal menu Set di colorante, selezionare EVA e fare clic su OK per avviare la lettura delle goccioline.Al termine della corsa, utilizzare il grafico dell'ampiezza 2D nel software di analisi per selezionare le goccioline positive. Per selezionare le goccioline positive, utilizzare lo strumento lazo presente nella barra di navigazione a sinistra. Successivamente, fare clic sulla scheda Eventi per verificare il numero di goccioline positive e il numero totale di goccioline.Un numero totale di 18.000 goccioline viene solitamente ottenuto con la ddPCR senza sonda. Quindi fare clic sulla scheda Concentrazione per visualizzare il campione finale di concentrazione. Infine, utilizzare l'Esportazione.CSV per esportare i valori di concentrazione del microRNA. L'mRNA miR-181a-5p è stato quantificato in due campioni di plasma, S1 e S2, utilizzando concentrazioni del primer di 0,5 e un microlitro a temperature di annealing di 58 e 60 gradi Celsius. Questa figura mostra il numero di copie di microRNA per microlitro nella reazione di amplificazione per ciascuna condizione.I droplet positivi alla PCR per ogni campione sono mostrati in blu, mentre i droplet negativi sono mostrati in nero. Come si può vedere qui, il campione di controllo non presenta droplet positivi, come previsto. L'esecuzione della PCR a 60 gradi Celsius utilizzando 0,5 o un microlitro di primer ha determinato una migliore separazione tra droplet positivi e negativi.In questa figura, le barre di errore rappresentano l'intervallo di confidenza di Poisson al 95%. Qui, il numero di goccioline positive, mostrato in blu, viene confrontato con il numero totale di goccioline, mostrato in verde. Nel complesso, questi dati dimostrano che la PCR digitale a goccioline può essere utilizzata per determinare il numero assoluto di copie di microRNA per microlitro di un liquido biologico.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una quantificazione dell'mRNA mediante PCR digitale a goccioline. Una volta padroneggiata, è possibile analizzare 96 campioni in sole poche ore, un risultato ottimale per un contesto clinico. Grazie a ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada al campo della biopsia liquida per esplorare il microRNA e altri acidi nucleici come biomarcatori di malattia.

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Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

In questo video, presentiamo una procedura passo-passo per generare nano-goccioline emulsionate per rilevare gli acidi nucleici bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi digitale o dPCR.

Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline: un metodo per generare reazioni di PCR con nanogocce per rilevare rare mutazioni tumorali

In questo video, dimostriamo la tecnica della PCR digitale duplex (ddPCR), una modifica della tradizionale tecnica PCR utile per rilevare contemporaneamente due diversi marcatori genetici. Una singola reazione PCR viene suddivisa in goccioline emulsionate di dimensioni nanolitrometriche che vengono amplificate in modo indipendente e il rilevamento di segnali di amplificazione della fluorescenza di colore diverso dalla frazione di goccioline viene utilizzato per calcolare la concentrazione...

PCR digitale duplex per la quantificazione simultanea di doppi marcatori genetici

I microRNA (miRNA) sono una classe ampiamente conservata di molecole regolatorie. Qui descriviamo un metodo di clonazione dei miRNA che si basa su due potenti fasi di legatura seguite da un sequenziamento ad alto rendimento. Il nostro metodo consente un'accurata quantificazione dell'intero genoma dei miRNA.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR, con o senza pre-amplificazione. Questo protocollo offre una migliore comprensione della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione qualitativa dei dati corrispondenti da diversi studi o laboratori.

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l'estrazione di miRNA, trascrizione d'inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.

PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Qui presentiamo un protocollo per misurare il numero assoluto di copie del DNA mitocondriale (mt) e i livelli di eteroplasmia di delezione del mtDNA in singole cellule.

Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.

Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Scopri la quantificazione dei microRNA circolanti nel plasma e nel siero mediante droplet digital PCR con chimica a colorante DNA-binding. Questo metodo altamente sensibile consente di rilevare biomarcatori diagnostici e prognostici nel cancro senza necessità di geni di riferimento.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

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