Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.

Il protocollo fornisce un modello per studiare i meccanismi di danno vascolare e il successivo sviluppo di edema in modo non invasivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile seguire la lesione dal vivo nel tempo senza intervento chirurgico. Ciò fornisce strade per testare i trattamenti in modo più efficiente.

Può essere difficile imparare come eseguire correttamente le venature della coda e accogliere correttamente l'animale nella piattaforma. Per entrambe le tecniche consiglio di essere pazienti e di prendere le cose lentamente. Per iniziare, maneggiare delicatamente il cavo in fibra ottica e collegarlo alla scatola di controllo laser e all'adattatore laser del microscopio per imaging retinico, quindi accendere la scatola della lampada del microscopio di imaging retinico.

Accendere il computer e aprire il programma di imaging. Posizionare un pezzo di carta bianca davanti all'oculare del microscopio e regolare il bilanciamento del bianco facendo clic su Regola nel programma di imaging. Accendere la scatola di controllo laser ruotando la chiave e seguendo le istruzioni sullo schermo della scatola di controllo laser.

Per verificare la potenza laser di base, impostare la scatola di controllo laser su 50 milliwatt e 2.000 millisecondi. Quindi accendere il laser e posizionare il misuratore di potenza davanti all'oculare. Premere il pedale dell'interruttore a pedale per attivare il laser, puntando alla lettura della potenza del laser da 13 a 15 milliwatt.

Quindi, utilizzando lo schermo della scatola di controllo laser, regolare la potenza del laser sperimentale su 100 milliwatt e 1.000 millisecondi e spegnere il laser. Versare 300 millilitri di acqua in un becher da 500 millilitri e riscaldare il becher in un forno a microonde per un minuto. Quindi posizionare una garza nell'acqua tiepida.

Quindi metti un topo maschio di due mesi in un contenitore. Premere delicatamente la garza calda nella coda del topo e cercare le vene dilatate. Utilizzando un ago da 26 gauge, iniettare la quantità appropriata di rosa bengala in base al peso dell'animale e applicare pressione sul sito di iniezione per prevenire ematomi o sanguinamento prima di pulire il sito.

Quindi rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e riportarlo nella gabbia. Lasciare otto minuti affinché il bengala rosa circoli prima dell'iniezione di anestetici. Accendere la piattaforma del mouse riscaldata.

Quindi aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide in ciascun occhio del topo. Dopo aver confermato l'anestesia, aggiungere una goccia di proparacaina cloridrato per occhio, quindi aggiungere un unguento oculare a entrambi gli occhi. Quindi, iniettare 150 microlitri di carprofen per via sottocutanea tra le orecchie.

Quindi posizionare il mouse sulla piattaforma e regolare la piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata. Conta le vene retiniche e scatta un'immagine del fondo. Quindi, accendere il laser e mirare verso una vena retinica a circa 375 micrometri dal disco ottico.

Irradiare il recipiente premendo l'interruttore a pedale e spostando leggermente il raggio laser fino a 100 micrometri. Ripetere questo passaggio tre volte e spostare il raggio laser dopo ogni impulso in modo che l'irradiazione non sia focalizzata in un punto. Ripetere l'irradiazione su altri vasi principali per ottenere da due a tre occlusioni.

Dopo aver irradiato i recipienti, spegnere la lampada e attendere 10 minuti. Quindi riaccendi la lampada, conta il numero di vene occluse e scatta un'immagine del fondo. Dopo l'acquisizione dell'immagine e l'iniezione salina, aggiungere colliri lubrificanti e unguento gel su entrambi gli occhi.

Guarda il topo mentre si riprende dall'anestesia e riportalo nella gabbia con altri animali solo quando è completamente recuperato. Il numero di occlusioni raggiunte immediatamente dopo l'irradiazione laser non era diverso tra gli animali che sono stati laserati 10 e 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala. Il numero di occlusioni sostenute fino a un giorno dopo l'occlusione venosa retinica è diminuito significativamente negli animali laserati 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala indipendentemente dal genotipo.

Senza modificare la potenza sperimentale di 100 milliwatt, una bassa potenza laser di base di 11,5 milliwatt non ha provocato occlusioni. Al contrario, un'uscita laser di base di 13,5 milliwatt ha portato a occlusioni di successo. Quattro tipi principali di occlusioni si verificano dopo la fotocoagulazione laser: vasi completamente occlusi, vasi parzialmente occlusi, vasi parzialmente riperfusi e vasi completamente riperfusi.

La vascolarizzazione irradiata dei topi knockout delle cellule endoteliali inducibili da Tamoxifene, Casp9, ha trascorso più tempo in stati parzialmente riperfusi e parzialmente occlusi rispetto a quella dei topi C57 Black 6, che hanno trascorso più tempo in stati completamente occlusi. Lo stato di occlusione dei vasi cambia rapidamente entro i primi 10 minuti dopo la fotocoagulazione laser e si osservano emorragie a forma di fiamma 24 ore dopo l'infortunio. Diverse patologie oftalmiche si sono verificate dopo l'occlusione venosa retinica.

Il livello di edema retinico dopo occlusione venosa retinica può essere quantificato negli occhi feriti utilizzando immagini di tomografia a coerenza ottica. Lo stato degli strati neuronali può anche essere determinato valutando la disorganizzazione degli strati interni della retina. Un esempio di immagine di tomografia a coerenza ottica con le etichette corrispondenti per ogni strato è mostrato qui.

La misurazione della potenza laser di base è importante. Questa lettura avrà un grande impatto sul successo delle occlusioni e può essere ottimizzata. È possibile eseguire metodi aggiuntivi come OCT, ERG e Opger.

Ciò contribuirà ad affrontare gli effetti del danno neurovascolare sull'integrità neuronale retinica e sulla funzione del percorso visivo. Questa tecnica apre la strada per interrogare i percorsi molecolari che guidano la malattia neurovascolare e, seguendo i singoli animali nel tempo, fornisce dati che possono essere più facilmente tradotti in malattie umane.