Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i microRNA circolanti nei fluidi biologici, come il plasma o il siero, utilizzando la tecnologia di PCR digitale a goccioline. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo dei biomarcatori. Identificando biomarcatori diagnostici e prognostici, è possibile ottenere informazioni utili nel contesto del cancro.

Il principale vantaggio di questa tecnica risiede nell'elevata sensibilità. Può essere utilizzata per quantificare anche i microRNA meno abbondanti senza richiedere un gene di riferimento androgino. Le implicazioni di questo metodo si estendono alla diagnostica del cancro poiché ha la potenzialità di identificare individui con tumore in stadio precoce.

È possibile applicarlo anche ad altre malattie come disturbi neurologici o cardiaci. In generale, gli individui devono prestare attenzione alla manipolazione delle goccioline prima del passaggio di ciclaggio termico per evitarne la rottura. Pertanto, una dimostrazione visiva della generazione delle goccioline è fondamentale poiché queste possono essere distrutte da una manipolazione inaccurata o da un’aspirazione troppo rapida con la pipetta.

Iniziare questa procedura isolando i microRNA dal plasma o dal siero. Successivamente, effettuare la trascrizione inversa e diluirli come descritto nel documento allegato. Rimuovere dal congelatore il master mix EvaGreen, il set di primer per microRNA e il cDNA e lasciarli scongelare a temperatura ambiente.

Dopo lo scongelamento, capovolgere il tubo del master mix più volte. Quindi centrifugare brevemente tutti i reagenti. Preparare una soluzione di lavoro per la digital droplet PCR, o ddPCR, seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato.

Preparare una quantità sufficiente per un massimo di otto campioni, con un controllo senza stampo per ogni condizione più un eccesso del 10%. Una volta assemblata, mescolare accuratamente e centrifugare brevemente la miscela di ddPCR. Si noti che non sono richieste repliche tecniche grazie all'elevata riproducibilità di questa tecnologia. Dopo la centrifugazione, distribuire 12 microlitri di miscela di ddPCR in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.

Aggiungere otto microlitri di stampo di cDNA diluito in ogni pozzetto. Inserire quindi la cartuccia del generatore di goccioline nel supporto della cartuccia. Nella fila centrale della cartuccia del generatore di goccioline, trasferire con attenzione 20 microlitri di ogni campione preparato.

Evitare di introdurre bolle d'aria nella parte inferiore della pozzetta. Riempire ciascuna delle pozzette di olio della fila inferiore con 70 microlitri di olio per il generatore di gocce. Inserire la guarnizione sull'apposito supporto per cartucce.

Inserire nel generatore di goccioline e chiudere il coperchio per avviare la generazione delle goccioline. Al termine della generazione, aprire il coperchio, rimuovere la cartuccia dal generatore di goccioline ed eliminare la guarnizione monouso. I pozzetti superiori della cartuccia contengono le goccioline.

Trasferire lentamente e delicatamente 40 microlitri da ciascuno degli otto pozzetti superiori in una singola colonna di una piastra PCR a 96 pozzetti. Sigillare immediatamente la piastra con pellicola di alluminio per evitare l'evaporazione. Entro 30 minuti dal sigillaggio della piastra, iniziare il termociclaggio utilizzando il protocollo PCR descritto nella tabella tre del documento allegato.

Accendere il lettore di goccioline. Successivamente, spostare la piastra dal termociclatore al lettore di goccioline. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti contenente le goccioline post-PCR alla base del supporto per piastre nel lettore di goccioline.

Posizionare la parte superiore del supporto sulla piastra PCR. Premere saldamente entrambe le linguette di rilascio verso il basso per fissare la piastra PCR nel supporto. Avviare il software QuantaLife dal PC di sistema. Fare clic su Setup e aprire il file di dati modello che contiene le informazioni sui campioni, sui geni bersaglio e sui saggi.

Dalla barra di navigazione a sinistra, selezionare Esegui. Verrà visualizzata una finestra Opzioni di esecuzione. Dal menu Set di colorante, selezionare EVA e fare clic su OK per avviare la lettura delle goccioline.

Al termine della corsa, utilizzare il grafico dell'ampiezza 2D nel software di analisi per selezionare le goccioline positive. Per selezionare le goccioline positive, utilizzare lo strumento lazo presente nella barra di navigazione a sinistra. Successivamente, fare clic sulla scheda Eventi per verificare il numero di goccioline positive e il numero totale di goccioline.

Un numero totale di 18.000 goccioline viene solitamente ottenuto con la ddPCR senza sonda. Quindi fare clic sulla scheda Concentrazione per visualizzare il campione finale di concentrazione. Infine, utilizzare l'Esportazione.

CSV per esportare i valori di concentrazione del microRNA. L'mRNA miR-181a-5p è stato quantificato in due campioni di plasma, S1 e S2, utilizzando concentrazioni del primer di 0,5 e un microlitro a temperature di annealing di 58 e 60 gradi Celsius. Questa figura mostra il numero di copie di microRNA per microlitro nella reazione di amplificazione per ciascuna condizione.

I droplet positivi alla PCR per ogni campione sono mostrati in blu, mentre i droplet negativi sono mostrati in nero. Come si può vedere qui, il campione di controllo non presenta droplet positivi, come previsto. L'esecuzione della PCR a 60 gradi Celsius utilizzando 0,5 o un microlitro di primer ha determinato una migliore separazione tra droplet positivi e negativi.

In questa figura, le barre di errore rappresentano l'intervallo di confidenza di Poisson al 95%. Qui, il numero di goccioline positive, mostrato in blu, viene confrontato con il numero totale di goccioline, mostrato in verde. Nel complesso, questi dati dimostrano che la PCR digitale a goccioline può essere utilizzata per determinare il numero assoluto di copie di microRNA per microlitro di un liquido biologico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una quantificazione dell'mRNA mediante PCR digitale a goccioline. Una volta padroneggiata, è possibile analizzare 96 campioni in sole poche ore, un risultato ottimale per un contesto clinico. Grazie a ogni sviluppo, questa tecnica apre la strada al campo della biopsia liquida per esplorare il microRNA e altri acidi nucleici come biomarcatori di malattia.