Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'ultra struttura dei megacariociti situati all'interno del midollo osseo del topo e quantificare le diverse fasi di maturazione utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione. Il vantaggio principale è l'esame diretto dei megacariociti nell'ambiente nativo, che si differenzia dai megacariociti coltivati in vitro che come sappiamo non raggiungono il livello completo di maturazione. Dopo aver raccolto la tibia e i femori da topi C57BL/6 di 12-18 settimane secondo i protocolli standard, utilizzare una lama di rasoio affilata per rimuovere le epifisi da ciascun osso.

Tenendo ogni osso con una pinzetta, inserire un ago calibro 21 attaccato a una siringa da cinque millilitri riempita con tampone di cacodilato in un'estremità dell'osso e lavare il midollo osseo in un tubo di raccolta da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone di cacodilato fresco. Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire i cilindri del midollo osseo in un millilitro di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca per un'incubazione di 60 minuti a temperatura ambiente. Per incorporare il midollo osseo nell'agarose, lavare i campioni fissi in un tampone di cacodilato fresco e utilizzare una pipetta di plastica per trasferire con cura il midollo osseo in un vetrino.

Usando una pipetta calda, applicare rapidamente una goccia di agar liquido al 2% sui cilindri del midollo osseo e posizionare immediatamente il vetrino sul ghiaccio per uno o due minuti. Quando l'agar si è solidificato, utilizzare uno stereomicroscopio e una lama di rasoio affilata per scartare le estremità di ciascun cilindro del midollo osseo e trasferire i blocchi di midollo tagliati in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro contenente un millilitro di tampone cacodilato. Per l'incorporamento della resina, fissare i blocchi con tetroxide di osmio all'1% in tampone di cacodilato in una cappa chimica per un'ora a quattro gradi Celsius prima di lavare i blocchi una volta con tampone di cacodilato e una volta con acqua distillata.

Dopo il lavaggio con acqua, colorare i blocchi con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per un'ora seguita da due lavaggi in acqua distillata come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare i blocchi attraverso una serie ascendente di immersioni di etanolo e acqua distillata come indicato. Per ottenere un'infiltrazione e polimerizzazione uniforme della resina epossidica all'interno del midollo, incubare i blocchi in due bagni successivi di ossido di propilene per 15 minuti prima di incubare i campioni in una miscela one-to-one di ossido di propilene al 100% e resina epossidica per un'ora su uno shaker rotativo lento a temperatura ambiente.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere resina epossidica al 100% ai blocchi di midollo per un'incubazione notturna nelle stesse condizioni, quindi aggiungere resina epossidica al 100% per un'altra incubazione di due ore. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un microscopio per orientare i blocchi di midollo in stampi in silicone piatti per consentire il loro successivo sezionamento trasversale e riempire gli stampi con resina epossidica prima di posizionarli a 60 gradi Celsius per 48 ore. Per il sezionamento ultra sottile, montare il blocco del campione su un supporto ultra microtome e montare il supporto sul supporto del campione.

Utilizzare una fresa diamantata per tagliare i campioni con un angolo di 45 gradi per rimuovere la resina in eccesso attorno al tessuto prima di utilizzare una lama diamantato dotata di un serbatoio dell'acqua per tagliare sezioni trasversali di 500 e 100 nanometri di spessore rispettivamente per l'analisi istologica e TEM, quindi utilizzare un anello per trasferire le sezioni spesse 500 nanometri che galleggiano sulla superficie dell'acqua su un vetrino e per depositare lo spessore di 100 nanometri sezioni su 200 griglie di rame a barra sottile a rete con un filtro di carta sotto. Per la colorazione blu toluidina, dopo aver disegnato le sezioni spesse 500 nanometri su una piastra calda a 60 gradi, aggiungere l'1% di toluidina blu filtrato in acqua distillata alle sezioni per un'incubazione da uno a due minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni con acqua distillata.

Quando i vetrini si sono asciugati, utilizzare il mezzo di montaggio per montare i campioni con un coperchio e visualizzare i campioni al microscopio ottico. Per la colorazione a contrasto, etichettare le sezioni da 100 nanometri con acetato di uranile al 4% per cinque minuti, seguito da tre lavaggi di cinque minuti con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, colorare le sezioni con citrato di piombo per tre minuti, seguiti da tre lavaggi di cinque minuti in acqua distillata come dimostrato.

Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare prima il lato inferiore di ogni griglia a contatto con un pezzo di carta da filtro per consentire alle griglie di essere posizionate sulla carta da filtro per asciugare. Per esaminare le sezioni di TEM, quando le griglie si sono asciugate, selezionare un basso ingrandimento per valutare la qualità generale dei preparati. Per determinare il numero di megacariociti da ogni stadio di maturazione in ogni sezione trasversale, selezionare un ingrandimento più elevato e quantificare il numero di megacariociti di stadio I, II o III solo in quadrati completamente coperti da tessuto.

In questa analisi istologica rappresentativa, la compattezza della continuità dei micro-vasi e le dimensioni e la forma dei megacariociti possono essere chiaramente osservate. I megacariociti murini sono divisi in quattro fasi di maturazione. I megacariociti di stadio I hanno un grande nucleo.

Anche la presenza del primo stadio rilevabile del sistema a membrana di demarcazione è un criterio chiave di questa fase. Nella fase II, inizia la formazione di granuli e viene avviato lo sviluppo del sistema di membrana di demarcazione. I megacariociti allo stadio III sono cellule giganti con sistemi di membrana di demarcazione ben sviluppati, territori citoplasmatici chiaramente definiti e zone periferiche prive di organelli e nuclei eccentricamente posizionati.

Lo stadio dei pirenociti della maturazione dei megacariociti è caratterizzato da un nucleo nudo. Come illustrato, i megacariociti sono frequentemente osservati a contatto con le cellule endoteliali. A volte, i megacariociti formano brevi sporgenze invasive che penetrano nell'endotelio o estendono i proplati nel lume sinusoidale.

TEM permette anche la visualizzazione di dettagli ultra strutturali, così come la presenza di cellule ematopoietiche che sono state inghiottite dai megacariociti. Il rossore del midollo osseo deve essere eseguito con attenzione e immediatamente dopo la dissezione ossea. Per massimizzare l'integrità dei tessuti, il midollo è circondato da un gel di agar prima della disidratazione.

Seguendo questa procedura, i blocchi di midollo osseo possono essere ripresi a diversi ingrandimenti o possono essere utilizzati per altre analisi di microscopia elettronica 3D, come la microscopia elettronica a scansione a fascio ionica focalizzato.