Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l'imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.

La misura del contenuto di glicogeno nelle singole cellule e nelle organizzazioni subcellulari è importante perché nella maggior parte dei tipi di cellule, le singole cellule si adattano in modo diverso alle mutevoli condizioni fisiologiche e alle malattie. Quindi, il vantaggio principale di questa tecnica è l'altissima risoluzione nel microscopio elettronico a trasmissione. Questo migliora la possibilità di avere strutture subcellulari localizzate e anche in questo contenuto in questa tecnica qui, è importante che la colorazione del glicogeno sia priva di anticorpi.

Quindi, non abbiamo alcuna specificità di cui preoccuparci. Per ottenere un migliore contrasto sul glicogeno, basta usare il ferrocianuro di potassio all'1,5% invece del ferrocianuro di potassio. Preparare 1,6 millilitri della soluzione fissativa primaria aggiungendo il 2,5% di glutaraldeide in un tampone di cacodilato di sodio molare da 0,1 millilitri in un tubo di microcentrificazione da due millilitri.

Conservalo a cinque gradi Celsius per un massimo di 14 giorni. Isolare un piccolo campione dalla biopsia muscolare o da un intero muscolo che ha un diametro massimo di un millimetro in qualsiasi direzione ed è più lungo longitudinalmente che in sezione trasversale. Posizionare il campione nel tubo contenente la soluzione di fissazione primaria fredda.

Conservalo a cinque gradi Celsius per 24 ore. Quindi lavare il campione quattro volte in 0,1 tampone di cacodilato di sodio molare. Utilizzando pipette di trasferimento, rimuovere il buffer utilizzato dal tubo lasciando intatto il campione e aggiungere il buffer fresco.

Post-fissare il campione con 1% di tetrossido di osmio e 1,5% di ferrocianuro di potassio in tampone di cacodilato di sodio molare 0,1% per 120 minuti a quattro gradi Celsius. Risciacquare il campione due volte in acqua distillata doppia a temperatura ambiente. Disidratare immergendo in una serie graduata di etanolo a temperatura ambiente.

Infiltrare il campione con miscele classificate di ossido di propilene e resina epossidica a temperatura ambiente utilizzando i rapporti di volume menzionati. Il giorno seguente, incorporare campioni in resina epossidica fresca al 100% in stampi e polimerizzare a 60 gradi Celsius per 48 ore. Montare il blocco di un campione sul supporto dell'ultramicrotoma.

Tagliare il blocco sulla superficie con una lama di rasoio per raggiungere il livello del tessuto. Montare un coltello diamantato davanti al campione e allineare la superficie del campione parallelamente al coltello. Produrre una sezione semisottile di uno spessore micrometrico con il coltello diamantato per controllare l'orientamento del campione.

Macchiare la sezione semisottile con toluidina blu per l'osservazione con microscopia ottica. Quindi tagliare ulteriormente il blocco per ridurre l'area di interesse per ottenere sezioni ultrasottili adeguate. Tagliare sezioni ultrasottili da 60 a 70 nanometri di spessore con un secondo coltello diamantato.

Raccogli una o due sezioni su un'intera griglia di rame usando un loop perfetto. Per contrastare le sezioni, immergere le griglie in soluzione di acetato di uranile per 20 minuti e lavare le griglie in acqua a doppio distillato e quindi immergere le griglie in citrato di piombo per 15 minuti e lavare nuovamente le griglie in acqua a doppia distillazione. Accendere il computer al microscopio elettronico a trasmissione e il software di registrazione delle immagini, registrare immagini digitali con una fotocamera CCD digitale a scansione lenta e il software di imaging associato.

Dopo aver inserito la griglia con più sezioni nello stadio del microscopio, schermare la griglia inizialmente a basso ingrandimento per scegliere le sezioni di migliore qualità e determinare la direzione delle fibre muscolari. Messa a fuoco successiva, l'immagine a ingrandimento superiore a 30.000 con il raggio centrato su una fibra periferica nella sezione e registrare le immagini con un secondo di esposizione all'ingrandimento desiderato. Assicurarsi che le immagini siano distribuite su tutta la lunghezza e la larghezza della fibra in un ordine sistematico bot randomizzato per ottenere risultati imparziali e ripetere l'imaging fino a quando non vengono visualizzate da sei a 10 fibre.

Importa le immagini nell'immagine J facendo clic su file seguito da apri. Imposta la scala globale in modo che corrisponda alle dimensioni originali dell'immagine facendo clic su Analizza e quindi imposta scala. Per ingrandire al 100% fare clic sull'immagine, andare ingrandi e fare clic su in.

Misurare lo spessore di un disco Z per immagine dello spazio miofibrillare utilizzando lo strumento linea retta dal menu strumenti e calcolare lo spessore medio del disco Z di ciascuna delle sei-10 fibre. Utilizzare lo strumento linea segmentata per misurare la lunghezza della miofibrilla più esterna visibile appena sotto la regione subsarcolemmale. Per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare strumenti e quindi selezionare griglia.

Ora imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi entro la lunghezza disponibile nelle 12 immagini subsarcolemmali in cui una croce colpisce il glicogeno subsarcolemmale. Inserisci una griglia facendo clic su analizza, quindi seleziona strumenti, quindi griglia e imposta l'area per punto a 160.000 nanometri quadrati.

Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce lo spazio intramiofibrillare. Quindi di nuovo, per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare strumenti e quindi selezionare griglia. Ora imposta l'area per punto a 3.600 nanometri quadrati.

Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce il glicogeno intramiofibrillare. Inserisci una griglia facendo clic su Analizza, quindi seleziona strumenti, quindi griglia e imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce il glicogeno intermiofibrillare.

Utilizzando la griglia di 32.400 nanometri quadrati per scegliere casualmente le particelle di glicogeno, iniziare con il quadrato in alto a sinistra e spostarsi a sinistra se necessario. Utilizzando lo strumento linea retta, misurare il diametro di cinque particelle di glicogeno scelte casualmente di ciascun pool per ciascuna delle 12 immagini per ottenere una media di 60 particelle per pool per fibra. Questa figura mostra i valori normali dei tre pool di glicogeno.

Si può osservare che i valori del glicogeno intermiofibrillare sono distribuiti vicino al normale, mentre sia il glicogeno intramiofibrillare che quello subsarcolemmale mostrano una distribuzione distorta in cui le fibre a volte hanno una quantità eccessiva di glicogeno. Tra tutti i passaggi è molto importante utilizzare ferrocianuro di potassio. L'analisi del glicogeno può essere combinata con l'analisi dei mitocondri e delle goccioline lipidiche che possono migliorare la nostra comprensione di come altri componenti metabolici chiave siano correlati con il glicogeno e la salute muscolare.