Name: Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri l'analisi ultrastrutturale dei megacariociti nel midollo osseo murino usando la microscopia elettronica a trasmissione. Questo metodo permette di quantificare gli stadi di maturazione in situ con alta risoluzione.

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Gli autori desiderano ringraziare Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FESR) e dalla Sovvenzione ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Il protocollo è schematicamente mostrato nella Figura 1.
1. Raccolta e fissazione del midollo osseo ( Figura 1A)
ATTENZIONE: Questa procedura include sostanze cancerogene, mutagene e/o tossiche e viene eseguita sotto un cappuccio di estrazione chimica. Indossare adeguati dispositivi di protezione come guanti e occhiali di protezione.
<ol><li>Preparare la soluzione fissativa costituita da glutaraldeide al 2,5% in tampone di cacodilato (vedere File supplementare).</li>
	<li>Raccolta del midollo osseo<ol>
<li>Utilizzare topi adulti C57BL/6 di entrambi i sessi 12-18 settimane di età. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO2 e lussazione cervicale.</li>
		<li>Con un paio di forbici sottili, tagliare la pelle intorno alla coscia e usare una pinzetta per staccare la pelle. Rimuovere l'estremità della zampa e quindi tagliare tra l'anca e la coscia. Staccare la tibia dal femore tagliando l'articolazione del ginocchio e rimuovere il tessuto aderente su tibie e femori usando un bisturi.</li>
		<li>Rimuovere le epifisi con una lama di rasoio affilata. Mentre si tiene il femore con una pinzetta, utilizzare una siringa da 5 mL riempita con tampone cacodilato con un ago da 21 G per lavare il midollo osseo in un tubo da 15 ml riempito con tampone cacodilato da 2 ml. Per fare ciò, inserire la smussatura dell'ago nell'apertura del midollo osseo e premere lentamente lo stantuffo fino a quando il midollo non viene espulso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissazione del midollo osseo mediante rapida immersione nel fissativo.<ol>
<li>Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire il cilindro del midollo osseo in 1 mL di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca (precedentemente preparata in 1.1) per 60 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per preservare il tessuto, assicurarsi che l'intero processo, dalla dissezione ossea alla fase di fissazione, sia completato in meno di 10 minuti. Per la fissazione, assicurarsi che la soluzione fissativa sia a temperatura ambiente per evitare shock termici.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Incorporare il midollo osseo nell'agarose
NOTA: il tessuto midollare non è sufficientemente coeso per mantenere la sua integrità durante le diverse fasi di lavaggio e il materiale può essere facilmente perso. Per superare questo problema, il midollo è coperto da un gel di agar prima della disidratazione.
<ol><li>Preparare la soluzione di agarose come descritto nel file supplementare.</li>
	<li>Lavare il midollo fisso dal punto 1.3 in tampone cacodilato e trasferirlo accuratamente su un vetrino usando una pipetta di plastica. Utilizzando una pipetta calda, applicare rapidamente una goccia di agar liquido al 2% sul cilindro del midollo osseo. NOTA: L'agar si solidifica rapidamente durante il raffreddamento. Per garantire una copertura omogenea del midollo osseo, la soluzione di agar deve essere mantenuta calda fino a quando non si deposita sul vetrino.</li>
	<li>Posizionare rapidamente lo scivolo sul ghiaccio fino a quando l'agar si solidifica (1-2 min).</li>
	<li>Al microscopio, utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare e scartare le estremità del cilindro del midollo osseo a causa della possibile compressione del tessuto in queste aree. Trasferire i blocchi di midollo in tubi microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 1 mL di tampone di cacodilato.</li>
</ol>3. Incorporare il midollo osseo nella resina
ATTENZIONE: i componenti in resina sono tossici; alcuni sono cancerogeni e devono essere maneggiati con cura sotto una cappa di estrazione chimica. Utilizzare dispositivi di protezione appropriati come guanti e occhiali di protezione. Il tetrexide di osmio è altamente volatile a temperatura ambiente e i suoi vapori sono molto dannosi per gli occhi, il naso e la gola. Prima di essere scartato, il tetrexuro di osmio al 2% deve essere neutralizzato aggiungendo il doppio del suo volume di olio vegetale.
<ol><li>Preparare la resina epossidica come descritto nel file supplementare.</li>
	<li>Incorporamento in resina NOTA: Conservare i campioni nelle stesse provette di microcentrifuga durante le incubazioni in bagni successivi di osmio, acetato di uranile ed etanolo. Aspirare i supernatanti con una pipetta Pasteur. Il volume di soluzione utilizzato per ciascun bagno deve essere pari ad almeno 10 volte il volume del campione.<ol>
<li>Post-fissare i blocchi con osmio all'1% in tampone cacodilato per 1 ora a 4 °C, lavare una volta in tampone cacodilato e poi una volta in acqua distillata.</li>
		<li>Macchiare con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per 1 ora, lavare due volte in acqua distillata.</li>
		<li>Disidratare attraverso una serie graduata di etanolo in acqua distillata: 4 volte in etanolo al 75% per 5 minuti, seguito da 3 volte in etanolo al 95% per 20 minuti e poi 3 volte in etanolo al 100% per 20 minuti. A questo punto, togliere una siringa di resina epossidica dal congelatore. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa in etanolo al 100% per 1 ora.</li>
		<li>Per ottenere un'infiltrazione e polimerizzazione uniforme della resina epossidica all'interno del midollo, incubare prima i blocchi in 2 bagni successivi di ossido di propilene per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere una miscela 1:1 di ossido di propilene al 100% e resina epossidica e incubare per 1 ora. Posizionare i campioni su uno shaker rotativo lento a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 100% resina epossidica lasciare il campione per l'incubazione notturna sotto agitazione.</li>
		<li>Aggiungere resina epossidica al 100% per 2 ore di incubazione, ancora in agitazione.</li>
		<li>Al microscopio, posizionare i blocchi di midollo in stampi in silicone piatti. Orientare i campioni per consentire il successivo sezionamento trasversale dell'intero midollo osseo. Riempire gli stampi con resina epossidica e posizionarli a 60 °C per 48 ore. NOTA: Tutte le soluzioni (ad eccezione dell'etanolo e dell'ossido di propilene) vengono filtrate attraverso un filtro da 0,22 μm per evitare la contaminazione dei campioni. Per garantire un'adeguata polimerizzazione della resina, evitare bolle durante il riempimento degli stampi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Sezionamento ultrasebrisante (Figura 1B)
NOTA: La trasmissione EM richiede sezioni di tessuto sottili attraverso le quali gli elettroni possono passare generando un'immagine di proiezione dell'interno delle cellule, della struttura e dell'organizzazione degli organelli interni (granuli, reticolo endoplasmatico, Golgi) e la disposizione delle membrane cellulari intracellulari.
<ol><li>Montare il blocco campione in un supporto ultra-microtome. Mettilo sul portase campioni. Tagliare i campioni a 45° per rimuovere l'eccesso di resina intorno al tessuto con una fresa rotante a diamante o tungsteno.</li>
	<li>Montare i campioni sull'ultramicrotomo con una lama diamanta dotata di un serbatoio d'acqua. Taglio di sezioni trasversali di spessore 500 nm e 100 nm per analisi istologiche e TEM, rispettivamente. Raccogli sezioni galleggianti sulla superficie dell'acqua con un anello.</li>
	<li>Depositare la sezione spessa 500 nm su una diapositiva di vetro e le sezioni spesse 100 nm su griglie di rame a barra sottile a 200 maglie con un filtro di carta sottostante. Preparare cinque griglie per una condizione: macchiare prima due griglie e mantenere le tre griglie rimanenti come backup, se necessario.</li>
</ol>5. Colorazione blu toluidina per istologia
NOTA: La colorazione delle sezioni per l'istologia è importante per tre motivi: 1) per assicurarsi che il tessuto sia effettivamente tagliato e non la resina, 2) per verificare la qualità dell'inclusione e 3) per valutare rapidamente il campione di midollo. Se questo non è corretto, taglia più in profondità nel blocco.
<ol><li>Asciugare le sezioni semisottili scorrere su una piastra termica (60 °C).</li>
	<li>Aggiungere l'1% di toluidina blu filtrato/l'1% di borato di sodio in acqua distillata sui vetrini e riscaldare su una piastra calda (60 °C) per 1-2 min. Lavare i vetrini con acqua distillata e lasciarli asciugare sulla piastra termica.</li>
	<li>Montare sezioni su coverslips con una goccia di mezzo di montaggio Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) ed esaminare al microscopio ottico.</li>
</ol>6. Colorazione di metalli pesanti per l'osservazione TEM (Figura 1C)
NOTA: Per il contrasto, il lato superiore delle griglie viene invertito su gocce da 100 μL di ogni bagno successivo con un anello. Prima dell'uso, ogni soluzione viene filtrata con 0,22 μm. Rimuovere l'eccesso di liquido tra ogni bagno contattando delicatamente il lato griglia su una carta da filtro.
<ol><li>Macchiare con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per 5 min.</li>
	<li>Lavare 3 volte in acqua distillata per 5 min.</li>
	<li>Macchiare con citrato di piombo per 3 min.</li>
	<li>Lavare 3 volte in acqua distillata per 5 min.</li>
	<li>Depositare le griglie sul lato inferiore a contatto con la carta da filtro per lasciarle asciugare. NOTA: I metalli pesanti reagiscono in presenza di anidride carbonica. Per ridurre al minimo i precipitati, evitare lo spostamento d'aria durante il contrasto, non parlare, mantenere l'ambiente calmo e spegnere l'aria condizionata.</li>
</ol>7. TEM (Figura 1E)
NOTA: Le sezioni vengono introdotte in un microscopio TEM ed esaminate a 120 kV.
<ol><li>Esaminare innanzitutto le sezioni a basso ingrandimento (< 500x) per apprezzare l'aspetto generale della preparazione (assenza di foro nella resina, pieghe/compressione nelle sezioni, precipitati dovuti alla colorazione).</li>
	<li>Quindi esaminare le sezioni a ingrandimento più elevato (~ 2000x che consente di distinguere lo stadio di maturazione). Contare manualmente i megacariociti di ogni fase di maturazione su intere sezioni trasversali (vedere Risultati rappresentativi su come identificare visivamente ogni fase). NOTA: Ogni quadrato delle griglie è definito come un'area per l'esame (che equivale a 16000 μm2 per 200 griglie di rame a maglie).</li>
	<li>Per valutare il numero di megacariociti, quantificare solo i quadrati che sono completamente coperti da una sezione. Per fare ciò, utilizzare un modello basato sullo screening degli intervalli. Osserva una prima gamma di quadrati da un'estremità della sezione a un'altra, poi un'altra gamma allo stesso modo, ecc. Utilizzando questa procedura, schermare completamente e sistematicamente l'intero midollo trasversale sezione quadrato per quadrato.</li>
	<li>Per ogni quadrato, segna il numero di megacariociti dello stadio I, II o III. NOTA: sono necessari ingrandimenti più elevati per analizzare i granuli, l'organizzazione DMS, la dimensione dei territori citoplasmatici e il nucleo polilobulato.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

L'esame diretto dei megacariociti nel loro ambiente nativo è essenziale per comprendere la megacariopoiesi e la formazione piastrinica. In questo manoscritto, forniamo un metodo di microscopia elettronica a trasmissione che combina il lavaggio del midollo osseo e la fissazione per immersione, consentendo di sezionare in situ le caratteristiche morfologiche dell'intero processo di morfogenesi dei megacariociti che si svolge nel midollo osseo.
Il rossore del midollo osseo è un passaggio...

I megacariociti sono cellule poliploidi specializzate di grandi dimensioni, localizzate nel midollo osseo, responsabili della produzione piastrinica1. Hanno origine da cellule staminali ematopoietiche attraverso un intricato processo di maturazione, durante il quale i precursori dei megacariociti aumentano progressivamente di dimensioni, mentre subiscono estesi cambiamenti morfologici concomitanti nel citoplasma e nel nucleo2. Durante la maturazione, i megacariociti sviluppano una serie di elementi strutturali distinguibili tra cui: un nucleo polilobulato, invaginazioni della membrana superficiale che formano il sistema di membrana di demarcazione (DMS), una zona periferica priva di organelli circondata dalla rete citoscheletrica a base di actina e numerosi organelli tra cui α-granuli, granuli densi, lisosomi e complessi multipli di Golgi. A livello ultrastrutturale, una modifica importante osservata è la compartimentazione citoplasmatica in regioni discrete delimitate dal DMS3. Questa vasta fornitura di membrane alimenterà l'estensione di lunghi processi citoplasmatici nella fase iniziale della produzione piastrinica, che poi si rimodellerà in piastrine all'interno della circolazione. Qualsiasi difetto durante la differenziazione e la maturazione dei megacariociti può influenzare la produzione piastrinica in termini di conta piastrinica e/o funzione piastrinica. 
La microscopia elettronica a trasmissione a strato sottile (TEM) è stata l'approccio di imaging di scelta per decenni fornendo un'ultrastruttura di alta qualità dei megacariociti che hanno plasmato la nostra comprensione della fisiologia della trombopoiesi4,5. Questo documento si concentra su un metodo TEM standardizzato che consente di catturare il processo di biogenesi piastrinica che si verifica in situ all'interno del microambiente del midollo osseo nativo, che potrebbe anche servire come base per analizzare qualsiasi tipo di cellula del midollo osseo. Forniamo esempi ultrastrutturali dello sviluppo di megacariociti da immaturi a completamente maturi, che estendono i processi citoplasmatici nella microcircolazione delle sinusoidi6. Descriviamo anche una procedura semplice per quantificare le diverse fasi di maturazione dei megacariociti, istruendo sulla rigenerazione e sulla capacità di produzione piastrinica del midollo osseo.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri(dimetilamminometil)fenolo (DMP-30)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio tipo LM-3 Microscopia elettronica agar a basso punto di fusione</td><td>Sciences, USA</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Cloruro di calcio esaidrato</td><td>Merck, Germania</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Griglie in rame 200 mesh a barra sottile</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, Inghilterra</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Acido dimetilarsinico sale di sodio triidrato</td><td>Merck, Germania</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Anidride dodecenilsuccina (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio inossidabile a doppio taglio</td><td>Microscopia elettronica Sciences-EMS, USA</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>VWR International, Francia</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filter carta, diametro 90 mm</td><td>Whatman, Inghilterra</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Stampo piatto in silicone per inclusione</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, Inghilterra</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide 25%</td> <td>Microscopia elettronica Sciences-EMS, USA</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Coltello diamantato Histo 45&deg;</td><td>Diatome, Svizzera</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio JEOL 2100 Plus TEM</td><td>JEOL, Giappone</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di piombo - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>Resina LX-112</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma, Francia</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio - Poli(metacrilato-co-metilmetacrilato)</td><td>Microscopia elettronica Sciences-EMS, USA</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Anidride metilica nadica (NMA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 2%</td><td>Merck, Germania</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene (1,2-epossipropano)</td><td>Sigma, Francia</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione iniettabile salina 0,9% NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, Francia</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Lama in acciaio chirurgico</td><td>Swann-Morton,</td> <td>Inghilterra.0508</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato di sodio - Borace</td><td>Sigma, Francia</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck, Germania</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2&micro; m</td><td>Pall Corporation, USA</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Blu di toluidina</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

sul posto esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

La differenziazione e la maturazione dei megacariociti avvengono in stretta associazione con i componenti cellulari ed extracellulari del midollo osseo. Questi processi sono caratterizzati dalla graduale comparsa di strutture essenziali nel citoplasma dei megacariociti come un nucleo poliploide e polilobulato, una rete di membrana interna chiamata sistema di membrana di demarcazione (DMS) e i granuli densi e alfa che si troveranno nelle piastrine circolanti. In questo articolo, descriviamo un protocollo standardizzato per lo studio ultrastrutturale in situ dei megacariociti murini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), consentendo l'identificazione delle caratteristiche chiave che definiscono il loro stadio di maturazione e la densità cellulare nel midollo osseo. I midollo osseo vengono lavati, fissati, disidratati in etanolo, incorporati in resina plastica e montati per generare sezioni trasversali. Sezioni semisottili e sottili sono preparate rispettivamente per osservazioni istologiche e TEM. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi cellula del midollo osseo, in qualsiasi struttura EM e ha il vantaggio di utilizzare campioni di piccole dimensioni che consentono la combinazione di diversi approcci di imaging sullo stesso topo.

Istologia del midollo osseo L'osservazione dell'istologia blu toluidina del midollo osseo al microscopio ottico è la chiave per analizzare rapidamente l'architettura complessiva del tessuto in termini, ad esempio, di compattezza dei tessuti, continuità dei microvasi e dimensioni e forma dei megacariociti (Figura 1D). Viene eseguito prima di sezioni ultrassanteli per determinare la necessità di tagliare più in profondità nel blocco del midollo osseo. A cau...

Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.

Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'ultra struttura dei megacariociti situati all'interno del midollo osseo del topo e quantificare le diverse fasi di maturazione utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione. Il vantaggio principale è l'esame diretto dei megacariociti nell'ambiente nativo, che si differenzia dai megacariociti coltivati in vitro che come sappiamo non raggiungono il livello completo di maturazione. Dopo aver raccolto la tibia e i femori da topi C57BL/6 di 12-18 settimane secondo i protocolli standard, utilizzare una lama di rasoio affilata per rimuovere le epifisi da ciascun osso.Tenendo ogni osso con una pinzetta, inserire un ago calibro 21 attaccato a una siringa da cinque millilitri riempita con tampone di cacodilato in un'estremità dell'osso e lavare il midollo osseo in un tubo di raccolta da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone di cacodilato fresco. Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire i cilindri del midollo osseo in un millilitro di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca per un'incubazione di 60 minuti a temperatura ambiente. Per incorporare il midollo osseo nell'agarose, lavare i campioni fissi in un tampone di cacodilato fresco e utilizzare una pipetta di plastica per trasferire con cura il midollo osseo in un vetrino.Usando una pipetta calda, applicare rapidamente una goccia di agar liquido al 2% sui cilindri del midollo osseo e posizionare immediatamente il vetrino sul ghiaccio per uno o due minuti. Quando l'agar si è solidificato, utilizzare uno stereomicroscopio e una lama di rasoio affilata per scartare le estremità di ciascun cilindro del midollo osseo e trasferire i blocchi di midollo tagliati in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro contenente un millilitro di tampone cacodilato. Per l'incorporamento della resina, fissare i blocchi con tetroxide di osmio all'1% in tampone di cacodilato in una cappa chimica per un'ora a quattro gradi Celsius prima di lavare i blocchi una volta con tampone di cacodilato e una volta con acqua distillata.Dopo il lavaggio con acqua, colorare i blocchi con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per un'ora seguita da due lavaggi in acqua distillata come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare i blocchi attraverso una serie ascendente di immersioni di etanolo e acqua distillata come indicato. Per ottenere un'infiltrazione e polimerizzazione uniforme della resina epossidica all'interno del midollo, incubare i blocchi in due bagni successivi di ossido di propilene per 15 minuti prima di incubare i campioni in una miscela one-to-one di ossido di propilene al 100% e resina epossidica per un'ora su uno shaker rotativo lento a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, aggiungere resina epossidica al 100% ai blocchi di midollo per un'incubazione notturna nelle stesse condizioni, quindi aggiungere resina epossidica al 100% per un'altra incubazione di due ore. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un microscopio per orientare i blocchi di midollo in stampi in silicone piatti per consentire il loro successivo sezionamento trasversale e riempire gli stampi con resina epossidica prima di posizionarli a 60 gradi Celsius per 48 ore. Per il sezionamento ultra sottile, montare il blocco del campione su un supporto ultra microtome e montare il supporto sul supporto del campione.Utilizzare una fresa diamantata per tagliare i campioni con un angolo di 45 gradi per rimuovere la resina in eccesso attorno al tessuto prima di utilizzare una lama diamantato dotata di un serbatoio dell'acqua per tagliare sezioni trasversali di 500 e 100 nanometri di spessore rispettivamente per l'analisi istologica e TEM, quindi utilizzare un anello per trasferire le sezioni spesse 500 nanometri che galleggiano sulla superficie dell'acqua su un vetrino e per depositare lo spessore di 100 nanometri sezioni su 200 griglie di rame a barra sottile a rete con un filtro di carta sotto. Per la colorazione blu toluidina, dopo aver disegnato le sezioni spesse 500 nanometri su una piastra calda a 60 gradi, aggiungere l'1% di toluidina blu filtrato in acqua distillata alle sezioni per un'incubazione da uno a due minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni con acqua distillata.Quando i vetrini si sono asciugati, utilizzare il mezzo di montaggio per montare i campioni con un coperchio e visualizzare i campioni al microscopio ottico. Per la colorazione a contrasto, etichettare le sezioni da 100 nanometri con acetato di uranile al 4% per cinque minuti, seguito da tre lavaggi di cinque minuti con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, colorare le sezioni con citrato di piombo per tre minuti, seguiti da tre lavaggi di cinque minuti in acqua distillata come dimostrato.Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare prima il lato inferiore di ogni griglia a contatto con un pezzo di carta da filtro per consentire alle griglie di essere posizionate sulla carta da filtro per asciugare. Per esaminare le sezioni di TEM, quando le griglie si sono asciugate, selezionare un basso ingrandimento per valutare la qualità generale dei preparati. Per determinare il numero di megacariociti da ogni stadio di maturazione in ogni sezione trasversale, selezionare un ingrandimento più elevato e quantificare il numero di megacariociti di stadio I, II o III solo in quadrati completamente coperti da tessuto.In questa analisi istologica rappresentativa, la compattezza della continuità dei micro-vasi e le dimensioni e la forma dei megacariociti possono essere chiaramente osservate. I megacariociti murini sono divisi in quattro fasi di maturazione. I megacariociti di stadio I hanno un grande nucleo.Anche la presenza del primo stadio rilevabile del sistema a membrana di demarcazione è un criterio chiave di questa fase. Nella fase II, inizia la formazione di granuli e viene avviato lo sviluppo del sistema di membrana di demarcazione. I megacariociti allo stadio III sono cellule giganti con sistemi di membrana di demarcazione ben sviluppati, territori citoplasmatici chiaramente definiti e zone periferiche prive di organelli e nuclei eccentricamente posizionati.Lo stadio dei pirenociti della maturazione dei megacariociti è caratterizzato da un nucleo nudo. Come illustrato, i megacariociti sono frequentemente osservati a contatto con le cellule endoteliali. A volte, i megacariociti formano brevi sporgenze invasive che penetrano nell'endotelio o estendono i proplati nel lume sinusoidale.TEM permette anche la visualizzazione di dettagli ultra strutturali, così come la presenza di cellule ematopoietiche che sono state inghiottite dai megacariociti. Il rossore del midollo osseo deve essere eseguito con attenzione e immediatamente dopo la dissezione ossea. Per massimizzare l'integrità dei tessuti, il midollo è circondato da un gel di agar prima della disidratazione.Seguendo questa procedura, i blocchi di midollo osseo possono essere ripresi a diversi ingrandimenti o possono essere utilizzati per altre analisi di microscopia elettronica 3D, come la microscopia elettronica a scansione a fascio ionica focalizzato.

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Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Descriviamo qui il metodo per l'imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell'osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Qui presentiamo una strategia di immunofenotipizzazione per la caratterizzazione della differenziazione dei megacariociti, e mostriamo come tale strategia consente lo smistamento dei megacariociti in diverse fasi con uno smistatore di cellule attivato dalla fluorescenza. La metodologia può essere applicata ai tessuti primari umani, ma anche ai megacariociti generati in coltura in vitro.

Immunofenotipizzazione e smistamento cellulare di MK umani da fonti primarie umane o differenziati in vitro da progenitori ematopoietici

Qui viene presentata una procedura di puntura per la formazione di trombi emostatici. I trombi formati sono grandi e hanno un diametro di centinaia di micron. Pertanto, gli approcci di imaging volumetrico sono appropriati. Suggeriamo la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata come approccio ad alta risoluzione disponibile per molti e dettagliamo un protocollo preparativo.

Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

Scopri l'analisi ultrastrutturale dei megacariociti nel midollo osseo murino usando la microscopia elettronica a trasmissione. Questo metodo permette di quantificare gli stadi di maturazione in situ con alta risoluzione.

Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

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