Name: Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Impara a determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri con un saggio enzimatico semplice e sensibile. Questo metodo supporta la ricerca in biochimica, microbiologia e ingegneria metabolica.

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Gli autori riconoscono la ricerca nordica dell&#39;energia (AquaFEED, progetto n ° 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, progetto n ° 12-131844) e Villum Fonden (progetto n ° 13363)

1. Preparazione <ol><li> Culture cianobatteriche <ol><li> Crescere Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C in mezzo liquido BG11 8 , con un&#39;alimentazione costante di aria integrata con 1% (v / v) CO 2 . Illuminare le culture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 50 μmol fotone / m 2 / s. </li><li> Crescere Synechococcus sp. PCC 7002 in liquido A + medium 23 (può anche essere utilizzato il medium BG11), con un&#39;alimentazione costante di aria integrata con CO 2 di 1% (v / v). La temperatura dovrebbe essere di 37 ° C. Illuminare le colture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 150 μmol fotone / m 2 / s. </li><li> Misurare la densità ottica (OD) della coltura a 730 nm usando una cuvetta con un percorso leggero di 1 cm. Se il valore OD è superiore a 0,8, fare le diluizioni appropriate per ottenere misure OD che sono proporzionali a thE. NOTA: I protocolli presentati di seguito sono idonei per colture a liquido, con una densità di cella corrispondente ad un valore OD 730nm di 2 o superiore. Quando si desiderano colture nella fase di crescita esponenziale, che in genere hanno un valore OD 730nm inferiore a 1, concentrano la densità cellulare mediante centrifugazione e resuspensione in un tampone o mezzo per ottenere un valore di OD 730nm di 2 o superiore. </li></ol></li><li> Tamponi e reagenti <ol><li> Realizzare 50 mM di Tris-HCl tampone a pH 8. </li><li> Realizzare un tampone di acetato di sodio 50 mM a pH 5. </li><li> Preparare una soluzione di base di 8 U / mL di amiloglucosidasi in 50 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5. </li><li> Preparare una soluzione di stock di 2 U / mL α-amilasi in 50 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5. </li><li> Utilizzando acqua distillata, soluzioni standard macroclucose a concentrazioni che vanno da 0 a 100 μg / ml. </li><li> Preparare il reagente GOD-POD dal kit di analisi D-glucosio (formato GODPOD), fSeguendo l&#39;istruzione del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Determinazione del peso a secco della cellula (opzionale) <ol><li> Trasferire 2 mL di una coltura o una risospensione cellulare (vedere la fase 1.1) in un tubo da 2,0 mL e centrifugare a 6,000 xg e 4 ° C per 5 minuti. Scartare il surnatante. </li><li> Resispendere il pellet in 1 ml di acqua e centrifugare a 6000 xg e 4 ° C per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di acqua. </li><li> Trasferire la sospensione in un vassoio di alluminio pre-pesato. Trasferire il vassoio ad un forno a secco a 105 ° C per un essiccamento notturno (circa 18 h). CRITICI: È importante che il vassoio venga trattato con pinze per evitare il trasferimento di materiale dalle dita. Asciugare un vassoio in alluminio vuoto pre-pesato sotto le stesse condizioni per determinare qualsiasi perdita di peso dai vassoi durante l&#39;essiccazione. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione, rimuovere il vassoio dal forno e lasciarlo equilibrare a conditi ambientaliOns per 5 minuti prima di pesarlo con una precisione di 0,0001 g. NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogeno su base cellulare a secco. </li></ol> 3. Lisi delle cellule cianobatteriche <ol><li> Trasferire 1 mL di una coltura o una resuspensione cellulare (vedere la fase 1.1) in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 6,000 xg e 4 ° C per 10 minuti. Scartare il surnatante. </li><li> Resuspendere il pellet in 1 ml di 50 mM Tris-HCl, pH 8 e centrifugare a 6000 xg e 4 ° C per 10 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone Tris-HCl. Ripetere il processo. </li><li> Riposizionare completamente il pellet in 500 μl di 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8. CRITICI: Resuspendere il pozzetto di pellet per una lisi di cellule efficiente. Tenere la resuspensione in ghiaccio. </li><li> Lyse le cellule resuscitate a 4 ° C eseguendo 30 cicli di ultrasonografia, ogni ciclo composto da 30 s ad una frequenza di 20 kHz con l&#39;ampiezza massima,Seguito da 90 s senza. NOTA: Questo metodo può efficacemente lire Synechococcus sp. PCC 7002. <ol><li> In alternativa, trasferire la resuspensione delle cellule in un tubo a vite e aggiungere branelli di ossido di zirconio al tubo, seguendo le istruzioni del produttore. Impostare il tubo in un omogeneizzatore tissutale e liscivare le cellule a 4 ° C eseguendo 2 cicli di battitura, ciascun ciclo consistente di 5 minuti alla regolazione di frequenza di 5. NOTA: Questo metodo può efficacemente lire Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li> Centrifugare il tubo contenente il lisato per 10 min a 6.000 xg e 4 ° C. NOTA: Il pellet dovrebbe consistere principalmente in grandi detriti di celle. Se c&#39;è un numero significativo di cellule ininterrotte, ripetere il passo 3.4. Tenere il surnatante sul ghiaccio. </li><li> Determinare la concentrazione proteica usando un kit di analisi della proteina BCA commerciale. NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogenoSu base di proteine. </li></ol> 4. Precipitazione di glicogeno <ol><li> Togliere la clorofilla a dal lisato cellulare mescolando 900 μl di etanolo al 96% (v / v) e 100 μL del supernatante dal punto 3.5 in un tubo a vite a 1,5 ml. Dopo aver chiuso il coperchio, riscaldare il tubo a 90 ° C per 10 minuti usando un blocco di riscaldamento standard di laboratorio. </li><li> Incubare il tubo sul ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare il tubo a 20.000 xg e 4 ° C per 30 minuti e rimuovere attentamente il surnatante; Il pellet contiene glicogeno. Asciugare leggermente il pellet in aria per rimuovere l&#39;etanolo in eccesso. CRITICA: Si deve evitare l&#39;essiccazione eccessiva del pellet, altrimenti diventa difficile da solubilizzare nel punto 5.1. </li><li> OPTIONAL: Misurare l&#39;assorbanza del surnatante ottenuto nello stadio 4.3 a 664 nm per determinare la clorofilla un contenuto. Usare un coefficiente di assorbimento di 84,6 L / g / cm 24 . NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzareE il contenuto di glicogeno. </li></ol> 5. Idrolisi enzimatica e determinazione dei glicogeni <ol><li> Solubilizzare il pellet ottenuto nel punto 4.3 in 100 μL di 50 mM acetato di sodio, pH 5, e aggiungere 50 μL di 8 U / ml amiloglucosidasi e 50 μL di 2 U / ml α-amilasi. Mescolare bene questi materiali usando un vortice. NOTA: La miscelazione mediante pipetta non è raccomandata perché il pellet glicogeno è viscoso. </li><li> Incubare la miscela a 60 ° C su un blocco di riscaldamento per 2 ore per consentire la digestione del glicogeno in molecole di glucosio. </li><li> Centrifugare il campione a 10.000 xg per 5 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 mL. </li></ol> 6. Determinazione del contenuto totale di glucosio utilizzando il reagente GOD-POD <ol><li> Misurare la concentrazione di glucosio nel supernatante ottenuto nel punto 5.3 utilizzando il reagente GOD-POD. Trasferire 100 μl del supernatante dalla fase 5.3 in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Come controllo negativo,Utilizzare 100 μL di 50 mM acetato di sodio, pH 5. Per generare una curva di calibrazione, misurare anche le soluzioni standard di glucosio. </li><li> Aggiungere 150 μl di reagente GOD-POD a ciascun campione e mescolare rapidamente pipettando. </li><li> Incubare la lastra staticamente a 25 ° C per 30 min. Registrare il valore di assorbanza a 510 nm utilizzando un lettore di piastre. </li><li> Calcolare la concentrazione del glucosio utilizzando una curva di calibrazione ottenuta dagli standard di glucosio. NOTA: La concentrazione di glicogeno nel lisato cellulare è espressa come concentrazione del glucosio (μg / mL). </li></ol>

<ol><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li>
<li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717602902260">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li>
<li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li>
<li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li>
<li>Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64(2014).</li>
<li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://aem.asm.org/content/82/14/4180.long">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li>
<li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Non-coding+RNA+Ncr0700%2FPmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li>
<li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li>
<li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60111a017">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+group+2+%7Bsigma%7D+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li>
<li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Letters%22%5BJournal%5D)">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li>
<li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/242624484_Activation_and_pathway_of_glucosylglycerol_synthesis_in_the_cyanobacterium_Synechocystis_sp_PCC_6803">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li>
<li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004(2015).</li>
<li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li>
<li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li>
<li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+antagonistic+effects+of+%CE%B1-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li>
<li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li>
<li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+%28H2O2%29+scavenging+activity+of+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria%3A+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth+Res%22%5BJournal%5D)">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687987480361">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li>
<li>López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li>
<li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li>
<li>Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%3A+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li>
<li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA%2C+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li>
<li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I punti critici all&#39;interno del protocollo sono la precipitazione e la risospensione del glicogeno. Dopo la centrifugazione dopo la precipitazione dell&#39;etanolo, il glicogeno forma un pallone traslucido che aderisce sciattamente alle pareti dei tubi di microcentrifuga. Pertanto, quando si rimuove il surnatante, è necessario prestare particolare attenzione per non rimuovere il pellet. Il pellet di glicogeno è appiccicoso e la solubilizzazione può essere difficile se si asciuga. Si noti che la solubilizzazione comp...

I cianobatteri accumulano glicogeno come il principale deposito di carboidrati del carbonio da CO 2 fissato alla luce attraverso la fotosintesi. Il glicogeno è un glicano costituito da glucano lineare α-1,4 collegato con rami creati da legami glucosilici legati al α-1,6. La biosintesi dei glicogeni nei cianobatteri inizia con la conversione di glucosio-6-fosfato in glucosio ADP attraverso l&#39;azione sequenziale di fosfoglucomutasi e di pirosfosforilasi di glucosio ADP. La parte del glucosio in glucosio ADP viene trasferita all&#39;estremità non riducente del globulo di α-1,4-glucano del glicogeno mediante una o più sintasi glicogene (GlgA). Successivamente, un enzimi ramificanti introducono il legame glucosilico legato al α-1,6, che viene ulteriormente esteso per generare la particella del glicogeno. Nel buio, il glicogeno viene suddiviso in glicogeno fosforilasi, enzimi di gengogeno debrange, α-glucanotransferasi e fosforilasi di malto-dextrina in glucosio fosforilato e glucosio libero. Questi feed intPercorsi catabolici, compreso il percorso ossidativo del fosfato pentoso, il percorso Embden-Meyerhof-Parnas (glicolisi) e il percorso Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . Il metabolismo dei glicogeni nei cianobatteri ha riscosso un crescente interesse negli ultimi anni a causa del potenziale per i cianobatteri a svilupparsi in fabbriche di cellule microbiche azionate dalla luce solare per produrre sostanze chimiche e combustibili. Il metabolismo del glicogeno potrebbe essere modificato per aumentare la resa dei prodotti, perché il glicogeno è la più grande raccolta di carbonio flessibile in questi batteri. Un esempio è il cianobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, che è stato progettato geneticamente per produrre mannitolo; La rottura genetica della sintesi del glicogeno aumenta la resa del mannitolo 3 volte 5 . Un altro esempio è la produzione di bioetanolo da glicogeno-caricato wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Il contenuto di glicogeno delle cellule di tipo selvatico può essere fino al 60% del peso secco della cellula durante la fame di azoto 6 . La nostra comprensione del metabolismo e della regolazione del glicogeno si è ulteriormente ampliata negli ultimi anni. Mentre il glicogeno è noto per accumulare alla luce e per essere catabolizzato nella buia, la cinetica dettagliata del metabolismo del glicogeno durante il ciclo di diel è stata solo recentemente rivelata in Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Inoltre, sono stati identificati diversi geni che influenzano l&#39;accumulo di glicogeno. Un esempio notevole è la scoperta che l&#39;istidina kinasi PmgA e l&#39;RNA non codificante PmgR1 formano una cascata regolatrice e controllano l&#39;accumulo di glicogeno. È interessante notare che i mutanti di delezione pmgA e pmgR1 accumulano due volte il maggior numero di glicogeni come il ceppo selvatico di Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Altri elementi regolatori sono noti anche per influenzare l&#39;accumulo di glicogeno, compreso il fattore sigma alternativo E e il fattore trascrizionale CyAbrB2 10 , 11 . Poiché l&#39;interesse per la regolazione del glicogeno e il metabolismo cresce, è garantito un protocollo dettagliato che descrive la determinazione del contenuto di glicogeno. Diversi metodi sono usati nella letteratura. L&#39;idrolisi acida seguita dalla determinazione del contenuto di monosaccharide mediante cromatografia liquida a scambio ad anione ad alta pressione accoppiata con un rilevatore amperometrico a pulsazione o una determinazione spettrometrica dopo trattamenti con acido e fenolo sono ampiamente utilizzati per approssimare il contenuto di glicogeno 9 , 10 , 12 , 13 . Tuttavia, un cromatografo liquido di scambio anionico ad alta pressioneC è molto costoso e non discrimina il glucosio derivato dal glicogeno da quello derivato da altri glicoconjugati contenenti glucosio, come la saccarosio 14 , il glucosilglicerolo 15 e la cellulosa 16 , 17 , 18 , notoriamente accumulati in alcune specie di cianobatteri. Il metodo acido-fenolo può essere eseguito utilizzando attrezzature standard di laboratorio. Tuttavia, utilizza reagenti altamente tossici e non distingue il glucosio derivato da diversi glicoconjugati, né distingue il glucosio da altri monosaccharidi che costituiscono materiali cellulari, come i glicolipidi, i liposolucaridi e le matrici extracellulari 12 . In particolare, il saggio acido-fenolo caldo viene spesso utilizzato per la determinazione del contenuto totale di carboidrati anziché per la determinazione specifica del tenore di glucosio 12 . Ili enzimaticiLa drolicosi del glicogeno al glucosio da parte di α-amiloglucosidasi seguita dalla rilevazione del glucosio attraverso un dosaggio accoppiato enzima genera una lettura colorimetrica altamente sensibile e specifica al glucosio derivato dal glicogeno. La specificità può essere ulteriormente migliorata con la precipitazione preferenziale di glicogeno da cellule lisati mediante etanolo 5 , 8 , 19 . Qui descriviamo un protocollo dettagliato per un dosaggio enzimatico del contenuto di glicogeno in due delle specie cianobatteriche più diffuse, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nelle specie selvatiche e mutanti. Al fine di garantire un&#39;idrolisi efficiente, viene utilizzato un cocktail di α-amilasi e α-amiloglucosidasi 8 . L&#39;α-amilasi ad azione endo idrolizza i legami α-1,4 in vari glucani in dextrine, che vengono ulteriormente idrolizzatiO glucosio mediante eso-azione α-amyloglucosidase 20 . Gli effetti sinergici di questi enzimi sono ben noti e questi enzimi vengono utilizzati abitualmente per l&#39;idrolisi selettiva dell&#39;amido, che è un glicogeno a glucano associato a α, senza influenzare altri glicoconjuganti, come la cellulosa, nella biomassa vegetale 21 . Il glucosio rilasciato viene rilevato quantitativamente in seguito a un dosaggio enzimatico composto da glucosio ossidasi che catalizza la riduzione dell&#39;ossigeno al perossido di idrogeno e l&#39;ossidazione del glucosio a un lattone e alla perossidasi che produce un colorante quinoneimina rosa colorato di perossido di idrogeno, Un composto fenolico e 4-aminoantipirina 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Lettore di micropiastre&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza lettore di piastre</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Battitore di perline</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro Spettrofotometro UV/Visibile</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Spettrofotometro</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>Adibitore pH</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>amiloglicosidasi (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzima per la depolimerizzazione del glicogeno</td></tr><tr><td>&alfa;-Amilasi, termostabile (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzima per la depolimerizzazione del glicogeno</td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Standard per il test del glucosio Kit per il dosaggio del glucosio</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>Per la determinazione delle concentrazioni proteiche</td></tr><tr><td>Vassoi di essiccazione in alluminio, monouso</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>Per la determinazione dei pesi secchi cellulari Kit</td></tr><tr><td>per il dosaggio del D-glucosio (formato GODPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>Per la determinazione delle concentrazioni di glucosio Pani in</td></tr><tr><td>ossido di zirconio, 0,15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Perle per lisi cellulare in a Provette Bullet Blendar</td></tr><tr><td>Storm RINO</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>per la lisi cellulare in una tempesta Bullet Blendar</td></tr></tbody></table>

determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

I cianobatteri accumulano il glicogeno come un importante deposito intracellulare di carbonio e di energia durante la fotosintesi. I recenti sviluppi della ricerca hanno evidenziato meccanismi complessi di metabolismo del glicogeno, compreso il ciclo di biosintesi e catabolismo, la regolazione redox e il coinvolgimento di RNA non codificante. Allo stesso tempo, si stanno tentando di reindirizzare il carbonio dal glicogeno a prodotti desiderabili in cianobatteri geneticamente modificati per migliorare le rese dei prodotti. Diversi metodi sono usati per determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri, con precisione variabile e complessità tecnica. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la determinazione affidabile del contenuto di glicogeno nei cianobatteri che può essere eseguito in un laboratorio di vita standard. Il protocollo prevede la precipitazione selettiva di glicogeno dal lisato cellulare e la depolimerizzazione enzimatica del glicogeno per generare monomeri di glucosio, rilevati da un gatto di glucosioIdase-perossidasi (GOD-POD). Il metodo è stato applicato a Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, due specie cianobatteriche di modello che sono ampiamente utilizzate nell&#39;ingegneria metabolica. Inoltre, il metodo ha dimostrato con successo le differenze nel contenuto di glicogeni tra il tipo selvatico e mutanti difettosi in elementi regolatori o geni biosintetici al glicogeno.

10 mi di wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 sono state coltivate in condizioni fotoautotrofiche fino a quando il valore OD 730nm ha raggiunto circa 0,8. Le cellule sono state raccolte e risospese in 50 mM Tris-HCl, pH 8. Il valore OD 730nm è stato regolato a 2-3. Il contenuto di glicogeno è stato analizzato seguendo il protocollo sopra descritto. Il contenuto di glicogeno per OD 730nm era di 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730nm ( N = ...

Qui presentiamo un test affidabile e facile per misurare il contenuto di glicogeno nelle cellule cianobatteriche. La procedura prevede precipitazione, depolimerizzazione selezionabile e rilevazione di residui di glucosio. Questo metodo è adatto sia per ceppi selvatici che geneticamente modificati e può facilitare l&#39;ingegnerizzazione metabolica dei cianobatteri.

Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri mediante idrolisi selettiva enzimatica e saggio. Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo dei cianobatteri, come la fisiologia, la genetica molecolare e l'ingegneria biochimica di diverse ceppi di cianobatteri in esame. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è adattata su piccola scala, è facile da eseguire e altamente sensibile e specifica per il glicogeno.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle cianobatterie, può essere applicato anche ad altri microorganismi che accumulano glicogeno o amido, come E. coli, lieviti, microalghe e vari microorganismi eterotrofi e fototrofi. Iniziare questo protocollo preparando colture di cianobatteri come descritto nel protocollo testuale. Trasferire un millilitro di coltura di cianobatteri o sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri.Quindi centrifugare a 6.000 ×g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Eliminare il soprannatante prima di risospendere il pellet in un millilitro di Tris-HCl 50 millimolare, pH 8. Centrifugare il pellet risospeso come in precedenza.Eliminare il soprannatante e risospendere nuovamente il pellet cellulare nel buffer Tris-HCl. Centrifugare i tubi come in precedenza ed eliminare il soprannatante. Quindi risospendere accuratamente il pellet in 500 microlitri di buffer Tris-HCl 50 millimolare a pH 8.È fondamentale mantenere il pellet ben sospeso per una lisi efficiente. Mantenere la risospensione sul ghiaccio. Lisare le cellule risospese a quattro gradi Celsius mediante 30 cicli di ultrasonificazione, ognuno costituito da 30 secondi a una frequenza di 20 kilohertz con ampiezza massima, seguiti da 90 secondi senza trattamento.Centrifugare il tubo contenente il lisato a 6.000 × g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, il pellet dovrebbe contenere principalmente detriti cellulari di grandi dimensioni, mentre il soprannatante viene utilizzato per ulteriori analisi. A questo punto, determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il saggio proteico.Rimuovere la clorofilla a dal lisato cellulare mescolando 900 microlitri di etanolo e 100 microlitri del soprannatante ottenuto in un tubo con tappo a vite da 1,5 millilitro. Dopo aver chiuso il tappo, riscaldare il tubo a 90 gradi Celsius per 10 minuti, utilizzando un blocco riscaldante da laboratorio standard. Successivamente, incubare il tubo sul ghiaccio per 30 minuti.Successivamente, centrifugare il tubo a 20.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione il soprannatante. Il pellet contiene glicogeno.Asciugare leggermente il pellet all'aria per rimuovere l'eccesso di etanolo. Non asciugare eccessivamente il pellet per evitare difficoltà nel discioglierlo. Misurare l'assorbanza a 666 nanometri del soprannatante ottenuto per determinare il contenuto di clorofilla a.Il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogeno. Sciogliere il pellet in 100 microlitri di acetato di sodio 50 millimolari a pH 5. Mescolare accuratamente questi materiali utilizzando un vortex.Non si consiglia di mescolare con la pipetta perché la miscela è viscosa. Aggiungere inoltre 50 microlitri di amiloglucosidasi ad una concentrazione di otto unità per millilitro e 50 microlitri di alfa-amilasi ad una concentrazione di due unità per millilitro. Successivamente, incubare la miscela a 60 gradi Celsius in un blocco riscaldante per due ore per consentire la digestione del glicogeno in molecole di glucosio.Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 20.000 volte g per cinque minuti e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Misurare la concentrazione di glucosio nel soprannatante dopo l'idrolisi enzimatica, utilizzando il reagente GOD-POD. Trasferire 100 microlitri del soprannatante dal passaggio di precipitazione del glicogeno in una pozzetta di una piastra a 96 pozzette.Come controllo negativo, utilizzare 100 microlitri di acetato di sodio 50 millimolare a pH 5. Per la generazione della curva di calibrazione, misurare anche le soluzioni standard di glucosio. Aggiungere 150 microlitri di reagente GOD-POD a ciascun campione e mescolare rapidamente mediante pipettaggio.Incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, registrare il valore di assorbanza a 510 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Calcolare la quantità di glicogeno come equivalente di glucosio, utilizzando una curva di calibrazione ottenuta dagli standard di glucosio.I contenuti di glicogeno in Synechocystis sono mostrati qui. I due ceppi mutanti, delta pmg A e delta pmg R, noti per l'iperaccumulo di glicogeno, sono stati confrontati con il ceppo di tipo selvatico. Come previsto, i ceppi mutanti hanno mostrato livelli elevati di glicogeno.Al contrario, un mutante privo della sintasi del glicogeno non ha accumulato glicogeno. I ceppi utilizzati in questo studio sono stati ingegnerizzati per produrre mannosio. In particolare, il mutante della sintasi del glicogeno ha prodotto più mannosio rispetto al ceppo di controllo, suggerendo che l'idrato di carbonio sintetizzato attraverso la fotosintesi viene reindirizzato al mannosio nel ceppo mutante privo della capacità di sintetizzare il glicogeno.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe essere in grado di determinare quantitativamente il contenuto di glicogeno nei cianobatteri in cinque ore. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di risospendere accuratamente le cellule e solubilizzare i pellet di glicogeno per ottenere risultati affidabili. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come saggi dell'attività enzimatica metabolica possono essere eseguiti utilizzando i lisati cellulari rimanenti al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come il metabolismo dei carboidrati sia regolato nei cianobatteri.

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Questo video descrive un test spettrofotometrico per la stima dell'attività della glicogeno sintasi. Il metodo si basa sulla riduzione dell'assorbanza del NADH con il tempo e indica l'attività della glicogeno sintasi.

Saggio spettrofotometrico per determinare l'attività della glicogeno sintasi

In questo video, descriviamo un saggio spettrofotometrico qualitativo per determinare l'entità della ramificazione in un campione di glicogeno con una struttura non caratterizzata. Il confronto dei massimi di assorbanza del campione non caratterizzato con quello dei polisaccaridi con strutture ramificate note indica la presenza di ramificazioni nel campione non caratterizzato.

Saggio di ramificazione del glicogeno per misurare il grado di ramificazione del glicogeno

Descriviamo qui un metodo biochimico accurato, riproducibile e conveniente per la titolazione del glicogeno in vitro. Questa tecnica utilizza il kit di analisi Abcam glicogeno e si basa sulla successiva idrolisi del glicogeno in glucosio e titolazione mediante fluorescenza.

Titolazione biochimica di glicogeno<em&gt; In vitro</em

Qui, presentiamo un protocollo per determinare quantitativamente il contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. La procedura di estrazione è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di alghe e cianobatteri; Tuttavia, a causa delle variazioni negli spettri di assorbimento del pigmento, è necessario testare individualmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.

Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Qui, vengono descritti i protocolli per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati cianobatterici e l'isolamento dei loro esoproteomi. Entrambe le procedure incorporano i passaggi chiave per ottenere polimeri o proteine con gradi di elevata purezza che possono essere utilizzati per ulteriori analisi o applicazioni. Possono anche essere facilmente adattati in base alle esigenze specifiche dell'utente.

Guardando verso l'esterno: Isolamento dei polimeri e delle proteine di carboidrati rilasciati in cianobatteria

Vengono presentate le tecniche per misurare l'attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno, utilizzando un semplice spettrofotometro operante nell'intervallo visibile.

Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l'estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.

L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno

L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.

Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

Nel presente protocollo, la tecnica di elettroforesi dei carboidrati assistiti da fluorofori (FACE) viene utilizzata per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena (ACL) del glicogeno.

Determinazione della distribuzione della lunghezza della catena glucano del glicogeno utilizzando il metodo dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)

L'adsorbimento di peptidi su plastica durante le tradizionali diluizioni seriali basate su puntali può avere un impatto significativo sulla determinazione della potenza e confondere la comprensione delle relazioni struttura-attività utilizzate per l'identificazione del piombo e le fasi di ottimizzazione del piombo della scoperta di farmaci. Qui vengono descritti i metodi per la diluizione seriale acustica automatizzata senza contatto di campioni di peptidi.

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

Impara a determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri con un saggio enzimatico semplice e sensibile. Questo metodo supporta la ricerca in biochimica, microbiologia e ingegneria metabolica.

Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

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