Name: Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Impara metodi spettrofotometrici per studiare il metabolismo del glicogeno eucariotico senza isotopi radioattivi. Queste tecniche economiche e accessibili misurano l'attività enzimatica con sicurezza.

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L'autore desidera ringraziare Karoline Dittmer e Andrew Brittingham per le loro intuizioni e molte utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 e 03-20-04).

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse noti associati a questo lavoro e non c'è stato alcun sostegno finanziario per questo lavoro che avrebbe potuto influenzarne l'esito.

In generale, i principali vantaggi di tutti i metodi presentati sono il loro basso costo, la facilità, la velocità e la mancanza di dipendenza da attrezzature specializzate. Il principale svantaggio che tutti condividono è la sensibilità rispetto ad altri metodi disponibili. La sensibilità delle procedure che comportano la produzione o il consumo di NADH / NADPH è facile da stimare. Dato che il coefficiente di estinzione di NADH / NADPH è 6,22 M-1 cm-1, l'aritmetica semplice indica che ~ 10-20 μM i cambiamenti...

Il glicogeno è ampiamente distribuito in natura, con il composto che si trova in batteri, molti protisti, funghi e animali. Nei microrganismi, il glicogeno è importante per la sopravvivenza cellulare quando i nutrienti sono limitanti e, negli organismi superiori come i mammiferi, la sintesi e la degradazione del glicogeno servono a tamponare i livelli di glucosio nel sangue 1,2,3. Lo studio del metabolismo del glicogeno è, quindi, importante per campi così diversi come la microbiologia e la fisiologia dei mammiferi. Comprendere il metabolismo del glicogeno richiede lo studio degli enzimi chiave della sintesi del glicogeno (glicogeno sintasi e dell'enzima ramificato) e della degradazione del glicogeno (glicogeno fosforilasi ed enzima deramificante). I saggi gold standard della glicogeno sintasi, della fosforilasi, della ramificazione e delle attività enzimatiche di deramificazione impiegano isotopi radioattivi. Ad esempio, la glicogeno sintasi viene generalmente misurata in un saggio radiochimico interrotto seguendo l'incorporazione di glucosio da UDP-[14 C]glucosio (nel caso di enzimi animali e fungini) o ADP-[14C]glucosio (nel caso di enzimi batterici) nel glicogeno 4,5. Analogamente, la glicogeno fosforilasi viene misurata nella direzione della sintesi del glicogeno, in seguito all'incorporazione del glucosio dal [14C]glucosio-1-fosfato nel glicogeno6. L'enzima ramificante viene analizzato misurando la capacità di questo enzima di stimolare l'incorporazione di [14 C]glucosio dal glucosio-1-fosfato in catene legate all'α1,4 mediante glicogeno fosforilasi7, e l'attività dell'enzima deramificante è determinata seguendo la capacità dell'enzima di incorporare [14C]glucosio nel glicogeno8 . Sebbene molto sensibili, consentendo il loro uso in estratti cellulari grezzi con bassi livelli di attività enzimatica, i substrati radioattivi sono costosi e soggetti ai requisiti normativi relativi all'uso di radioisotopi. Queste barriere pongono l'uso di determinati saggi fuori dalla portata di molti lavoratori. Tuttavia, nel corso di molti anni, è stata descritta un'impressionante varietà di approcci spettrofotometrici alla misurazione di questi enzimi. In generale, questi approcci si basano in ultima analisi sulla misurazione della produzione o del consumo di NADH / NADPH o sulla generazione di complessi colorati tra glicogeno e iodio. Pertanto, sono semplici e possono essere eseguiti utilizzando semplici spettrofotometri dotati solo di lampade flash al tungsteno o allo xeno.
I saggi spettrofotometrici della glicogeno sintasi si basano sulla misurazione del difosfato nucleosidico rilasciato dal donatore di nucleotidi di zucchero quando il glucosio viene aggiunto alla catena di glicogeno in crescita 9,10. La procedura per misurare l'attività della glicogeno sintasi descritta nella sezione 1 del protocollo, di seguito, è una modifica di quella delineata da Wayllace et al.11, e lo schema di accoppiamento è mostrato di seguito:
(Glucosio) n + UPD-glucosio → (glucosio)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP
piruvato + NADH + H + → lattato + NAD +
La glicogeno sintasi aggiunge glucosio da UDP-glucosio al glicogeno. L'UDP generato in questo processo viene convertito in UTP dalla nucleoside difosfato chinasi (NDP chinasi), in una reazione che genera ADP. L'ADP, a sua volta, funge quindi da substrato per la piruvato chinasi, che fosforila l'ADP usando il fosfoenolpiruvato come donatore di fosfato. Il piruvato risultante viene convertito in lattato dall'enzima lattato deidrogenasi in una reazione che consuma NADH. Il test può, quindi, essere eseguito in modo continuo, monitorando la diminuzione dell'assorbanza a 340 nm man mano che il NADH viene consumato. È facilmente adattato per l'uso con enzimi che richiedono ADP-glucosio come donatore di glucosio. Qui, le fasi di accoppiamento sono più semplici poiché l'ADP rilasciato dall'azione della glicogeno sintasi è direttamente agito dalla piruvato chinasi.
Sono disponibili diversi saggi spettrofotometrici per la determinazione dell'attività della glicogeno fosforilasi. Nella versione classica, l'enzima viene spinto all'indietro, nella direzione della sintesi del glicogeno, come mostrato di seguito:
(Glucosio) n + Glucosio-1-fosfato → (Glucosio)n+1 + Pi
Ad intervalli di tempo, vengono rimosse le aliquote della miscela di reazione e la quantità di fosfato liberata viene quantificata12,13. Nelle nostre mani, questo test è stato di uso limitato a causa della presenza di fosfato libero facilmente misurabile in molti preparati commerciali di glucosio-1-fosfato, combinato con le alte concentrazioni di glucosio-1-fosfato necessarie per l'azione della fosforilasi. Piuttosto, abbiamo regolarmente impiegato un test alternativo che misura il glucosio-1-fosfato rilasciato quando il glicogeno viene degradato dalla fosforilasi13. Viene utilizzato uno schema di reazione accoppiata, illustrato di seguito.
(Glucosio) n + Pi → (Glucosio)n-1 + Glucosio-1-fosfato
Glucosio-1-fosfato → Glucosio-6-fosfato
Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H +
Il glucosio-1-fosfato viene convertito in glucosio-6-fosfato dalla fosfoglucomutasi, e il glucosio-6-fosfato viene quindi ossidato a 6-fosfogluconolattone, con la concomitante riduzione di NADP+ a NADPH. La procedura descritta nella sezione 2 del protocollo, di seguito, deriva dai metodi descritti da Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling 15. Il saggio può essere facilmente eseguito in modo continuo, con l'aumento dell'assorbanza a 340 nm nel tempo, consentendo la determinazione della velocità di reazione.
La determinazione spettrofotometrica dell'attività enzimatica deramificante si basa sulla misurazione del glucosio rilasciato dall'azione dell'enzima sulla fosforilasi limitedi destrina 16. Questo composto è fatto trattando il glicogeno in modo esaustivo con glicogeno fosforilasi. Poiché l'azione della glicogeno fosforilasi blocca 4 residui di glucosio da un punto di diramazione α1,6, la destrina limite contiene glicogeno, le cui catene esterne sono state ridotte a ~ 4 residui di glucosio. La preparazione della destrina limite della fosforilasi è descritta qui, utilizzando una procedura derivata da quelle sviluppate da Taylor et al.17 e Makino & Omichi 18.
La deramificazione è un processo in due fasi. L'attività della 4-α-glucanotransferasi dell'enzima deramificante bifunzionale trasferisce prima tre residui di glucosio dal punto di ramificazione all'estremità non riducente di una vicina catena di glucosio legata all'α1,4. Il singolo residuo di glucosio legato all'α1,6 che rimane nel punto di diramazione viene quindi idrolizzato dall'attività dell'α1,6-glucosidasi19. Il test viene tipicamente eseguito in modo interrotto, il glucosio rilasciato dopo un dato tempo (o serie di volte) viene misurato in un saggio enzimatico accoppiato come mostrato di seguito:
(Glucosio) n → (Glucosio)n-1 + Glucosio 
Glucosio + ATP → Glucosio-6-fosfato + ADP
Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H +
La determinazione del NADPH prodotto fornisce una misura della produzione di glucosio. La procedura descritta nella sezione 3 del protocollo, di seguito, si basa su quella descritta da Nelson et al.16. Come gli altri metodi che si basano sul consumo o sulla generazione di NADH / NADPH, il test è abbastanza sensibile. Tuttavia, la presenza di amilasi o altre glucosidasi, che possono anche liberare glucosio libero dalla destrina limite della fosforilasi, causerà interferenze significative (vedi Discussione).
La determinazione colorimetrica dell'attività enzimatica ramificata si basa sul fatto che le catene α1,4-legate di glucosio adottano strutture elicoidali che si legano allo iodio, formando complessi colorati20. Il colore del complesso formato dipende dalla lunghezza delle catene α1,4-legate. Pertanto, l'amilosio, che consiste in lunghe catene in gran parte non ramificate di glucosio legato all'α1,4, forma un complesso blu profondo con iodio. Al contrario, i glicogeni, le cui catene esterne sono generalmente nell'ordine di soli 6-8 residui di glucosio, formano complessi rosso-arancio. Se una soluzione di amilosio viene incubata con enzima ramificato, l'introduzione di rami nell'amilosio provoca la generazione di catene di glucosio più corte legate all'α1,4. Pertanto, il massimo assorbimento dei complessi amilosio/iodio si sposta verso lunghezze d'onda più corte. La procedura qui discussa è derivata da quella dettagliata da Boyer & Preiss21 e l'attività enzimatica ramificata è quantificata come una riduzione dell'assorbimento del complesso amilosio/iodio a 660 nm nel tempo.
Come dovrebbe essere facilmente evidente dalla discussione precedente, il fatto che i colori dei complessi formati tra le catene di iodio e α1,4-glucosio varino con la lunghezza della catena significa che gli spettri di assorbanza dei complessi glicogeno/iodio dovrebbero variare con il grado di ramificazione del glicogeno. Questo è effettivamente il caso, e glicogeni / glicogeni meno ramificati con catene esterne più lunghe assorbono la luce a una lunghezza d'onda più lunga rispetto ai glicogeni che sono più ramificati / hanno catene esterne più corte. La reazione di colorazione dello iodio può quindi essere utilizzata per ottenere dati rapidi e qualitativi sul grado di ramificazione del glicogeno22. Il colore arancione-marrone si forma quando i complessi di glicogeno con iodio non sono particolarmente intensi. Tuttavia, lo sviluppo del colore può essere migliorato dall'inclusione della soluzione satura di cloruro di calcio22. Ciò aumenta la sensibilità del metodo di circa 10 volte e consente un'analisi pronta delle quantità di microgrammi di glicogeno. Il saggio per la determinazione della ramificazione descritto nella sezione 4 del protocollo, di seguito, è adattato da una procedura sviluppata da Krisman22. Viene condotto semplicemente combinando il campione di glicogeno con soluzione di iodio e cloruro di calcio in una cuvetta e raccogliendo lo spettro di assorbimento da 330 nm a 800 nm. Il massimo di assorbanza si sposta verso lunghezze d'onda più lunghe man mano che il grado di ramificazione diminuisce.
Collettivamente, i metodi qui descritti forniscono mezzi semplici e affidabili per valutare le attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno e per ottenere dati qualitativi sull'entità della ramificazione del glicogeno.

<table><tbody><tr><td>Amilopectina (senza amilosio) da mais ceroso</td><td>Fisher Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>Amilosio</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP, sale disodico</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio-1,6-bisfosfato, sale di potassio</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio-6-fosfato, sale sodico</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, Grado I, da lievito</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno, Tipo II da ostrica</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Esochinasi</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette in metacrilato, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>Metacrilato è richiesto poiché alcune procedure sono condotto a 340 nm o inferiore</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamide adenina dinucleotide fosfato sale sodico</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoside 5'-difosfato chinasi</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato, sale</td> <td>monopotassicoMilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoglucomutasi dal muscolo di coniglio</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Fosforilasi A dal muscolo di coniglio</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato chinasi/Enzimi lattico deidrogenasi dal muscolo di coniglio</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glucosio, sale disodico</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Il glicogeno è sintetizzato come una forma di stoccaggio del glucosio da una vasta gamma di organismi, che vanno dai batteri agli animali. La molecola comprende catene lineari di residui di glucosio legati all'α1,4 con rami introdotti attraverso l'aggiunta di legami α1,6. Comprendere come la sintesi e la degradazione del glicogeno sono regolate e come il glicogeno raggiunge la sua caratteristica struttura ramificata richiede lo studio degli enzimi di stoccaggio del glicogeno. Tuttavia, i metodi più comunemente usati per studiare queste attività enzimatiche impiegano tipicamente reagenti o tecniche che non sono disponibili per tutti i ricercatori. Qui, discutiamo una batteria di procedure che sono tecnicamente semplici, economiche e tuttavia in grado di fornire preziose informazioni sul controllo dello stoccaggio del glicogeno. Le tecniche richiedono l'accesso a uno spettrofotometro, operante nell'intervallo da 330 a 800 nm, e sono descritte supponendo che gli utenti utilizzeranno cuvette di plastica usa e getta. Tuttavia, le procedure sono facilmente scalabili e possono essere modificate per l'uso in un lettore di micropiastre, consentendo analisi altamente parallele.

Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi La figura 1 mostra risultati rappresentativi dei saggi della glicogeno sintasi utilizzando enzimi purificati. Nel pannello A, a seguito di un leggero ritardo, si è verificata una diminuzione lineare dell'assorbimento a 340 nm nel tempo per un periodo di circa 12 minuti. Il tasso di variazione dell'assorbimento nella Figura 1A era ~0,12 unità di assorbanza/min. Un tasso di variazione dell'as...

Vengono presentate le tecniche per misurare l'attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno, utilizzando un semplice spettrofotometro operante nell'intervallo visibile.

Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

I protocolli sono significativi, perché evitano l'uso di isotopi radioattivi e rimuovono una barriera che può impedire a molti lavoratori di studiare gli enzimi del metabolismo del glicogeno. Le procedure descritte sono poco costose e richiedono solo l'accesso a un semplice spettrofotometro. Per iniziare con la determinazione dell'attività della glicogeno sintasi, scongelare le soluzioni stock precedentemente preparate di glucosio UDP, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi su ghiaccio.Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Quando le soluzioni madre sono pronte, preparare una miscela di dosaggio sufficiente in base al numero di saggi della glicogeno sintasi aggiungendo i reagenti a una provetta da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una reazione in bianco sostituendo il NADH dalla miscela di reazione con l'acqua e trasferire la reazione in una cuvetta di metacrilato usa e getta.Utilizzare la reazione del bianco per impostare lo zero sullo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 340 nanometri. Prendere un'aliquota da 770 microlitri della miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere sequenzialmente due microlitri ciascuno di N

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Questo video descrive un test spettrofotometrico per la stima dell'attività della glicogeno sintasi. Il metodo si basa sulla riduzione dell'assorbanza del NADH con il tempo e indica l'attività della glicogeno sintasi.

Saggio spettrofotometrico per determinare l'attività della glicogeno sintasi

In questo video, descriviamo un saggio spettrofotometrico qualitativo per determinare l'entità della ramificazione in un campione di glicogeno con una struttura non caratterizzata. Il confronto dei massimi di assorbanza del campione non caratterizzato con quello dei polisaccaridi con strutture ramificate note indica la presenza di ramificazioni nel campione non caratterizzato.

Saggio di ramificazione del glicogeno per misurare il grado di ramificazione del glicogeno

Descriviamo qui un metodo biochimico accurato, riproducibile e conveniente per la titolazione del glicogeno in vitro. Questa tecnica utilizza il kit di analisi Abcam glicogeno e si basa sulla successiva idrolisi del glicogeno in glucosio e titolazione mediante fluorescenza.

Titolazione biochimica di glicogeno<em&gt; In vitro</em

La colorazione periodica con acido di Schiff è una tecnica che visualizza il contenuto di polisaccaridi dei tessuti. Questo articolo dimostra il protocollo periodico di colorazione acida di Schiff adattato per l'uso su cellule mononucleate del sangue periferico purificate da sangue venoso umano. Tali campioni sono arricchiti per i linfociti e altri globuli bianchi del sistema immunitario.

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Qui presentiamo un test affidabile e facile per misurare il contenuto di glicogeno nelle cellule cianobatteriche. La procedura prevede precipitazione, depolimerizzazione selezionabile e rilevazione di residui di glucosio. Questo metodo è adatto sia per ceppi selvatici che geneticamente modificati e può facilitare l'ingegnerizzazione metabolica dei cianobatteri.

Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l'estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.

L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno

Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l'imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.

Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

Il test sui tessuti animali utilizza la rilevazione a scintillazione nucleare per determinare l'attività enzimatica della glicogeno sintasi misurando l'incorporazione del glucosio radiomarcato nel glicogeno.

Valutazione radiochimica dell'attività dell'enzima glicogeno sintasi nei tessuti animali

Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Impara metodi spettrofotometrici per studiare il metabolismo del glicogeno eucariotico senza isotopi radioattivi. Queste tecniche economiche e accessibili misurano l'attività enzimatica con sicurezza.

Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

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