Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

I protocolli sono significativi, perché evitano l'uso di isotopi radioattivi e rimuovono una barriera che può impedire a molti lavoratori di studiare gli enzimi del metabolismo del glicogeno. Le procedure descritte sono poco costose e richiedono solo l'accesso a un semplice spettrofotometro. Per iniziare con la determinazione dell'attività della glicogeno sintasi, scongelare le soluzioni stock precedentemente preparate di glucosio UDP, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi su ghiaccio.

Preriscaldare un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Quando le soluzioni madre sono pronte, preparare una miscela di dosaggio sufficiente in base al numero di saggi della glicogeno sintasi aggiungendo i reagenti a una provetta da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo. Preparare una reazione in bianco sostituendo il NADH dalla miscela di reazione con l'acqua e trasferire la reazione in una cuvetta di metacrilato usa e getta.

Utilizzare la reazione del bianco per impostare lo zero sullo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 340 nanometri. Prendere un'aliquota da 770 microlitri della miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere sequenzialmente due microlitri ciascuno di NDP chinasi e piruvato chinasi lattato deidrogenasi miscela al tubo. Dopo la miscelazione, incubare delicatamente il tubo a 30 gradi Celsius nel bagno d'acqua per tre minuti per preriscaldare la miscela di reazione.

Quindi aggiungere 30 microlitri del campione contenente glicogeno sintasi in tampone Tris da 20 millimolari a pH 7,8 e mescolare delicatamente prima di trasferire la miscela di reazione in una cuvetta di metacrilato di smaltimento. Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro e registrare l'assorbanza a 340 nanometri a intervalli di tempo per 10-20 minuti. Quindi, tracciare le assorbanze ottenute contro il tempo.

Per misurare il glucosio rilasciato, trasferire 40 microlitri di surnatante dai campioni di glicogeno riscaldati alle cuvette di metacrilato usa e getta. E aggiungere i volumi misurati di trietanolammina, tampone cloridrato di solfato di magnesio, miscela di ATP NADP e acqua come descritto nel manoscritto. Mescolare la miscela pipettando su e giù delicatamente senza creare bolle d'aria.

Aggiungere 0,5 microlitri di glucosio-6-fosfato deidrogenasi a ciascuna cuvetta. Dopo la miscelazione mediante pipettaggio, incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi registrare l'assorbanza a 340 nanometri. Quindi, mescolare 0,5 microlitri di esochinasi su ciascuna cuvetta come descritto in precedenza e incubare per 15 minuti prima di registrare il set assorbente 340 nanometri.

Quindi continuare l'incubazione a temperatura ambiente per cinque minuti, seguita dalla registrazione dell'assorbanza. Se l'assorbimento è aumentato da quello registrato a 15 minuti, continuare l'incubazione per cinque minuti prima di registrare l'assorbimento finale a 340 nanometri. Per determinare la ramificazione del glicogeno, combinare 650 microlitri di reagente colorante di cloruro di calcio iodio con 100 microlitri di acqua in un tubo da 1,5 millilitri e mescolare accuratamente la soluzione prima di trasferirla in una cuvetta di metacrilato usa e getta.

Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro per condurre una corsa in modalità di scansione della lunghezza d'onda per raccogliere lo spettro di fondo da 330 a 800 nanometri. In un tubo separato da 1,5 millilitri unire 650 microlitri del reagente colorante cloruro di calcio iodio funzionante con 50 microgrammi di glicogeno ostrica e portare il volume finale a 750 microlitri con acqua. Dopo aver miscelato accuratamente la miscela, trasferire la soluzione in una cuvetta di metacrilato usa e getta per raccogliere uno spettro di assorbimento da 330 a 800 nanometri.

Allo stesso modo, ottenere uno spettro di assorbimento con 50 microgrammi di amilopectina e 30 microgrammi di amilosio come descritto in precedenza. Per ottenere un'indicazione della struttura ramificata di un campione di glicogeno non caratterizzato, combinare da 25 a 50 microgrammi di glicogeno con 650 microlitri del reagente colorante di cloruro di calcio iodio funzionante e procedere come spiegato in precedenza per acquisire lo spettro di assorbimento. Nei saggi della glicogeno sintasi è stata osservata una diminuzione lineare dell'assorbimento a 340 nanometri nel tempo.

L'aggiunta di troppa glicogeno sintasi al test ha fatto sì che la reazione raggiungesse il completamento entro i primi due minuti. La reazione di controllo, che non conteneva glicogeno sintasi, non mostra alcuna diminuzione misurabile dell'assorbanza. I dati di un test di glicogeno fosforilasi utilizzando un enzima purificato avevano una fase lineare della durata di tre minuti.

Un tasso di aumento dell'assorbanza di circa 0,01-0,04 unità al minuto è ottimale. Nel saggio dell'enzima di deramificazione del glicogeno, la reazione ha mostrato una fase lineare persistente per almeno 10 minuti. I dati rappresentativi dei saggi dell'enzima ramificante del glicogeno hanno mostrato la differenza nell'assorbanza tra i campioni di controllo che mancavano dell'enzima ramificato e le reazioni che contenevano l'enzima ramificato.

Viene illustrata la gamma dinamica ristretta del test. La variazione massima nell'assorbanza che può essere prodotta è di 0,4 unità di assorbanza e la linearità viene persa quando la variazione dell'assorbimento è di circa 0,2 unità di assorbanza. Le masse di glicogeno, amilopectina e amilosio utilizzate nella valutazione della ramificazione del glicogeno hanno mostrato una lettura massima di assorbanza di circa 0,7-0,8, ciascuna a diversi massimi di assorbanza.

Il campione di glicogeno ha prodotto due picchi a circa 400 nanometri e 460 nanometri. Il reagente colorante del cloruro di calcio iodio è molto denso. È importante assicurarsi che i campioni di glicogeno siano completamente miscelati con il reagente prima di raccogliere uno spettro di assorbimento.