Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri utilizzando un'idrolisi e un saggio selettivi basati su enzimi. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dei cianobatteri, come la fisiologia, la genetica molecolare e la bioingegneria di diversi ceppi di cianobatteri in fase di indagine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è adattata a una piccola scala, è facile da eseguire e altamente sensibile e specifica per il glicogeno.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui cianobatteri, può essere applicato anche ad altri microrganismi che accumulano glicogeno o amido, come E.Coli, lievito, microalghe e vari microrganismi eterotrofi e fototrofi. Inizia questo protocollo con la preparazione di colture cianobatteriche come descritto nel protocollo di testo. Trasferire un millilitro di coltura cianobatterica o sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri.

Quindi centrifugare a 6.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in un millilitro di Tris-HCL pH 8 millimolare da 50 millimolari. Centrifugare il pellet risospeso come prima.

Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare una seconda volta nel tampone Tris-HCL. Centrifugare le provette come prima ed eliminare il surnatante. Quindi risospendere accuratamente il pellet in 500 microlitri di tampone Tris-HCL da 50 millimolari pH otto.

È fondamentale avere il pellet ben sospeso per una lisi efficiente. Mantenere la risospensione in ghiaccio. Lisi le celle risospese a quattro gradi Celsius con 30 cicli di ultrasuoni, ciascuno dei quali consiste in 30 secondi a una frequenza di 20 kilohertz con un'ampiezza massima, seguiti da 90 secondi senza.

Centrifugare la provetta contenente il lisato a 6.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, il pellet dovrebbe essere costituito principalmente da detriti di cellule di grandi dimensioni e il surnatante viene utilizzato per ulteriori analisi. A questo punto, determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine.

Rimuovere la clorofilla a dal lisato cellulare mescolando 900 microlitri di etanolo e 100 microlitri del surnatante ottenuto in una provetta con tappo a vite da 1,5 millilitri. Dopo aver chiuso il tappo, riscaldare la provetta a 90 gradi Celsius per 10 minuti, utilizzando un normale blocco riscaldante da laboratorio. Quindi, incubare la provetta nel ghiaccio per 30 minuti.

Quindi, centrifugare la provetta a 20.000 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante. Il pellet contiene glicogeno.

Asciugare leggermente il pellet all'aria per rimuovere l'etanolo in eccesso. Non asciugare eccessivamente il pellet per evitare difficoltà di dissoluzione. Misurare l'assorbanza a 666 nanometri del surnatante ottenuto per determinare il contenuto di clorofilla a.

Il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogeno. Sciogliere il pellet in 100 microlitri di acetato di sodio da 50 millimolari pH cinque. Mescola bene questi materiali, usando un vortice.

La miscelazione mediante pipettaggio non è consigliata perché la miscela è viscosa. Aggiungere anche 50 microlitri di amiloglucosidasi in otto unità per millilitro e 50 microlitri in due unità per millilitro di alfa-amilasi. Successivamente, incubare la miscela a 60 gradi Celsius in un blocco riscaldante per due ore per consentire la digestione del glicogeno in molecole di glucosio.

Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 20.000 volte g per cinque minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Misurare la concentrazione di glucosio nel surnatante dopo idrolisi enzimatica, utilizzando il reagente GOD-POD. Trasferire 100 microlitri di surnatante dalla fase di precipitazione del glicogeno a un pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.

Come controllo negativo, utilizzare 100 microlitri di acetato di sodio da 50 millimolari pH cinque. Per generare la curva di calibrazione, misurare anche le soluzioni standard di glucosio. Aggiungere 150 microlitri di reagente GOD-POD a ciascun campione e miscelare rapidamente mediante pipettaggio.

Incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, registrare il valore di assorbanza a 510 nanometri, utilizzando un lettore di piastre. Calcolare la quantità di glicogeno come glucosio equivalente, utilizzando una curva di calibrazione ottenuta dagli standard del glucosio.

I contenuti di glicogeno nella sinecocisti sono mostrati qui. I due ceppi mutanti, delta pmg A e delta pmg R, che sono noti per iperaccumulare glicogeno, sono stati confrontati con il ceppo wild type. Come previsto, i ceppi mutanti hanno mostrato livelli elevati di glicogeno.

Al contrario, un mutante privo di glicogeno sintasi non ha accumulato glicogeno. I ceppi utilizzati qui sono stati ingegnerizzati per produrre mannitolo. In particolare, il mutante glicogeno sintasi ha prodotto più mannitolo rispetto al ceppo di controllo, il che suggerisce che il carboidrato sintetizzato dalla fotosintesi viene reindirizzato al mannitolo nel ceppo mutante privo della capacità di sintetizzare il glicogeno.

Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di determinare quantitativamente il contenuto di glicogeno nei cianobatteri in cinque ore. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di risospendere accuratamente le cellule e solubilizzare i pellet di glicogeno per ottenere risultati affidabili. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi di attività enzimatica metabolica, utilizzando i lisati cellulari rimanenti per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui il metabolismo dei carboidrati è regolato nei cianobatteri.