Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione
7 febbraio 2022
Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l'imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.
La misura del contenuto di glicogeno nelle singole cellule e nelle organizzazioni subcellulari è importante perché nella maggior parte dei tipi di cellule, le singole cellule si adattano in modo diverso alle mutevoli condizioni fisiologiche e alle malattie. Quindi, il vantaggio principale di questa tecnica è l'altissima risoluzione nel microscopio elettronico a trasmissione. Questo migliora la possibilità di avere strutture subcellulari localizzate e anche in questo contenuto in questa tecnica qui, è importante che la colorazione del glicogeno sia priva di anticorpi.
Quindi, non abbiamo alcuna specificità di cui preoccuparci. Per ottenere un migliore contrasto sul glicogeno, basta usare il ferrocianuro di potassio all'1,5% invece del ferrocianuro di potassio. Preparare 1,6 millilitri della soluzione fissativa primaria aggiungendo il 2,5% di glutaraldeide in un tampone di cacodilato di sodio molare da 0,1 millilitri in un tubo di microcentrificazione da due millilitri.
Conservalo a cinque gradi Celsius per un massimo di 14 giorni. Isolare un piccolo campione dalla biopsia muscolare o da un intero muscolo che ha un diametro massimo di un millimetro in qualsiasi direzione ed è più lungo longitudinalmente che in sezione trasversale. Posizionare il campione nel tubo contenente la soluzione di fissazione primaria fredda.
Conservalo a cinque gradi Celsius per 24 ore. Quindi lavare il campione quattro volte in 0,1 tampone di cacodilato di sodio molare. Utilizzando pipette di trasferimento, rimuovere il buffer utilizzato dal tubo lasciando intatto il campione e aggiungere il buffer fresco.
Post-fissare il campione con 1% di tetrossido di osmio e 1,5% di ferrocianuro di potassio in tampone di cacodilato di sodio molare 0,1% per 120 minuti a quattro gradi Celsius. Risciacquare il campione due volte in acqua distillata doppia a temperatura ambiente. Disidratare immergendo in una serie graduata di etanolo a temperatura ambiente.
Infiltrare il campione con miscele classificate di ossido di propilene e resina epossidica a temperatura ambiente utilizzando i rapporti di volume menzionati. Il giorno seguente, incorporare campioni in resina epossidica fresca al 100% in stampi e polimerizzare a 60 gradi Celsius per 48 ore. Montare il blocco di un campione sul supporto dell'ultramicrotoma.
Tagliare il blocco sulla superficie con una lama di rasoio per raggiungere il livello del tessuto. Montare un coltello diamantato davanti al campione e allineare la superficie del campione parallelamente al coltello. Produrre una sezione semisottile di uno spessore micrometrico con il coltello diamantato per controllare l'orientamento del campione.
Macchiare la sezione semisottile con toluidina blu per l'osservazione con microscopia ottica. Quindi tagliare ulteriormente il blocco per ridurre l'area di interesse per ottenere sezioni ultrasottili adeguate. Tagliare sezioni ultrasottili da 60 a 70 nanometri di spessore con un secondo coltello diamantato.
Raccogli una o due sezioni su un'intera griglia di rame usando un loop perfetto. Per contrastare le sezioni, immergere le griglie in soluzione di acetato di uranile per 20 minuti e lavare le griglie in acqua a doppio distillato e quindi immergere le griglie in citrato di piombo per 15 minuti e lavare nuovamente le griglie in acqua a doppia distillazione. Accendere il computer al microscopio elettronico a trasmissione e il software di registrazione delle immagini, registrare immagini digitali con una fotocamera CCD digitale a scansione lenta e il software di imaging associato.
Dopo aver inserito la griglia con più sezioni nello stadio del microscopio, schermare la griglia inizialmente a basso ingrandimento per scegliere le sezioni di migliore qualità e determinare la direzione delle fibre muscolari. Messa a fuoco successiva, l'immagine a ingrandimento superiore a 30.000 con il raggio centrato su una fibra periferica nella sezione e registrare le immagini con un secondo di esposizione all'ingrandimento desiderato. Assicurarsi che le immagini siano distribuite su tutta la lunghezza e la larghezza della fibra in un ordine sistematico bot randomizzato per ottenere risultati imparziali e ripetere l'imaging fino a quando non vengono visualizzate da sei a 10 fibre.
Importa le immagini nell'immagine J facendo clic su file seguito da apri. Imposta la scala globale in modo che corrisponda alle dimensioni originali dell'immagine facendo clic su Analizza e quindi imposta scala. Per ingrandire al 100% fare clic sull'immagine, andare ingrandi e fare clic su in.
Misurare lo spessore di un disco Z per immagine dello spazio miofibrillare utilizzando lo strumento linea retta dal menu strumenti e calcolare lo spessore medio del disco Z di ciascuna delle sei-10 fibre. Utilizzare lo strumento linea segmentata per misurare la lunghezza della miofibrilla più esterna visibile appena sotto la regione subsarcolemmale. Per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare strumenti e quindi selezionare griglia.
Ora imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi entro la lunghezza disponibile nelle 12 immagini subsarcolemmali in cui una croce colpisce il glicogeno subsarcolemmale. Inserisci una griglia facendo clic su analizza, quindi seleziona strumenti, quindi griglia e imposta l'area per punto a 160.000 nanometri quadrati.
Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce lo spazio intramiofibrillare. Quindi di nuovo, per inserire una griglia, fare clic su Analizza, selezionare strumenti e quindi selezionare griglia. Ora imposta l'area per punto a 3.600 nanometri quadrati.
Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce il glicogeno intramiofibrillare. Inserisci una griglia facendo clic su Analizza, quindi seleziona strumenti, quindi griglia e imposta l'area per punto a 32.400 nanometri quadrati. Conta il numero di colpi nella 12a immagine miofibrillare in cui una croce colpisce il glicogeno intermiofibrillare.
Utilizzando la griglia di 32.400 nanometri quadrati per scegliere casualmente le particelle di glicogeno, iniziare con il quadrato in alto a sinistra e spostarsi a sinistra se necessario. Utilizzando lo strumento linea retta, misurare il diametro di cinque particelle di glicogeno scelte casualmente di ciascun pool per ciascuna delle 12 immagini per ottenere una media di 60 particelle per pool per fibra. Questa figura mostra i valori normali dei tre pool di glicogeno.
Si può osservare che i valori del glicogeno intermiofibrillare sono distribuiti vicino al normale, mentre sia il glicogeno intramiofibrillare che quello subsarcolemmale mostrano una distribuzione distorta in cui le fibre a volte hanno una quantità eccessiva di glicogeno. Tra tutti i passaggi è molto importante utilizzare ferrocianuro di potassio. L'analisi del glicogeno può essere combinata con l'analisi dei mitocondri e delle goccioline lipidiche che possono migliorare la nostra comprensione di come altri componenti metabolici chiave siano correlati con il glicogeno e la salute muscolare.
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Panoramica
Questo studio presenta una procedura post-fissazione modificata che migliora il contrasto delle particelle di glicogeno nel tessuto. Il protocollo descrive in dettaglio la manipolazione del tessuto, le tecniche di imaging e i metodi stereologici per quantificare la distribuzione del glicogeno nel muscolo scheletrico.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Istoologia
Contesto
- La misurazione del contenuto di glicogeno è cruciale per comprendere le risposte cellulari ai cambiamenti fisiologici.
- Le singole cellule mostrano adattamenti variabili a condizioni e malattie.
- L'imaging ad alta risoluzione è essenziale per osservare le strutture subcellulari.
- La tecnica evita problemi di specificità utilizzando la colorazione del glicogeno priva di anticorpi.
Obiettivo dello studio
- Migliorare il contrasto delle particelle di glicogeno nei campioni di tessuto.
- Fornire un protocollo dettagliato per l'imaging e l'analisi.
- Ottenere dati imparziali sulla distribuzione del glicogeno nel muscolo scheletrico.
Metodi utilizzati
- Procedura post-fissazione modificata con ferrocianuro di potassio.
- Preparazione della soluzione fissativa utilizzando glutaraldeide e tampone cacodilato di sodio.
- Microscopia elettronica a trasmissione per imaging ad alta risoluzione.
- Metodi stereologici per l'analisi quantitativa.
Risultati principali
- È stato ottenuto un contrasto migliorato delle particelle di glicogeno.
- Il protocollo consente un imaging preciso delle strutture subcellulari.
- È stata dimostrata una quantificazione imparziale della distribuzione del glicogeno.
- La tecnica è applicabile a vari tipi di tessuto.
Conclusioni
- La procedura modificata migliora significativamente la visualizzazione del glicogeno.
- Fornisce un metodo affidabile per studiare il glicogeno nel muscolo scheletrico.
- Facilita una migliore comprensione degli adattamenti cellulari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
