Name: Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Impara un protocollo ottimizzato di occlusione venosa retinica nel topo usando rosa bengala e laser per studiare lesioni vascolari ed edema in tempo reale senza intervento chirurgico.

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<div>Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (al CCO), dal National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (all'AMP) e dal National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (al CMT).</div>

Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.
NOTA: Tutti gli esperimenti hanno utilizzato topi maschi di due mesi che pesavano circa 20 g.
1. Preparazione e somministrazione di tamoxifene per l'ablazione genetica inducibile di geni floxati
NOTA: Il diametro dei vasi retinici può essere influenzato dal peso dell'animale. Assicurati che tutti gli animali utilizzati per un esperimento abbiano pesi simili.
<ol><li>Diluire il tamoxifene in olio di mais ad una concentrazione di 20 mg/ml. NOTA: Il tamoxifene è un tossico ed è sensibile alla luce. Proteggere dalla luce, ad esempio, con un foglio di alluminio.</li>
	<li>Vortice la soluzione per un paio di secondi.</li>
	<li>Lasciare in forno a 55 °C per 15 min. NOTA: Assicurarsi che il tamoxifene si sia sciolto completamente. Potrebbe essere necessario un ulteriore vortice.</li>
	<li>Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 1 settimana.</li>
	<li>Utilizzare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G per l'iniezione di tamoxifene. Pulire l'area di iniezione con etanolo al 70%.  Somministrare 2 mg di tamoxifene (100 μL da 20 mg/ml) per via intraperitoneale (IP) una volta al giorno per il tempo stabilito secondo la specifica linea Cre inducibile.</li>
	<li>Concedere due giorni di riposo per gli animali prima di iniziare gli esperimenti.</li>
</ol>2. Preparazione di reagenti per fotocoagulazione laser
<ol><li>Rosa bengala NOTA: Il bengala rosa è sensibile alla luce. Conservare al buio fino all'uso e preparare fresco per ottenere i migliori risultati.<ol><li>Preparare il bengala rosa diluendolo a 5 mg/ml in soluzione salina sterile e filtrarlo attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm.</li>
		<li>Preparare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G con rosa bengala.</li>
	</ol></li>
	<li>Ketamina/xilazina<ol><li>Diluire ketamina e xilazina in soluzione salina sterile di conseguenza per le seguenti concentrazioni: ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Carprofen<ol><li>Diluire il carprofen a 1 mg/ml in soluzione salina sterile.</li>
		<li>Preparare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G con carprofene.</li>
	</ol></li>
	<li>Soluzione salina sterile<ol><li>Preparare una siringa da 5 mL dotata di un ago da 26 G con soluzione salina sterile.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Configurazione laser
<ol><li>Maneggiare delicatamente il cavo in fibra ottica e collegarlo alla scatola di controllo laser e all'adattatore laser del microscopio di imaging retinico.</li>
	<li>Accendere la scatola della lampada del microscopio per imaging retinico.</li>
	<li>Accendere il computer e aprire il programma di imaging.</li>
	<li>Regolare il bilanciamento del bianco utilizzando un foglio di carta bianca e mettendolo davanti all'occhio del mouse e facendo clic su Regola nel programma di imaging.</li>
	<li>Accendere la scatola di controllo laser ruotando la chiave e seguendo le istruzioni sullo schermo della scatola di controllo laser. NOTA: Il laser utilizzato in questo esperimento è di classe 3B e può causare danni agli occhi. Indossare occhiali protettivi durante l'utilizzo del laser.</li>
	<li>Verificare la potenza laser di base.<ol><li>Utilizzare un misuratore di potenza laser.</li>
		<li>Regolare lo schermo della scatola di controllo laser sui seguenti parametri: 50 mW e 2.000 ms.</li>
		<li>Accendere il laser e posizionare il misuratore di potenza davanti all'oculare. NOTA: assicurarsi che la luce del microscopio sia spenta durante il test della potenza laser di base.</li>
		<li>Premere il pedale dell'interruttore a pedale per attivare il laser.</li>
		<li>Puntare alla lettura della potenza del laser di 13-15 mW. NOTA: La lettura della potenza laser determinerà la percentuale di successo per le occlusioni venose retiniche. Se la lettura della potenza del laser è troppo bassa, è possibile regolare la potenza e il tempo di esposizione del laser. Si veda la tabella 1 per le raccomandazioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Regolare la potenza del laser sperimentale impostando lo schermo della scatola di controllo laser per i seguenti parametri: 100 mW, 1.000 ms.</li>
	<li>Spegnere il laser. NOTA: per sicurezza e per evitare il surriscaldamento, è meglio tenere il laser spento tra i mouse.</li>
</ol>4. Iniezione della vena della coda di topo di rosa bengala
<ol><li>Versare 300 ml di acqua in un becher da 500 ml.</li>
	<li>Riscaldare il becher in un forno a microonde per 1 minuto.</li>
	<li>Metti una garza nell'acqua calda nel becher.</li>
	<li>Metti il mouse in un sistema di ritenuta.</li>
	<li>Premere delicatamente la garza nella coda del topo e cercare le vene dilatate. Disinfettare il sito di iniezione usando una salvietta imbevuta di alcool dopo la dilatazione dell'acqua calda.</li>
	<li>Inserisca l'ago nel sito di iniezione e tiri la siringa per assicurarsi di essere nella vena. Quindi, iniettare la vena della coda del topo, somministrando la quantità corretta in base al peso dell'animale (37,5 mg / kg). Applicare pressione sul sito di iniezione per evitare ematoma o sanguinamento. Cancella il sito.</li>
	<li>Rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e riportarlo nella gabbia.</li>
	<li>Lasciare circolare 8 minuti affinché il bengala rosa circoli prima dell'iniezione di anestetici. NOTA: Questo fornirà un totale di 10 minuti tra l'iniezione di rose bengala e l'irradiazione laser.</li>
</ol>5. Occlusione delle vene principali
<ol><li>Accendere la piattaforma del mouse riscaldata.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide in ciascun occhio.</li>
	<li>Iniettare 150 μL di anestetici, ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) IP. NOTA: durante questa procedura, al mouse sono state somministrate due iniezioni IP. Quindi, i lati erano alternati. L'iniezione IP per l'anestesia è stata somministrata nel quadrante addominale inferiore destro e la soluzione salina è stata iniettata nel quadrante addominale inferiore sinistro. Si raccomanda di tirare la siringa prima dell'iniezione per assicurarsi che l'ago sia nell'addome e non negli organi.</li>
	<li>Pizzicare l'animale per determinare la profondità dell'anestesia e attendere fino a quando non risponde.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di proparacaina cloridrato per occhio (analgesico).</li>
	<li>Aggiungi un unguento gel a entrambi gli occhi.</li>
	<li>Iniettare 150 μL di carprofen per via sottocutanea tra le orecchie.</li>
	<li>Posizionare il mouse sulla piattaforma.</li>
	<li>Regolare la piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata.</li>
	<li>Conta le vene retiniche e scatta un'immagine del fondo. NOTA: Le vene retiniche sono più scure e più larghe delle arterie. Vene e arterie si alternano; Tuttavia, a volte può esserci un'arteria ramificata vicino al nervo ottico e, quindi, due arterie adiacenti.</li>
	<li>Accendere il laser e puntare verso una vena retinica a circa 375 μm dal disco ottico.</li>
	<li>Irradiare il recipiente premendo l'interruttore a pedale e spostando leggermente il raggio laser fino a 100 μm. Ripetere questo passaggio tre volte e spostare il raggio laser dopo ogni impulso in modo che l'irradiazione non sia focalizzata in un punto.</li>
	<li>Ripetere l'irradiazione su altri vasi principali per ottenere 2-3 occlusioni.</li>
</ol>6. Stabilire il numero di vene occluse al giorno 0
<ol><li>Spegnere la lampada dopo aver irradiato i recipienti e attendere 10 minuti. NOTA: L'esposizione alla luce può causare danni alla retina e infiammazione; Spegnere la lampada durante il tempo di attesa per ridurre al minimo l'esposizione7.</li>
	<li>Riaccendere la lampada e contare il numero di vene occluse.</li>
	<li>Prendi un'immagine del fondo.</li>
</ol>7. Assistenza post-vendita
<ol><li>Iniettare 1 mL di IP salino sterile. NOTA: vedere i dettagli dell'iniezione IP nel paragrafo 5, punto 3.</li>
	<li>Aggiungere colliri lubrificanti su entrambi gli occhi.</li>
	<li>Aggiungi un unguento gel a entrambi gli occhi.</li>
	<li>Guarda il topo mentre si riprende dall'anestesia e non restituirlo alla gabbia con gli altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito. Carprofen (5 mg/kg) può essere somministrato giornalmente fino a 2 giorni dopo la procedura. Se applicato agli esseri umani, il dolore non è un sintomo di RVO. NOTA: Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non si riprendono completamente dall'anestesia.</li>
</ol>8. Valutazione dell'edema retinico mediante tomografia a coerenza ottica (OCT)
NOTA: questo passaggio può essere eseguito nel punto di interesse dello sperimentatore. Il picco di edema retinico per un topo C57BL / 6J è 1 giorno dopo la procedura RVO. Questo punto temporale può variare a seconda dello sfondo del mouse.
<ol><li>Accendere la scatola luminosa del microscopio per imaging retinico, la macchina OCT e la piattaforma del mouse riscaldata.</li>
	<li>Il giorno dopo l'occlusione, seguire i passaggi da 5.2 a 5.7 per preparare l'animale.</li>
	<li>Aprire i programmi software di imaging e dello Strumento di personalizzazione di Office.</li>
	<li>Nel programma dello Strumento di personalizzazione di Office regolare la spinta su 5.</li>
	<li>Prendi OCT a 75 μm distali dalla bruciatura o 4 clic.</li>
	<li>Prendere immagini OCT in quattro quadranti della retina.</li>
	<li>Analizzare le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il software di tracciamento.</li>
	<li>Confrontare lo spessore retinico delle misure pre-irradiate con 1 giorno dopo RVO o nel punto di interesse temporale. NOTA: Quando si analizzano i dati, prendere in considerazione il numero di vene irradiate in quanto ciò può influenzare lo sviluppo di edema retinico. Gli animali vengono quindi eutanizzati somministrando anestetico seguito da un intervento chirurgico di perfusione non di sopravvivenza.</li>
</ol>

<ol><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Ehlers, J. P., Fekrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vein+occlusion%3A+beyond+the+acute+event%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal vein occlusion: beyond the acute event.</a> Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).</li>
<li>Iftikhar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peak+vision+in+retinal+vein+occlusion+patients+treated+for+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema.</a> American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li>
<li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinal+morphology+alterations+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+mouse+model+of+retinal+branch+and+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion.</a> PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il modello RVO murino fornisce una strada per comprendere ulteriormente la patologia RVO e per testare potenziali terapie. Mentre il modello RVO del mouse è ampiamente utilizzato sul campo, vi è la necessità di un protocollo dettagliato corrente del modello che affronti la sua variabilità e descriva l'ottimizzazione del modello. Qui, forniamo una guida con esempi dall'esperienza su ciò che può essere modificato per ottenere i risultati più coerenti in una coorte di animali da esperimento e fornire dati affidabili.
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L'occlusione venosa retinica (RVO) è una malattia vascolare retinica comune che ha colpito circa 28 milioni di persone in tutto il mondo nel 20151. La RVO porta al declino della vista e alla perdita negli adulti e negli anziani in età lavorativa, rappresentando una malattia pericolosa per la vista in corso che si stima aumenterà nel prossimo decennio. Alcune delle patologie distinte della RVO includono lesioni ipossico-ischemiche, edema retinico, infiammazione e perdita neuronale2. Attualmente, la prima linea di trattamento per questo disturbo è attraverso la somministrazione di inibitori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Mentre il trattamento anti-VEGF ha contribuito a migliorare l'edema retinico, molti pazienti affrontano ancora un declino della vista3. Per comprendere ulteriormente la fisiopatologia di questa malattia e per testare potenziali nuove linee di trattamento, è necessario costituire un protocollo modello murino RVO funzionale e dettagliato per diversi ceppi murini.
I modelli murini sono stati sviluppati implementando lo stesso dispositivo laser utilizzato nei pazienti umani, abbinato a un sistema di imaging scalato alla dimensione corretta per un topo. Questo modello murino di RVO è stato segnalato per la prima volta nel 2007 4 e ulteriormente stabilito da Ebneter e altri 4,5. Alla fine, il modello è stato ottimizzato da Fuma et al. per replicare le manifestazioni cliniche chiave della RVO come l'edema retinico6. Da quando il modello è stato segnalato per la prima volta, molti studi lo hanno impiegato utilizzando la somministrazione di un colorante fotosensibilizzante seguito dalla fotocoagulazione delle principali vene retiniche con un laser. Tuttavia, la quantità e il tipo di colorante che viene somministrato, la potenza del laser e il tempo di esposizione variano significativamente tra gli studi che hanno utilizzato questo metodo. Queste differenze possono spesso portare a una maggiore variabilità nel modello, rendendolo difficile da replicare. Ad oggi, non ci sono studi pubblicati con dettagli specifici sulle potenziali strade per la sua ottimizzazione.
Questo rapporto presenta una metodologia dettagliata del modello murino RVO nel ceppo C57BL/6J e un ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 knockout (iEC Casp9KO) con un background C57BL/6J e di rilevanza per la patologia RVO come ceppo di riferimento per un topo geneticamente modificato. Uno studio precedente aveva dimostrato che l'attivazione non apoptotica della caspasi-9 endoteliale istiga l'edema retinico e promuove la morte neuronale8. L'esperienza nell'uso di questo ceppo ha aiutato a determinare e fornire informazioni su potenziali modifiche per personalizzare il modello murino RVO, che può essere applicabile ad altri ceppi geneticamente modificati.

<table><tbody><tr><td>Carprofene</td><td>Rimadyl</td><td>NADA #141-199</td><td>mantenere a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Olio di mais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cavo patch in fibra</td><td>Thor Labs</td><td>M14L02</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Lasercheck</td><td>coerente</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>fenilefrina</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoneix Micron IV con meridiano,&nbsp; StreamPix e moduli OCT</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proparacaina cloridrato</td><td>Akorn</td><td>NDC: 17478-263-12</td><td>mantenere a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Aggiorna</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-5G</td><td>Tropicamide sensibile alla luce</td></tr><tr><td></td><td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

I modelli murini di occlusione venosa retinica (RVO) sono spesso utilizzati in oftalmologia per studiare il danno ipossico-ischemico nella retina neurale. In questo rapporto, viene fornito un metodo dettagliato che evidenzia i passaggi critici con raccomandazioni per l'ottimizzazione per ottenere tassi di occlusione costantemente efficaci in diversi ceppi di topi geneticamente modificati. Il modello murino RVO consiste principalmente nella somministrazione endovenosa di un colorante fotosensibilizzante seguito da fotocoagulazione laser utilizzando un microscopio di imaging retinico collegato a un laser a guida oftalmica. Tre variabili sono state identificate come determinanti della coerenza dell'occlusione. Regolando il tempo di attesa dopo la somministrazione del bengala rosa e bilanciando la linea di base e l'uscita laser sperimentale, la variabilità tra gli esperimenti può essere limitata e un tasso di successo più elevato di occlusioni raggiunto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le malattie della retina caratterizzate da edema retinico e lesioni ipossico-ischemiche. Inoltre, poiché questo modello induce lesioni vascolari, può anche essere applicato per studiare la neurovascolarizzazione, la morte neuronale e l'infiammazione.

Il modello murino RVO mira a raggiungere con successo occlusioni nelle vene retiniche, portando a lesioni ipossico-ischemiche, rottura della barriera retinica del sangue, morte neuronale ed edema retinico8. La Figura 1 mostra una sequenza temporale dei passaggi per garantire la riproducibilità, uno schema del progetto sperimentale e delinea i passaggi che possono essere ulteriormente ottimizzati a seconda delle domande sperimentali. I tre passaggi principali che posso...

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Il protocollo fornisce un modello per studiare i meccanismi di danno vascolare e il successivo sviluppo di edema in modo non invasivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile seguire la lesione dal vivo nel tempo senza intervento chirurgico. Ciò fornisce strade per testare i trattamenti in modo più efficiente.Può essere difficile imparare come eseguire correttamente le venature della coda e accogliere correttamente l'animale nella piattaforma. Per entrambe le tecniche consiglio di essere pazienti e di prendere le cose lentamente. Per iniziare, maneggiare delicatamente il cavo in fibra ottica e collegarlo alla scatola di controllo laser e all'adattatore laser del microscopio per imaging retinico, quindi accendere la scatola della lampada del microscopio di imaging retinico.Accendere il computer e aprire il programma di imaging. Posizionare un pezzo di carta bianca davanti all'oculare del microscopio e regolare il bilanciamento del bianco facendo clic su Regola nel programma di imaging. Accendere la scatola di controllo laser ruotando la chiave e seguendo le istruzioni sullo schermo della scatola di controllo laser.Per verificare la potenza laser di base, impostare la scatola di controllo laser su 50 milliwatt e 2.000 millisecondi. Quindi accendere il laser e posizionare il misuratore di potenza davanti all'oculare. Premere il pedale dell'interruttore a pedale per attivare il laser, puntando alla lettura della potenza del laser da 13 a 15 milliwatt.Quindi, utilizzando lo schermo della scatola di controllo laser, regolare la potenza del laser sperimentale su 100 milliwatt e 1.000 millisecondi e spegnere il laser. Versare 300 millilitri di acqua in un becher da 500 millilitri e riscaldare il becher in un forno a microonde per un minuto. Quindi posizionare una garza nell'acqua tiepida.Quindi metti un topo maschio di due mesi in un contenitore. Premere delicatamente la garza calda nella coda del topo e cercare le vene dilatate. Utilizzando un ago da 26 gauge, iniettare la quantità appropriata di rosa bengala in base al peso dell'animale e applicare pressione sul sito di iniezione per prevenire ematomi o sanguinamento prima di pulire il sito.Quindi rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e riportarlo nella gabbia. Lasciare otto minuti affinché il bengala rosa circoli prima dell'iniezione di anestetici. Accendere la piattaforma del mouse riscaldata.Quindi aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide in ciascun occhio del topo. Dopo aver confermato l'anestesia, aggiungere una goccia di proparacaina cloridrato per occhio, quindi aggiungere un unguento oculare a entrambi gli occhi. Quindi, iniettare 150 microlitri di carprofen per via sottocutanea tra le orecchie.Quindi posizionare il mouse sulla piattaforma e regolare la piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata. Conta le vene retiniche e scatta un'immagine del fondo. Quindi, accendere il laser e mirare verso una vena retinica a circa 375 micrometri dal disco ottico.Irradiare il recipiente premendo l'interruttore a pedale e spostando leggermente il raggio laser fino a 100 micrometri. Ripetere questo passaggio tre volte e spostare il raggio laser dopo ogni impulso in modo che l'irradiazione non sia focalizzata in un punto. Ripetere l'irradiazione su altri vasi principali per ottenere da due a tre occlusioni.Dopo aver irradiato i recipienti, spegnere la lampada e attendere 10 minuti. Quindi riaccendi la lampada, conta il numero di vene occluse e scatta un'immagine del fondo. Dopo l'acquisizione dell'immagine e l'iniezione salina, aggiungere colliri lubrificanti e unguento gel su entrambi gli occhi.Guarda il topo mentre si riprende dall'anestesia e riportalo nella gabbia con altri animali solo quando è completamente recuperato. Il numero di occlusioni raggiunte immediatamente dopo l'irradiazione laser non era diverso tra gli animali che sono stati laserati 10 e 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala. Il numero di occlusioni sostenute fino a un giorno dopo l'occlusione venosa retinica è diminuito significativamente negli animali laserati 20 minuti dopo la somministrazione di rosa bengala indipendentemente dal genotipo.Senza modificare la potenza sperimentale di 100 milliwatt, una bassa potenza laser di base di 11,5 milliwatt non ha provocato occlusioni. Al contrario, un'uscita laser di base di 13,5 milliwatt ha portato a occlusioni di successo. Quattro tipi principali di occlusioni si verificano dopo la fotocoagulazione laser: vasi completamente occlusi, vasi parzialmente occlusi, vasi parzialmente riperfusi e vasi completamente riperfusi.La vascolarizzazione irradiata dei topi knockout delle cellule endoteliali inducibili da Tamoxifene, Casp9, ha trascorso più tempo in stati parzialmente riperfusi e parzialmente occlusi rispetto a quella dei topi C57 Black 6, che hanno trascorso più tempo in stati completamente occlusi. Lo stato di occlusione dei vasi cambia rapidamente entro i primi 10 minuti dopo la fotocoagulazione laser e si osservano emorragie a forma di fiamma 24 ore dopo l'infortunio. Diverse patologie oftalmiche si sono verificate dopo l'occlusione venosa retinica.Il livello di edema retinico dopo occlusione venosa retinica può essere quantificato negli occhi feriti utilizzando immagini di tomografia a coerenza ottica. Lo stato degli strati neuronali può anche essere determinato valutando la disorganizzazione degli strati interni della retina. Un esempio di immagine di tomografia a coerenza ottica con le etichette corrispondenti per ogni strato è mostrato qui.La misurazione della potenza laser di base è importante. Questa lettura avrà un grande impatto sul successo delle occlusioni e può essere ottimizzata. È possibile eseguire metodi aggiuntivi come OCT, ERG e Opger.Ciò contribuirà ad affrontare gli effetti del danno neurovascolare sull'integrità neuronale retinica e sulla funzione del percorso visivo. Questa tecnica apre la strada per interrogare i percorsi molecolari che guidano la malattia neurovascolare e, seguendo i singoli animali nel tempo, fornisce dati che possono essere più facilmente tradotti in malattie umane.

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La retina roditore è da tempo riconosciuta come finestra accessibile al cervello. In questa nota tecnica fornendo un protocollo che utilizza il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno per studiare i meccanismi che portano al fallimento di rigenerazione vascolare nel sistema nervoso centrale dopo lesione ischemica. Il sistema descritto può anche essere sfruttata per esplorare le strategie per promuovere la ricrescita dei vasi sanguigni funzionali all'interno della retina e del SNC.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

Qui, presentiamo il protocollo di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser (CNV) di topo, un modello sperimentale che ricrea i segni distintivi vascolari della degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD). Una volta padroneggiato, può indurre in modo affidabile ed efficace la CNV come sistema modello per testare varie misure sperimentali.

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

Qui dimostriamo un nuovo approccio all'utilizzo di tomografia a coerenza ottica spectral-domain ad alta risoluzione (HR-SD-OCT) per assistere la consegna degli agenti di terapia genica nello spazio subretinal, valutare la sua copertura area e caratterizzano la vitalità del fotoricettore.

Tomografia ottica di coerenza di risoluzione ultraelevata Mouse per aiutare l'iniezione intraoculare nella ricerca retinica terapia genica

Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

La retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR) può essere utilizzata per modellare malattie retiniche ischemiche come la retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica proliferativa e per servire da modello per studi proof-of-concept nella valutazione dei farmaci antiangiogenetici per le malattie neovascolari. OIR induce una neovascolarizzazione robusta e riproducibile nella retina quantificabile.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Qui, descriviamo una tecnica di imaging in vivo che utilizza la tomografia a coerenza ottica per facilitare la diagnosi e la misurazione quantitativa della retinopatia nei topi.

Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia

Qui, presentiamo tre protocolli di analisi dei dati per l'angiografia fluoresceina (FA) e le immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) nello studio dell'occlusione venosa retinica (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Le iniezioni sottoretiniche sono una tecnica indispensabile per lo sviluppo preclinico di terapie per le malattie dei fotorecettori e dell'EPR. Descriviamo una tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale ottimizzata nei topi che migliora le percentuali di successo intraoperatorio e riduce al minimo il danno retinico.

Tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale minimamente invasiva ottimizzata nel topo

Impara un protocollo ottimizzato di occlusione venosa retinica nel topo usando rosa bengala e laser per studiare lesioni vascolari ed edema in tempo reale senza intervento chirurgico.

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

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