Name: Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri la cattura e il rilascio di cellule tumorali circolanti vitali dal sangue intero utilizzando microfiltri rivestiti con PIPAAm. Questo metodo senza marcatori facilita analisi a valle e colture cellulari per studiare la metastasi.

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Ringraziamo tutti i pazienti che hanno donato campioni di sangue per sostenere questo lavoro. Ringraziamo i dottori Giuseppe Giaconne, Ritesh Parajuli e Marc E. Lippman per la loro assistenza nell'acquisizione di campioni clinici, e i dottori Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez per le loro approfondite discussioni. Zheng Ao ringrazia il sostegno parziale e l'assistenza del programma di laurea Sheila e David Fuente in Biologia del cancro, Sylvester Comprehensive Cancer Center.

Etica Dichiarazione: Per proteggere i diritti dei soggetti umani, i campioni di sangue sono stati ottenuti a seguito di un consenso informato secondo protocolli approvati dalla University of Miami revisione istituzionale tavole sotto IRB 20.150.020. NOTA: Il sangue da filtrare per la cattura CTC deve essere raccolto in un tubo EDTA per prevenire la coagulazione. 1. Rivestimento il microfiltro con Poli (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) <ol><li> Pesare PIPAAm preparare un 10% w / v in butanolo. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è chiara. </li><li> microscopio Cut plastica scivola in circa 12 mm x 12 mm quadrati sia con un paio di forbici o lama affilata. In alternativa usare una ghigliottina. NOTA: Queste piazze serviranno come supporto per i filtri durante il processo di spin coating. </li><li> Utilizzando un paio di forbici affilate regolo, tagliare lo slot pori microfiltro wafer in 8 millimetri x 8 mm quadrati. </li><li> Utilizzando un nastro di pellicola poliimmide garantire i filtri di taglio sul squa plasticares precedentemente tagliato in fase 1.3. Applicare la pellicola solo il bordo e l&#39;angolo del filtro in modo che almeno 7 mm x 7 mm di superficie filtrante è un-coperta dal nastro. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54435/54435fig2.jpg" /> Figura 2:. Rappresentante Illustrazione del microfiltro set-up per PIPAAm Coating 8 millimetri microfiltro x 8 mm deve essere posto sul 12 millimetri taglio x 12 mm plastica quadrato da un vetrino da microscopio di plastica. Nastro poliimmide viene utilizzato per fissare il microfiltro in atto per far girare il cappotto PIPAAm.Reproduced con il permesso di riferimento 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54435/54435fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="5"><li> Posizionare il microfiltro che viene fissato sul quadrato di plastica, sul mandrino di vuoto dello spin-coater. </li><li> Programmare lo spin-verniciatore per la seguente ricetta: Start, 500 rpm per 10 secondi, 6.000 giripm per 60 sec, 500 rpm per 10 secondi, Stop. </li><li> Erogare abbastanza 10% w / v soluzione PIPAAm (preparato in 1.1) per coprire completamente la superficie microfiltro utilizzando una pipetta di trasferimento plastica standard e avviare il dispositivo a induzione di spin. </li><li> Rimuovere il microfiltro PIPAAm rivestito dallo spin-verniciatore dopo il processo di rivestimento è stato completato. Lasciare il filtro attaccato al quadrato di plastica durante la conservazione. NOTA: Il rivestito-filtro può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 3 mesi. </li></ol> 2. Montaggio di filtrazione a cassetta con Microfiltro PIPAAm Coated <ol><li> Reidratare PIPAAm microfiltro rivestito a temperatura ambiente posizionando il microfiltro ancora fissato sulla piazza di plastica in una capsula di Petri. Aggiungere 1x PBS fino a quando il microfiltro è completamente sommerso e lasciare riposare per 5 minuti. </li><li> Dopo la fase di idratazione, rilasciare il filtro dalla piazza plastica tagliando il nastro poliimmide film utilizzando un paio di forbici. NOTA: Prendere nota di quale lato del filtro presentail rivestimento PIPAAm. </li><li> Assemblare il microfiltro nella cassetta filtrazione, sovrapponendoli il microfiltro tra il pezzo acrilico superiore e inferiore insieme con i pezzi 2 polidimetilsilossano (PDMS) agisce come una guarnizione / tenuta. Bloccare la cassetta acrilico con clip per fissare il filtro e fornire una tenuta ermetica. NOTA: Il rivestimento PIPAAm deve essere rivolto verso l&#39;alto, così come il campione viene filtrato attraverso, le cellule saranno catturate PIPAAm superficie rivestita del filtro (Figura 1). </li></ol> 3. Filtrazione di campione di sangue con la cattura e rilascio del CTC dal microfiltro <ol><li> Come ogni marca pompa a siringa ha una propria interfaccia utente, fare riferimento al manuale d&#39;uso della pompa e programmare la pompa a siringa a scorrere ad una velocità di 75 ml / ora e impostare il volume a 20 ml. </li><li> Caldi 3 ml di supporto (disponibile in commercio) coltura cellulare di McCoy (preparati aggiungendo nel 10% siero fetale bovino e 1% penicillina e streptomicina) a 37 ° C. <br /&gt;. NOTA: La scelta dei media sarà basata sul tipo di cancro del paziente oppure se questo è un esperimento modello di sistema in cui le cellule in coltura devono essere a spillo in sangue donatore sano, usare i mezzi di comunicazione le cellule sono normalmente coltivate in caso di dubbio, consultare alla guida di coltura / metodo fornito dalla società le cellule sono state acquistate da. </li><li> Aggiungere 7,5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank disponibile in commercio (HBSS) a 7,5 ml di sangue campione e aspirare il sangue diluito in una siringa da 25 ml. NOTA: regolare il volume di HBSS modo che il campione di sangue viene diluito con uguale volume di 1: 1 con HBSS esempio, se viene utilizzato 10 ml di sangue, quindi mescolare con pari volume di 10 ml HBSS per raggiungere l&#39;1:. Diluizione 1. </li><li> Innestare la cassetta di filtrazione con la siringa e posizionarlo sulla pompa a siringa. Posizionare un tubo da 50 ml a fondo per raccogliere il flusso attraverso e avviare la pompa. NOTA: La filtrazione dovrebbe prendere circa il 10- 12 min. Tutte le fasi di filtrazione vanno effettuatefuori a normale temperatura ambiente (20-25 ° C) tra cui passo 3.8 </li><li> Dopo filtrazione è completa, sganciare la cassetta filtrazione prendere appunti quale lato è all&#39;inizio che ha le cellule catturati sulla superficie PIPAAm rivestita. Aspirare 1 ml di terreni di coltura caldo in una nuova siringa. </li><li> Re-impegnarsi la cassetta filtrazione con la siringa contenente il supporto, ma in questo momento impegnarsi l&#39;estremità inferiore della cassetta in modo che il PIPAAm rivestito superficie del filtro sia rivolta lontano dalla siringa. NOTA: Questo sarà per liberare tutte le cellule che possono essere incorporati nei pori di slot applicando delicato flusso inverso. </li><li> Posizionare la siringa indietro sulla pompa a siringa e tenere una piccola scatola di Petri o 6-pozzetti proprio sotto la cassetta di filtrazione. Impostare la velocità di flusso di 100 ml / h e avviare la pompa. </li><li> Far passare tutti i media attraverso il filtro e raccogliere il flusso continuo nella capsula di Petri. Attendere che tutti i mezzi di comunicazione di passare attraverso e quindi arrestare la pompa e rimuovere la siringa unnd filtrazione cassette dalla pompa. </li><li> Sganciare la cassetta filtrazione dalla siringa e aprirla per recuperare il filtro dalla cassetta. Posizionare il filtro con la superficie PIPAAm rivolto verso il basso nella stessa capsula di Petri utilizzato per raccogliere il flusso inverso quando si rilascia le cellule dai pori. Aggiungere il resto dei media caldi e la capsula di Petri in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Dopo 30 minuti tutte le cellule verranno rilasciati dal filtro. Tuttavia, lasciare filtro nella capsula di Petri fino a 24 ore per garantire tutte le cellule si staccano. NOTA: In alternativa, le cellule rilasciati possono essere raccolti in una provetta di effettuare ulteriori analisi a valle come la PCR, ELISA, Western Blot per citare alcuni esempi. </li><li> Dopo 24 ore di cultura, rimuovere con attenzione il microfiltro con pinze. NOTA: Il filtro può essere scartata in questo momento come le cellule sono stati liberati da esso. </li><li> pipettare delicatamente il terreno di coltura su e giù con un &amp; # 1000181; l pipetta, di ri-sospendere i eritrociti e periferiche cellule mononucleate del sangue (PBMC) che vengono catturati sul filtro e rilasciato nella piastra con il CTC. Eseguire accuratamente e delicatamente questa azione per evitare il distacco delle cellule tumorali liberamente iscritti. Rimuovere con attenzione l&#39;intero terreno contenente gli eritrociti ri-sospeso e PBMC, lasciando alle spalle le cellule tumorali in allegato e sostituire con terreno fresco pre-riscaldato a 37 ° C. NOTA: Questa operazione può essere ripetuta una volta, se eritrociti eccessive sono presenti dopo un lavaggio. </li></ol> 4. CTC Viabilità valutazione <ol><li> Valutare colta vitalità CTC utilizzando un Live / Assay Morto 8. NOTA: Numerosi live / saggi morti sono disponibili in commercio. Dopo il protocollo del produttore è altamente consigliato. Si prega di fare riferimento alla lista materiali / reagenti per il kit di analisi commerciale utilizzato per questo esperimento. </li></ol>

<ol><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Response+to+Chemotherapy+in+Metastatic+Breast+Cancer%3A+SWOG+S0500%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500.</a> J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).</li>
<li>Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cellular+sample+preparation+using+a+Centrifuge-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip.</a> Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).</li>
<li>Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (179), 179(2013).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Based+Isolation+of+Circulating+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Microcavity+Array+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System.</a> PLoS ONE. 8 (6), (2013).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinched+flow+coupled+shear-modulated+inertial+microfluidics+for+high-throughput+rare+blood+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation.</a> Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).</li>
<li>Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+label+free+biochip+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients.</a> Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li>
<li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li>
<li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+pathology%22%5BJournal%5D)">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li>
<li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li>
<li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture%2C+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PHT%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li>
<li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+%28CTCs%29+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li>
<li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li>
<li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).</li>
<li>Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+polymeric+surfaces%3B+control+of+attachment+and+detachment+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Makromol.+Chemie%2C+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells.</a> Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).</li>
<li>Deng, Y., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci. Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li>
<li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer%3A+a+retrospective+study+in+107+patients%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403(2015).</li>
</ol>

Parte di questo lavoro è stato protetto dalla domanda di brevetto provvisorio degli Stati Uniti n. 62/219.808. Siddarth Rawal è un azionista di Circulogix Inc. che produce commercialmente i filtri e le cassette/cartucce filtranti utilizzati in questo articolo.

Il processo di acquisizione vitali CTC dal sangue intero e rilascio dal microfiltro è relativamente semplice; tuttavia alcuni punti critici sono degni di nota. È indispensabile, come tutte coltura cellulare che una condizione sterile viene mantenuta attraverso l&#39;intero processo. La fase iniziale del rivestimento del filtro con PIPAAm è critica, come base per la tecnica di rilasciare le cellule dal filtro si basa sullo sfruttamento di temperatura reattivi proprietà interfacciali del PIPAAm. Per assicurare il filtro è...

La malattia metastatica è responsabile per la maggior parte delle morti per cancro. Lo sviluppo di biomarker diagnostici prognostica e compagno di metastasi è cruciale nella gestione e trattamento del cancro. cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo centrale nella diffusione del tumore e metastasi. Inoltre, essendo facilmente accessibile come una &#39;biopsia liquida&#39; biomarcatore, CTC nei pazienti affetti da cancro &#39;sangue periferico è in aumento come un&#39; covo &#39;per la ricerca sul cancro biomarcatore. CTC sono stati ben convalidato come un biomarcatore prognostico in varie impostazioni di cancro, compresi seno, alla prostata e il cancro colorettale 1-3. Tuttavia, i recenti progressi nel campo CTC ha indicato che la mera enumerazione di queste rare cellule ha limitato utilità clinica, come dimostrato in studi clinici interventistici 4. Pertanto, vi è una necessità emergente di tecnologie che consentono la caratterizzazione molecolare e funzionale di CTC. Attualmente, solo alcune tecnologie esistenti che consentono FOR non antigene di parte, la cattura vitale e rilascio di CTC, consentendo robusto valle molecolare e funzionale analisi 5,6. Maggior parte di questi dispositivi microfabbricati sono accoppiati alle piattaforme microfluidica ed avere quindi un fattore limitante nella quantità di sangue che possono essere trasformati, che varia da 2-4 ml 7 - 10. CTC sono eventi rari in un singolo tubo di prelievo di sangue (7,5 ml), quindi riducendo ulteriormente la quantità di sangue che può essere elaborato, ostacola notevolmente le possibilità di catturare e isolare queste cellule di interesse. Abbiamo sviluppato due tipi di dispositivi di microfiltri membrana parylene C per la cattura di CTC che sfruttano le differenze di dimensione tra cellule tumorali più grandi e più piccoli normali globuli 11,12. Abbiamo precedentemente riportato sul filtro pori enumerazione rotonda e lo ha confrontato con una piattaforma approvato dalla FDA, in cui il microfiltro ha dimostrato di essere superiore in CTC efficienza di catturaper i campioni di sangue dei pazienti di cancro 13,14. Tuttavia, una limitazione del filtro rotondo è la necessità di utilizzare un fissativo a base di formaldeide prima della filtrazione. Questo processo conserva la morfologia delle cellule, consentendo loro di resistere alla sollecitazione di taglio e pressione durante il processo di filtrazione. Mentre enumerazione e studi molecolari possono essere eseguite on-chip 13, il fissativo compromette la capacità di eseguire la caratterizzazione funzionale. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato un filtro pori slot che nega la necessità di fissare le cellule prima della filtrazione (Figura 1). La geometria dei pori di slot (6 micron di larghezza x 40 micron di slot lunghezza pori) permette alle cellule tumorali di essere catturati mentre solo parzialmente occlude un poro e quindi ancora permettere il libero passaggio per le altre cellule del sangue e alleviare l&#39;aumento della pressione che porterebbe a danni cellulari ed eventuale scoppio 15,16 La cartuccia del poro slot è composto da 2 pezzi acrilico che paninoil filtro pori fessura tra la parte superiore e inferiore con Polidimetilsilossano (PDMS) fungente da guarnizione per fornire una perdita sigillo 14,15 (figura 1). Mentre l&#39;efficienza di cattura del filtro pori slot è elevata, (Tabella 1), il catturato CTC sono legati alla membrana Parylene C da forti non specifiche interazioni elettrostatiche invece di matrice extracellulare (ECM) adesione 15 mediata. Metodi come flusso inverso o l&#39;uso di raschietti cellule non riescono a rilasciare efficacemente le cellule dal filtro, o provocare danno cellulare e morte cellulare. Abbiamo esplorato un uso non convenzionale di PIPAAm di formulare una strategia di rilascio 15. PIPAAm è un polimero che subisce una transizione di fase reversibile temperatura della soluzione critica più bassa (LCST) ad una temperatura della soluzione di 32 ° C 17. Tradizionalmente, questa proprietà di PIPAAm è stato ampiamente esplorato per applicazioni di ingegneria tissutale. Tipicamente, le cellule sonosuperfici coltivate su PIPAAm rivestito a 37 ° C quando PIPAAm è idrofoba. Le cellule possono quindi essere staccate come un foglio quando la temperatura coltura viene spostata al di sotto 32 ° C, dove la superficie rivestita PIPAAm diventa idratato 17,18. Abbiamo sfruttato questa proprietà termica eseguendo il processo di filtrazione a temperatura ambiente (inferiore a 32 ° C) e quindi consentire il rilascio delle cellule posizionando il filtro in terreni di coltura mantenuto a 37 ° C. A questa temperatura, lo strato di polimero PIPAAm diventa idrofobo, liberando così il cellule elettrostaticamente legato 15 (Figura 1). Sebbene il metodo sensibile alla temperatura, nonché altri metodi sono stati implementati con successo per raggiungere cattura CTC vitali e rilasciare 19 - 21, una chiave potenziale svantaggio condivisa da queste tecnologie riportati è che tutti impiegano un principio antigene-dipendente per la cattura CTC. cattura CTC base di Antigen, come mostrato previously, può portare a parziale CTC analisi 11,14. Ad esempio, molte tecnologie di affinità basata impiegano anticorpo che si lega EpCAM per la cattura CTC. Tuttavia, CTC ha mostrato di esprimere diversi livelli di EpCAM, portando ad omissione di EpCAM bassa e EpCAM negativo CTC da queste tecnologie. Inoltre, le limitazioni possono verificarsi quando CTC di origine non epiteliale è di interesse, come ad esempio CTC nelle impostazioni di melanoma e sarcoma. Così, una tecnologia che permette di vitale cattura e rilascio CTC senza potenziale distorsione introdotta da antigene-capture based è altamente auspicabile. È importante sottolineare che il dispositivo di cattura microfiltro è puramente dimensionato in base e la strategia di rilascio è agnostico per la presenza di alcuni marcatori di superficie. Noi crediamo che l&#39;impiego del microfiltro rivestito PIPAAm aiuterà a espandere la nostra comprensione del processo metastatico, fornendo la capacità di catturare e rilasciare CTC per le analisi a valle in modo efficace ed efficiente. Questo può potenteesporre buona resa nuove molecole per le quali nuove terapie mirate sistemiche possono essere diretti, oltre a fornire un biomarker che può essere monitorato in modo semplice e aiuto nel cancro gestione del paziente.

<table><tbody><tr><td>Filtro a fessura</td><td>Circulogix Inc.</td><td>MSF-01</td><td>Filtri di diverse dimensioni disponibili per la filtrazione di CTC da sangue o urina (www.circulogixinc.com)</td></tr><tr><td>poli(N-iso-propilacrilammide) (PIPAAm)&nbsp;</td><td>Ploysciences Inc.</td><td>21458</td><td>Non pericoloso. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>1-butanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7906</td><td>Utilizzare in un'area ben ventilata</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in plastica</td><td>Cole-Parmer</td><td>48510-30</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi vetrino di plastica o in alternativa qualsiasi tipo di quadrato (metallo, acrilico, ecc.) se sarà una balla per contenere il quadrato del filtro da 8mmx8mm</td></tr><tr><td>Spin Coater</td> Sistemi di <td>rivestimento speciali</td><td>SCS G3 Spin Coater</td><td></td></tr><tr><td>Strumento Nastro in poliimmide</td><td>Uline</td><td>S-7595</td><td>Polyimide è il nome generico del nastro Kapton che può essere acquistato da più fornitori (Amazon, Kaptontape.com)</td></tr><tr><td>HBSS- Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri plates 35 x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Microfilter Cassette</td><td>Circulogix Inc.</td><td>FC-01</td><td>Custom catridges sono disponibili in base alla filtrazione per CTC da sangue o urina.</td></tr><tr><td>Siringa 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>KD scientific&nbsp;</td><td>78-0100V</td><td>Può essere utilizzata qualsiasi pompa a siringa in grado di contenere una siringa da 25 ml</td></tr><tr><td>Cellstar Provetta da centrifuga da 50 ml</td><td>VWR</td><td>82050-322</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio One Piastra a 6 pozzetti</td><td>VWR</td><td>89131-688</td> È <td>possibile utilizzare qualsiasi marca, purché la superficie sia compatibile per l'adesion cellulare e non repellente</td></tr><tr><td>SKBR3 Cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>Live Dead Assay</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>Qualsiasi test in grado di fornire un'analisi ragionevole per valutare le cellule vive funzionerà</td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>VWR</td><td>98000-368</td><td>Qualsiasi incubatore che possa essere utilizzato per la coltura cellulare sarà sufficiente</td></tr></tbody></table>

cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Abbiamo dimostrato un metodo per la cattura dimensioni base di vitale cellule tumorali circolanti (CTC) da sangue intero, insieme con il rilascio di queste cellule dal circuito integrato di analisi e / o di cultura downstream. La strategia impiega l&#39;uso di un romanzo Parylene C poro fessura membrana microfiltro per catturare CTC ed un rivestimento di poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) per thermoresponsive rilascio praticabile della CTC catturato. La cattura di cellule vive è abilitata sfruttando la progettazione di una geometria dei pori dello slot con dimensioni specifiche per ridurre la sollecitazione di taglio tipicamente associati con il processo di filtrazione. Mentre il microfiltro presenta una elevata efficienza di cattura, il rilascio di queste cellule non è banale. Tipicamente, solo una piccola percentuale di cellule vengono rilasciati quando si utilizzano tecniche come flusso inverso o raschiatura cellulare. L&#39;adesione di queste cellule tumorali epiteliali alla membrana parylene C è attribuibile alla interazione elettrostatica non specifico. Per contrastare °è effetto, abbiamo impiegato l&#39;uso di rivestimento PIPAAm e sfruttato le sue proprietà interfacciali reattivi termiche per rilasciare le cellule dal filtro. Sangue viene prima filtrato a temperatura ambiente. Sotto 32 ° C, PIPAAm è idrofila. Successivamente, il filtro è posizionato o nel mezzo di coltura o un buffer mantenuta a 37 ° C, che determina la rotazione PIPAAm idrofobica, e successivamente rilasciare le cellule elettrostaticamente rilegati.

Utilizzando il sangue donatori sani &#39;(ottenuto con un protocollo approvato dalla University of Miami IRB 20.150.020 a seguito di un consenso informato) a spillo con le cellule tumorali in coltura, la tecnica thermoresponsive per il rilascio di cellule vitali circolanti tumorali (CTC), la cattura raggiunto, il rilascio e l&#39;efficienza di recupero del 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5% rispettivamente (Tabella 1) 15. In confronto, l&#39;efficienza rilascio e i...

Un protocollo di utilizzare un poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è catturare in modo efficace cellule tumorali circolanti vitali, o CTC, dal sangue intero. Queste CTC possono essere coltivate in coltura oppure utilizzate per analisi successive che richiedono campioni non fissati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della metastasi.È inoltre possibile utilizzarlo per monitorare la progressione della malattia, la risposta alla terapia e la valutazione del rischio di recidiva. Il vantaggio di questa tecnica è la capacità di catturare CTC vitali in modo indipendente dall'espressione di biomarcatori e senza l'uso di marcatori, a partire da qualsiasi tumore solido. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di rilasciare le CTC dal filtro perché desideravamo effettuare analisi dell'RNA a valle e coltivare le CTC, invece di coltivarle in situ sul filtro.Per iniziare l'esperimento, pesare una quantità sufficiente di PIPAAm per preparare una soluzione al 10% peso/volume in un tubo da 15 millilitri contenente butanolo. Vortexare il tubo fino a quando la soluzione diventa limpida. Successivamente, tagliare le vetrini di plastica in quadrati di circa 12 millimetri per 12 millimetri con un paio di forbici.Quindi, utilizzando un paio di forbici affilate con lama dritta, tagliare una wafer di microfiltro a fori in quadrati di otto millimetri per otto millimetri e posizionare questi pezzi direttamente sui quadrati di plastica. Utilizzando un nastro in film di poliimide, fissare i filtri tagliati sui quadrati di plastica, applicando il nastro soltanto sui bordi e agli angoli del filtro in modo che un'area del filtro di almeno sette millimetri per sette millimetri non risulti coperta dal nastro. Posizionare il microfiltro fissato sul quadrato di plastica sul mandrino a vuoto del rivestitore centrifugo.Programmare il rivestitore a centrifuga secondo la seguente procedura. Quindi, utilizzando una pipetta trasferibile in plastica standard, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di PIPAAm al 10% peso/volume da coprire completamente la superficie del microfiltro e avviare il rivestitore a centrifuga. Al termine del rivestimento, rimuovere il microfiltro rivestito con PIPAAm dal rivestitore a centrifuga e lasciare il filtro attaccato al quadrato di plastica durante la conservazione.Passare all'assemblaggio della cassetta di filtrazione e reidratare il microfiltro rivestito con PIPAAm a temperatura ambiente posizionando il microfiltro in una piastra di Petri. Aggiungere PBS 1X fino a quando il microfiltro è completamente immerso. Al termine della fase di idratazione, rilasciare il filtro dal quadrato di plastica staccando o tagliando il nastro in film di poliimide dal filtro.Successivamente, assemblare il microfiltro nella cassetta di filtrazione posizionando il microfiltro tra il pezzo superiore e inferiore in acrilico lungo i pezzi in PDMS che fungono da guarnizione. Quindi, fissare la cassetta in acrilico con clip per bloccare il filtro e garantire una chiusura ermetica. Riscaldare tre millilitri di mezzo di coltura cellulare McCoy a 37 gradi Celsius.Aggiungere 7,5 millilitri di soluzione salina equilibrata di Hank o HBSS ai 7,5 millilitri di campione di sangue e aspirare questo sangue diluito in una siringa da 25 millilitri. Dopo aver identificato la parte superiore della cassetta, inserire la cassetta di filtrazione nella siringa e posizionarla sulla pompa per siringa. Impostare la pompa per siringa su una portata di 75 millilitri all'ora.Posizionare un tubo da 50 millilitri in fondo per raccogliere il flusso in uscita e avviare la pompa. Al termine della filtrazione, rimuovere la cassetta di filtrazione, prendendo nota di quale lato è quello superiore in cui le cellule sono state trattenute sulla superficie rivestita con PIPAAm. Aspirare un millilitro di mezzo di coltura tiepido in una nuova siringa.Di nuovo, determinare la parte superiore della cartuccia, quindi reinserire la cartuccia di filtrazione nella siringa contenente il mezzo, agganciando l'estremit&agrave; inferiore della cartuccia in modo che la superficie del filtro rivestita con PIPAAm sia rivolta lontano dalla siringa. Successivamente, riposizionare la siringa sulla pompa per siringhe e tenere la piastra a sei pozzetti esattamente al di sotto della cartuccia di filtrazione. Impostare la portata e avviare la pompa.Fare passare tutto il mezzo attraverso il filtro e raccogliere il flusso in uscita nella piastra di Petri. Attendere che tutto il mezzo sia passato, quindi arrestare la pompa e rimuovere la siringa e la cassetta di filtrazione dalla pompa. Successivamente, staccare la cassetta di filtrazione dalla siringa, aprirla ed estrarre il filtro dalla cassetta.Posizionare il filtro con la superficie in PIPAAm rivolta verso il basso nella stessa piastra di Petri utilizzata per raccogliere il flusso inverso durante il rilascio delle cellule dai pori. Aggiungere il resto del mezzo caldo e inserire la piastra nell'incubatore, impostato a 37 gradi celsius. Una volta recuperato il filtro dalla cassetta, è fondamentale posizionarlo nella piastra con le cellule rivolte verso il basso e, se necessario, agitarlo delicatamente nel mezzo per assicurarsi che le cellule si siano staccate dal filtro.Dopo 24 ore di coltura, rimuovere con cura il microfiltro utilizzando pinzette e scartare il filtro. Risospendere delicatamente gli eritrociti e le cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC con una pipetta da 1000 micro liter. È fondamentale essere estremamente delicati durante la risospensione degli eritrociti e delle PBMC per evitare di aspirare le CTC.Rimuovere con attenzione tutto il mezzo contenente gli eritrociti e i PBMC risospesi, lasciando indietro le cellule tumorali aderenti, e sostituire il mezzo con del mezzo fresco, preriscaldato a 37 gradi Celsius. Procedere con la valutazione della vitalità delle CTC. Utilizzando sangue di donatori sani arricchito con cellule tumorali coltivate, la tecnica termo-responsiva per il rilascio di cellule tumorali circolanti vitali, o CTC, ha raggiunto un'efficienza di cattura, rilascio e recupero rispettivamente del 94%, 82% e 77%.L'efficienza di rilascio e recupero dei filtri non rivestiti era significativamente inferiore. È stato eseguito un saggio live/dead per valutare la vitalità cellulare prima dell'aggiunta in sangue e dopo il rilascio. Le cellule sono rimaste vitali dopo il rilascio ed si sono espanse rapidamente in coltura.Le cellule SKBr-3 sono state recuperate dal sangue mediante il filtro a fessura rivestito con PIPAAm e seminate in una piastra a 48 pozzetti. Dopo 16 ore di coltura, le cellule tumorali aderiscono alla piastra insieme a eritrociti e leucociti ipotonici, che si depositano sul fondo della piastra. Dopo il lavaggio, le cellule non aderenti sono state rimosse, lasciando solo le cellule tumorali aderenti sulla piastra.Gli stessi filtri possono essere utilizzati per l'isolamento di cellule fissate, sia per l'enumerazione che per le caratterizzazioni molecolari delle CTC, al fine di monitorare la progressione del cancro e migliorare la gestione del tumore. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle CTC, consentendo la caratterizzazione funzionale di queste cellule per esplorare futuri bersagli farmacologici e compiere un passo verso la medicina personalizzata.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.

Isolamento rapido di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue del paziente

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l'utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo importante nelle metastasi tumorali. Qui, viene descritto un metodo per l'isolamento e la propagazione di CTC dal sangue intero di un modello di tumore murino singenico di metastasi da carcinoma epatocellulare (HCC).

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Vi presentiamo un nuovo approccio per caratterizzare le cellule del tumore. Abbiamo combinato l'immunofluorescenza con DNA fluorescentein situ-ibridazione per valutare cellule catturate da un filo medico funzionalizzato capace di in vivo arricchimento CTCs direttamente dal sangue del paziente.

Caratterizzazione delle cellule del tumore usando un filo medico per l'acquisizione di cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sul DNA pesce e immunofluorescenza

Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.

Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale

Questo documento descrive l'applicazione di apparecchiature automatizzate per separare e raccogliere in modo semplice ed efficiente sostanze, come il DNA privo di cellule e le cellule tumorali circolanti, dal sangue intero.

Separazione automatica e raccolta di sostanze correlate al cancro da campioni clinici

Il chip microfluidico clinico è un'importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.

Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per lo studio della progressione e delle metastasi del cancro. Questo articolo presenta un protocollo integrato ad alta produttività per l'arricchimento di CTC e il sequenziamento di CTC singolo, migliorando l'efficienza di cattura e la purezza delle CTC riducendo al contempo i costi di contaminazione e sequenziamento, facendo progredire la ricerca oncologica di precisione e le applicazioni cliniche.

Tecnologia di selezione delle cellule tumorali circolanti ad alto rendimento e sequenziamento di singole cellule basata sulla microfluidica

Scopri la cattura e il rilascio di cellule tumorali circolanti vitali dal sangue intero utilizzando microfiltri rivestiti con PIPAAm. Questo metodo senza marcatori facilita analisi a valle e colture cellulari per studiare la metastasi.

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

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