Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

Un protocollo di utilizzare un poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di catturare efficacemente le cellule tumorali circolanti vitali o CTC dal sangue intero. Questi CTC possono essere messi in coltura o essere utilizzati per analisi a valle che richiedono campioni non fissati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi.

Può anche essere utilizzato per seguire la progressione della malattia, la risposta alla terapia e valutare il rischio di recidiva. Il vantaggio di questa tecnica è la capacità di eseguire la cattura senza marcatura di CTC vitali da qualsiasi tumore solido, pur rimanendo indipendenti dall'espressione del biomarcatore. All'inizio abbiamo avuto l'idea di rilasciare le CTC dal filtro perché volevamo fare l'analisi dell'RNA a valle e la coltura delle CTC, invece di coltivarle in situ sul filtro.

Per iniziare l'esperimento, pesare una quantità sufficiente di PIPAAm per preparare una soluzione al 10% in peso per volume in una provetta da 15 millilitri, contenente butanolo. Agitare il tubo fino a quando la soluzione non è limpida. Quindi, taglia i vetrini del microscopio di plastica in quadrati di circa 12 millimetri per 12 millimetri con un paio di forbici.

Quindi, usando un paio di forbici affilate a lama dritta, taglia un wafer con microfiltro a poro fessurato in quadrati di otto millimetri per otto millimetri e posiziona questi pezzi direttamente sui quadrati di plastica. Utilizzando un nastro di pellicola di poliimmide, fissare i filtri tagliati sui quadrati di plastica, solo sul bordo e sull'angolo del filtro in modo che almeno sette millimetri per sette millimetri di area del filtro non siano coperti dal nastro. Posizionare il microfiltro fissato sulla squadra di plastica sul mandrino a vuoto della centrifuga.

Programmare la centrifuga sulla seguente ricetta. Quindi, con una pipetta di trasferimento in plastica standard, erogare una soluzione PIPAAm del 10% in peso per volume sufficiente a coprire completamente la superficie del microfiltro e avviare lo spin coater. Al termine del rivestimento, rimuovere il microfiltro rivestito PIPAAm dalla centrifuga e lasciare il filtro attaccato al quadrato di plastica durante lo stoccaggio.

Passare all'assemblaggio della cassetta di filtrazione e reidratare il microfiltro rivestito PIPAAm a temperatura ambiente posizionando il microfiltro in una capsula di Petri. Aggiungere 1X PBS fino a quando il microfiltro non è completamente sommerso. Dopo la fase di idratazione, rilasciare il filtro dal quadrato di plastica staccando o tagliando il nastro di pellicola di poliimmide dal filtro.

Quindi, assemblare il microfiltro nella cassetta di filtrazione inserendo il microfiltro tra il pezzo acrilico superiore e inferiore lungo i pezzi PDMS che fungono da guarnizione. Quindi, clamp la cassetta in acrilico con clip per fissare il filtro, per fornire una tenuta ermetica. Scaldare tre millilitri di terreno di coltura cellulare McCoy's a 37 gradi Celsius.

Aggiungere 7,5 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS ai 7,5 millilitri di campione di sangue e aspirare questo sangue diluito in una siringa da 25 millilitri. Dopo aver identificato la parte superiore della cassetta, innestare la cassetta di filtrazione con la siringa e posizionarla sulla pompa a siringa. Impostare la pompa a siringa su una portata di 75 millilitri all'ora.

Posizionare un tubo da 50 millilitri sul fondo per raccogliere il flusso e avviare la pompa. Al termine della filtrazione, sganciare la cassetta di filtrazione, prendendo nota di quale lato è la parte superiore che ha le celle intrappolate nella superficie rivestita PIPAAm. Aspirare un millilitro di terreno di coltura caldo in una nuova siringa.

Ancora una volta, determinare la parte superiore della cassetta, quindi riagganciare la cassetta di filtrazione con la siringa contenente il mezzo e innestare l'estremità inferiore della cassetta in modo che la superficie rivestita di PIPAAm del filtro sia rivolta lontano dalla siringa. Quindi riposizionare la siringa sulla pompa a siringa e tenere la piastra a sei pozzetti proprio sotto la cassetta di filtrazione. Impostare la portata e avviare la pompa.

Passare tutto il mezzo attraverso il filtro e raccogliere il flusso nella capsula di Petri. Attendere il passaggio di tutto il fluido, quindi arrestare la pompa e rimuovere la siringa e la cassetta di filtrazione dalla pompa. Quindi, sganciare la cassetta di filtrazione dalla siringa e aprirla per recuperare il filtro dalla cassetta.

Posizionare il filtro con la superficie PIPAAm rivolta verso il basso nella stessa capsula di Petri utilizzata per raccogliere il flusso inverso quando si rilasciano le cellule dai pori. Aggiungere il resto del terreno caldo e mettere la capsula di Petri in un'incubatrice di coltura, impostata a 37 gradi Celsius. Una volta che il filtro è stato recuperato dalla cassetta, è fondamentale posizionarlo nella piastra con le celle rivolte verso il basso e, se necessario, agitarlo delicatamente nel mezzo per assicurarsi che le celle siano staccate dal filtro.

Dopo 24 ore di coltura, rimuovere con cautela il microfiltro utilizzando una pinza ed eliminare il filtro. Risospendere delicatamente gli eritrociti e le cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC con una pipetta da 1000 microlitri. È fondamentale essere estremamente delicati quando si riprospendono gli eritrociti e le PBMC per evitare di pipettare le CTC.

Rimuovere con cura l'intero terreno contenente gli eritrociti risospesi e le PBMC lasciando dietro di sé le cellule tumorali attaccate e sostituire le cellule con terreno fresco, preriscaldato a 37 gradi Celsius. Procedere con la valutazione della vitalità CTC. Utilizzando sangue di donatori sani addizionato con cellule tumorali in coltura, la tecnica di risposta termica per il rilascio di cellule tumorali circolanti vitali o CTC, ha raggiunto un'efficienza di cattura, rilascio e recupero rispettivamente del 94%82% e del 77%.

L'efficienza di rilascio e recupero dei filtri non rivestiti era significativamente inferiore. È stato eseguito un test di morte viva per valutare la vitalità cellulare prima della spike nel sangue e dopo il rilascio. Le cellule sono rimaste vitali dopo il rilascio e si sono espanse rapidamente in coltura.

Le cellule SKBr-3 sono state recuperate dal sangue mediante il filtro a fessura rivestito PIPAAm e piastrate su una piastra a 48 pozzetti. A 16 ore in una coltura, le cellule tumorali aderiscono alla piastra di coltura insieme a eritrociti e leucociti ipotonici che si sono depositati sul fondo della piastra. Le cellule non aderenti dopo il lavaggio sono state rimosse lasciando solo le cellule tumorali aderenti sulla piastra.

Gli stessi filtri possono essere utilizzati per la cattura cellulare fissa, sia per l'enumerazione che per la caratterizzazione molecolare delle CTC per monitorare la progressione del cancro e una migliore gestione del cancro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle CTC che consentono la caratterizzazione funzionale di queste cellule per esplorare futuri bersagli farmacologici, facendo un passo avanti verso la medicina personalizzata.