Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità
6 agosto 2021
Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.
Il protocollo fornisce un modello per studiare i meccanismi di danno vascolare e il successivo sviluppo di edema in modo non invasivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile seguire la lesione dal vivo nel tempo senza intervento chirurgico. Ciò fornisce strade per testare i trattamenti in modo più efficiente.
Può essere difficile imparare come eseguire correttamente le venature della coda e accogliere correttamente l'animale nella piattaforma. Per entrambe le tecniche consiglio di essere pazienti e di prendere le cose lentamente. Per iniziare, maneggiare delicatamente il cavo in fibra ottica e collegarlo alla scatola di controllo laser e all'adattatore laser del microscopio per imaging retinico, quindi accendere la scatola della lampada del microscopio di imaging retinico.
Accendere il computer e aprire il programma di imaging. Posizionare un pezzo di carta bianca davanti all'oculare del microscopio e regolare il bilanciamento del bianco facendo clic su Regola nel programma di imaging. Accendere la scatola di controllo laser ruotando la chiave e seguendo le istruzioni sullo schermo della scatola di controllo laser.
Per verificare la potenza laser di base, impostare la scatola di controllo laser su 50 milliwatt e 2.000 millisecondi. Quindi accendere il laser e posizionare il misuratore di potenza davanti all'oculare. Premere il pedale dell'interruttore a pedale per attivare il laser, puntando alla lettura della potenza del laser da 13 a 15 milliwatt.
Quindi, utilizzando lo schermo della scatola di controllo laser, regolare la potenza del laser sperimentale su 100 milliwatt e 1.000 millisecondi e spegnere il laser. Versare 300 millilitri di acqua in un becher da 500 millilitri e riscaldare il becher in un forno a microonde per un minuto. Quindi posizionare una garza nell'acqua tiepida.
Quindi metti un topo maschio di due mesi in un contenitore. Premere delicatamente la garza calda nella coda del topo e cercare le vene dilatate. Utilizzando un ago da 26 gauge, iniettare la quantità appropriata di rosa bengala in base al peso dell'animale e applicare pressione sul sito di iniezione per prevenire ematomi o sanguinamento prima di pulire il sito.
Quindi rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e riportarlo nella gabbia. Lasciare otto minuti affinché il bengala rosa circoli prima dell'iniezione di anestetici. Accendere la piattaforma del mouse riscaldata.
Quindi aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide in ciascun occhio del topo. Dopo aver confermato l'anestesia, aggiungere una goccia di proparacaina cloridrato per occhio, quindi aggiungere un unguento oculare a entrambi gli occhi. Quindi, iniettare 150 microlitri di carprofen per via sottocutanea tra le orecchie.
Quindi posizionare il mouse sulla piattaforma e regolare la piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata. Conta le vene retiniche e scatta un'immagine del fondo. Quindi, accendere il laser e mirare verso una vena retinica a circa 375 micrometri dal disco ottico.
Irradiare il recipiente premendo l'interruttore a pedale e spostando leggermente il raggio laser fino a 100 micrometri. Ripetere questo passaggio tre volte e spostare il raggio laser dopo ogni impulso in modo che l'irradiazione non sia focalizzata in un punto. Ripetere l'irradiazione su altri vasi principali per ottenere da due a tre occlusioni.
Dopo aver irradiato i recipienti, spegnere la lampada e attendere 10 minuti. Quindi riaccendi la lampada, conta il numero di vene occluse e scatta un'immagine del fondo. Dopo l'acquisizione dell'immagine e l'iniezione salina, aggiungere colliri lubrificanti e unguento gel su entrambi gli occhi.
Guarda il topo mentre si riprende dall'anestesia e riportalo nella gabbia con altri animali solo quando è completamente recuperato. Il numero di occlusioni raggiunte immediatamente dopo l'irradiazione laser non era diverso tra gli animali che sono stati laserati 10 e 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala. Il numero di occlusioni sostenute fino a un giorno dopo l'occlusione venosa retinica è diminuito significativamente negli animali laserati 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala indipendentemente dal genotipo.
Senza modificare la potenza sperimentale di 100 milliwatt, una bassa potenza laser di base di 11,5 milliwatt non ha provocato occlusioni. Al contrario, un'uscita laser di base di 13,5 milliwatt ha portato a occlusioni di successo. Quattro tipi principali di occlusioni si verificano dopo la fotocoagulazione laser: vasi completamente occlusi, vasi parzialmente occlusi, vasi parzialmente riperfusi e vasi completamente riperfusi.
La vascolarizzazione irradiata dei topi knockout delle cellule endoteliali inducibili da Tamoxifene, Casp9, ha trascorso più tempo in stati parzialmente riperfusi e parzialmente occlusi rispetto a quella dei topi C57 Black 6, che hanno trascorso più tempo in stati completamente occlusi. Lo stato di occlusione dei vasi cambia rapidamente entro i primi 10 minuti dopo la fotocoagulazione laser e si osservano emorragie a forma di fiamma 24 ore dopo l'infortunio. Diverse patologie oftalmiche si sono verificate dopo l'occlusione venosa retinica.
Il livello di edema retinico dopo occlusione venosa retinica può essere quantificato negli occhi feriti utilizzando immagini di tomografia a coerenza ottica. Lo stato degli strati neuronali può anche essere determinato valutando la disorganizzazione degli strati interni della retina. Un esempio di immagine di tomografia a coerenza ottica con le etichette corrispondenti per ogni strato è mostrato qui.
La misurazione della potenza laser di base è importante. Questa lettura avrà un grande impatto sul successo delle occlusioni e può essere ottimizzata. È possibile eseguire metodi aggiuntivi come OCT, ERG e Opger.
Ciò contribuirà ad affrontare gli effetti del danno neurovascolare sull'integrità neuronale retinica e sulla funzione del percorso visivo. Questa tecnica apre la strada per interrogare i percorsi molecolari che guidano la malattia neurovascolare e, seguendo i singoli animali nel tempo, fornisce dati che possono essere più facilmente tradotti in malattie umane.
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Panoramica
Questo studio delinea un protocollo ottimizzato per l'occlusione della vena retinica utilizzando il rose bengal e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato da laser. Il modello facilita l'indagine dei meccanismi di lesioni vascolari e lo sviluppo dell'edema in tempo reale senza intervento chirurgico, consentendo test di trattamento più efficienti.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Oftalmologia
- Biologia vascolare
Contesto
- I modelli di occlusione della vena retinica sono importanti per lo studio delle lesioni vascolari.
- Il rose bengal serve come agente vitale per migliorare l'efficacia dell'imaging e dell'occlusione.
- Il metodo permette l'osservazione in vivo del danno retinico e della guarigione.
- È enfatizzata una migliore capacità di quantificare le risposte retiniche utilizzando tecniche come la tomografia a coerenza ottica (OCT).
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un modello riproducibile per indagare le lesioni vascolari retiniche.
- Misurare e osservare i cambiamenti negli stati dei vasi sanguigni retinici dopo l'occlusione indotta dal laser.
- Migliorare la conoscenza degli effetti della lesione neurovascolare sulla funzione retinica.
Metodi utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è un microscopio di imaging retinico guidato da laser.
- Il modello biologico consiste in topi geneticamente modificati utilizzati per valutare le occlusioni vascolari.
- I passaggi critici comportano l'acquisizione di immagini, le impostazioni di controllo del laser e la corretta manipolazione del rose bengal.
- Sono stati annotati i misurazioni della potenza del laser e i tempi appropriati dopo la somministrazione di rose bengal.
- Sono stati specificati i protocolli per l'anestesia e il monitoraggio del recupero per garantire il benessere degli animali.
Risultati principali
- Il tempismo dell'applicazione del laser dopo la dose di rose bengal ha influenzato il numero di occlusioni sostenute.
- Sono stati osservati diversi stati di occlusione, rivelando importanti informazioni sulle risposte emorragiche post-lesione.
- Sono state quantificate le principali modifiche molecolari, dimostrando l'efficacia del modello per studiare i meccanismi di riparazione vascolare.
- L'imaging OCT è stato utilizzato per valutare l'edema retinico e la disorganizzazione dello strato interno.
Conclusioni
- Questo protocollo consente un'indagine dettagliata dei meccanismi delle malattie neurovascolari.
- La capacità di monitorare i cambiamenti retinici nel tempo aiuterà a tradurre i risultati in condizioni umane.
- Nel complesso, lo studio migliora la comprensione delle lesioni vascolari e il potenziale per interventi di trattamento nelle malattie retiniche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This optimized retinal vein occlusion model addresses variability in preclinical ophthalmology studies by standardizing critical procedural parameters. By controlling baseline laser output and post-dye administration timing, the method improves reproducibility of vascular injury induction across genetically diverse mouse strains. This supports more reliable evaluation of neurovascular therapeutics targeting retinal edema and hypoxic-ischemic injury mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular injury pathways in retinal disease models with controlled occlusion consistency.
- Operational Value: Reduces experimental noise from variable laser timing and power settings, improving assay sensitivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized vascular injury model for evaluating compound effects on retinal edema and reperfusion dynamics.
- Operational Value: Supports reproducible endpoint measurement via optical coherence tomography for quantitative screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models neurovascular injury progression including hemorrhage and neuronal layer disorganization relevant to human retinal pathologies.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of vascular repair mechanisms in the same animal over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing by providing a quantifiable model of retinal vascular injury.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular drivers in vascular leakage and inflammatory responses post-occlusion.
- Screening: Enables standardized assessment of therapeutic candidates on occlusion persistence and edema reduction.
- Analytics: Generates quantitative OCT-derived metrics on retinal thickness and layer integrity for comparative analysis.
- Translational Research: Models human-relevant neurovascular injury phenotypes including flame-shaped hemorrhages and inner retinal disruption.
- Enterprise Reuse: Adaptable across mouse strains and genetic backgrounds for consistent target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing biological variability in injury models.
- Operational Value: Standardizes laser and dye timing parameters to enhance inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision reliability by minimizing false negatives from inconsistent model penetrance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurovascular candidates based on reproducible edema and reperfusion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical tail vein injection and retinal imaging microscopy.
- Dependent on calibrated laser systems with adjustable baseline and experimental power settings.
- Necessitates standardized animal handling and anesthesia protocols to minimize physiological confounders.
- Must account for strain-specific vascular responses when comparing occlusion durability across genotypes.
- Limited by the learning curve in achieving consistent venous cannulation and laser targeting precision.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Laser Setup
2:05
Mouse Tail Vein Injection of Rose Bengal
2:54
Occlusion of Major Veins
4:07
Establishing the Number of Veins Occluded at Day 0 and Aftercare
4:40
Results: Analysis of Types and Timelines of Photo-Occlusion, Baseline and Experimental Laser Output Measurement, Ophthalmic Pathologies, and Quantification of OCT Images
6:37
Conclusion
