Name: Analisi dellinterazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri la citometria a flusso quantitativa per caratterizzare le interazioni proteina-membrana lipidica. Questo metodo semplice calcola le costanti cinetiche ed equilibrio per la ricerca di base in biochimica.

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Gli autori sono stati supportati da una sovvenzione della Russian Science Foundation 20-74-00133.

1. Etichettatura delle proteine fluorescenti
<ol><li>Preparazione del materiale<ol>
<li>Preparare il tampone di bicarbonato di sodio 1 M, pH 9,0, conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro una settimana.</li>
		<li>Preparare il tampone idrossilammina cloridrato da 1,5 M, pH 8,5, immediatamente prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare una soluzione da 10 mg/mL di colorante fluorescente (vedere la Tabella dei materiali) in dimetilsolfossido. NOTA: questa soluzione può essere conservata per un mese a -20 °C al buio.</li>
		<li>Preparare soluzioni di anticorpi purificati o altre proteine a 1-10 mg/ml. NOTA: Evitare tamponi contenenti ioni ammonio o ammine primarie. Sostituire i tamponi contenenti Tris o glicerolo con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante dialisi. Né l'azide di sodio (≤3 mM) né il thimerosal (≤1 mM) influenzeranno significativamente la reazione di coniugazione.</li>
		<li>Incubare il mezzo filtrante in gel (vedi tabella dei materiali) per la purificazione delle proteine in PBS durante la notte a temperatura ambiente o per 2 ore a 60 °C. Applicare il mezzo filtrante in gel su colonne di centrifuga con membrane da 0,2 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare la quantità di colorante reattivo da utilizzare per ogni reazione in base alla concentrazione di proteine da etichettare utilizzando Eq (1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq1v4.jpg"> Dove ilcolorante V è il volume della soluzione madre colorante; Cpr, Vpr e MWpr sono la concentrazione, il volume e il peso molare della proteina; Ilcolorante MW è il peso molare del colorante; 100 è un fattore di conversione unitario; MR è il rapporto molare tra colorante e proteine nella miscela di reazione. NOTA: Le seguenti RM sono raccomandate per le reazioni di marcatura delle IgG: MR = 40 se l'anticorpo è a 1-3 mg/mL o MR = 30 se l'anticorpo è a 4-10 mg/mL. Per i fattori della coagulazione, di solito viene utilizzato MR = 5.</li>
	<li>Reazione coniugale<ol>
<li>In un tubo di reazione, mescolare la soluzione proteica con un volume 10 volte inferiore di 1 M di soluzione di bicarbonato.</li>
		<li>Aggiungere la quantità necessaria di colorante fluorescente (vedere il punto 1.2) mescolando continuamente.</li>
		<li>Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente per circa 1 ora, al riparo dalla luce e con agitazione continua.</li>
		<li>Per ogni 200 μL di soluzione proteica, aggiungere 5 μL di 1,5 M di idrossilammina cloridrato.</li>
		<li>Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente per circa 30 minuti, al riparo dalla luce e con agitazione continua.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la colonna di rotazione.<ol>
<li>Aggiungere 500 μL di mezzo filtrante in gel per la purificazione delle proteine a una colonna. Centrifugare la colonna per 3 minuti a 1.000 × g.</li>
		<li>Eliminare il buffer dal tubo di raccolta. Se la colonna non è piena, aggiungere più mezzo filtrante in gel e centrifugare la colonna per 3 minuti a 1.000 × g. Ripetere questo passaggio fino a quando la colonna non è piena.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificazione<ol>
<li>Centrifugare la miscela di reazione (dal punto 1.3.5) per 5 minuti a 17.000 × g e rimuovere il precipitato.</li>
		<li>Trasferire il surnatante sulla colonna di spin con mezzo filtrante in gel. Lasciare che la soluzione si assorba nel letto di gel.</li>
		<li>Utilizzare un tubo di raccolta vuoto per la colonna di centrifuga e centrifugarlo per 5 minuti a 1.000 × g. Dopo la centrifugazione, raccogliere la proteina etichettata dal tubo di raccolta.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinazione del grado di etichettatura<ol>
<li>Correggere il contributo del colorante all'assorbanza a A280 misurando l'assorbanza del colorante libero a 280 nm (A280) e il massimo λ per il colorante (Amax) (vedi Eq (2)). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq02.jpg">(2)</li>
		<li>Misurare l'assorbanza del coniugato proteina-colorante a 280 nm (A280) e il massimo λ per il colorante (Amax) e calcolare la concetrazione proteica utilizzando Eq (3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq3v2.jpg">(3) Dove εM è il coefficiente di estinzione molare della proteina a 280 nm; d è la lunghezza del percorso ottico durante la misurazione dell'assorbanza; CF è il contributo del colorante all'assorbanza a A280 (fase 1.6.1).</li>
		<li>Calcolare il grado di etichettatura (DOL) utilizzando Eq (4). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq4v2.jpg">(4) Dove ε coloranteM è il coefficiente di estinzione molare del colorante a λmax nm; d è la lunghezza del percorso ottico durante la misurazione dell'assorbanza; Laproteina C è la concentrazione della proteina (fase 1.6.2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione delle vescicole fosfolipidiche
<ol><li>Preparazione e conservazione della miscela lipidica<ol>
<li>Combinare i lipidi nel rapporto appropriato (fosfatidilserina/fosfatidilcolina in un rapporto tra il 20 mol% e l'80 mol%).</li>
		<li>Asciugare la miscela lipidica dopo liofilizzazione o evaporazione e conservarla in atmosfera inerte in fiale di vetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Produzione di film lipidici<ol>
<li>Aprire la fiala e risospesere la miscela lipidica in una piccola quantità (~ 100 μL) di cloroformio. NOTA: Non usare troppo cloroformio in quanto non evapora completamente.</li>
		<li>Aggiungere DiIC16(3) in etanolo allo 0,2 mol%. Trasferire la miscela lipidica in un matraccio a fondo tondo. Stendere il composto sottilmente sui lati del matraccio ruotandolo. Asciugare la miscela lipidica per 30 minuti sotto un flusso di argon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Idratazione della miscela lipidica<ol>
<li>Aggiungere un tampone acquoso opportunamente caldo (~55 °C) (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) in un volume corrispondente alla concentrazione lipidica prevista al matraccio con il film lipidico. Incubare la miscela con vortice a 55 ° С per 30 minuti per un'idratazione completa.</li>
		<li>Posizionare la provetta del campione in un congelatore o in un termostato caldo per sottoporre la sospensione lipidica a 3-5 cicli di congelamento-scongelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formazione di vescicole lipidiche per estrusione<ol>
<li>Preparare l'estrusore secondo le istruzioni del produttore. Riscaldare tutti i componenti dell'estrusore alla temperatura di transizione di fase della miscela lipidica.</li>
		<li>Riempire una delle siringhe dell'estrusore con la miscela lipidica idratata. Attendere 5-10 minuti affinché la temperatura della sospensione lipidica si equilibri con la temperatura dell'estrusore.</li>
		<li>Estrudere la miscela lipidica attraverso la membrana almeno 10 volte. Per l'estrusione finale, posizionare la sospensione lipidica nella siringa alternativa e cercare un cambiamento nell'aspetto da una soluzione leggermente nebulosa a una soluzione chiara.</li>
		<li>Conservare la miscela risultante di vescicole lipidiche a 4 °C, preferibilmente in atmosfera inerte di argon o azoto, per 3-4 giorni. Non congelare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolamento delle piastrine dal sangue intero
<ol><li>Raccogliere sangue intero da donatori sani in provette contenenti il 3,2% di citrato di sodio.</li>
	<li>Aggiungere al sangue la prostaglandina E1 (PGE1) (1 μM) e l'apirasi (0,1 U/mL), seguite da centrifugazione a temperatura ambiente a 100 × g per 8 min.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, prendere il plasma ricco di piastrine e aggiungere la soluzione di citrato di sodio (106 mM, pH 5,5) ad un rapporto plasma/citrato di 3:1. Centrifugare il plasma a temperatura ambiente a 400 × g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 300 μL del tampone di Tyrode senza BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glucosio, pH 7,4). Purificare le piastrine dalle proteine plasmatiche mediante cromatografia su gel sul mezzo filtrante gel per la purificazione piastrinica (vedi Tabella dei materiali).</li>
</ol>4. Rilevazione dell'interazione proteina-lipidi mediante citometria a flusso
<ol><li>Esperimenti di legame cinetico<ol>
<li>Vescicole fosfolipidiche diluite (dal passo 2.4.4) nel tampone di Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glucosio, 0,5% BSA, pH 7,4) ad una concentrazione di 1 μM e volume totale di 250 μL.</li>
		<li>Mescolare il fattore X della coagulazione marcato fluorescente (fX-fd) dallo stadio 1 a una concentrazione di 500 nM con le vescicole fosfolipidiche dal punto 4.1.1 in un rapporto 1:1 (concentrazione finale della vescicola 0,5 μM, la concentrazione fX-fd è 250 nM di fX) a un volume totale di 500 μL.</li>
		<li>Iniettare immediatamente i 500 μL della sospensione mista (~ 20 minuti per l'analisi con una bassa velocità di flusso) nel citometro a flusso. Utilizzare una portata bassa e assicurarsi che la soglia per il canale FL2 (exсitation 488 nm, filtro di emissione 585/42 nm) sia pari al valore 200. Misurare la fluorescenza media nel canale FL4 (exсitation 633 nm, filtro di emissione 660/20) per il colorante a fluorescenza dalla Tabella dei materiali. NOTA: Scegliere un citometro senza autocampionatore. Ciò accelererà il processo di iniezione del campione nella cella di misurazione.</li>
		<li>Quando si raggiunge la saturazione del legame (nessun aumento significativo della fluorescenza entro 5 minuti), diluire rapidamente il campione di 20 volte con il tampone di Tyrode e monitorare la dissociazione fino al raggiungimento della fluorescenza basale (dissociazione completa) o fino al raggiungimento di un plateau (nessuna diminuzione significativa della fluorescenza entro 5 minuti). NOTA: come controllo, aggiungere 10 μM EDTA e monitorare la dissociazione completa per 5 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esperimenti di legame all'equilibrio NOTA: utilizzare la curva cinetica di legame per determinare il tempo necessario per raggiungere la saturazione; il tempo di saturazione per fX-fd e vescicole artificiali è di 20 min.<ol>
<li>Incubare vescicole fosfolipidiche artificiali (5 μM) per il saggio di legame con diverse concentrazioni di fX-fd (da 0 a 1.000 nM) nel tampone di Tyrode per 20 min.</li>
		<li>Diluire ogni campione dal punto 4.2.1 di 20x a un volume finale di 200 μL con il tampone di Tyrode. Analizzare immediatamente il campione diluito mediante citometria a flusso entro 30 s. Utilizzare le impostazioni del passaggio 4.1.3. NOTA: come controllo per il legame non specifico, utilizzare campioni simili con EDTA (10 μM) e incubarli per 5 minuti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analisi dei dati della citometria a flusso
<ol><li>Esportare esperimenti in formato FSC dal software di acquisizione dati di citometria al software di citometro per l'analisi dei dati (vedere la Tabella dei materiali). Scegli file | Esporta | FCS. Apri i file FSC nel software cytometer per l'analisi dei dati selezionando i file sul computer e trascinandoli nell'area di lavoro del programma.</li>
	<li>Per il gating delle microvescicole, identificare la regione delle microvescicole mediante la fluorescenza del colorante lipofilo DiIC16(3). Utilizzare i comandi di menu o il pulsante di stampa nel foglio di lavoro per creare SSC dot plot da FL2 (dye DilC16(3)) nelle coordinate di registro. Scegliere il pulsante Porta rettangolare per disegnare una regione di gating in modo che gli eventi di un campione senza vescicole non siano inclusi in questa regione (Figura 1B,C).</li>
	<li>Analizzare gli esperimenti cinetici.<ol>
<li>Creare un dot-plot utilizzando le coordinate di fluorescenza (FL4) nel tempo per la regione delle vescicole (fare doppio clic nella regione delle vescicole nel passaggio 5.2)</li>
		<li>Esporta i dati sulla variazione di fluorescenza nel tempo in formato csv. Scegli | di esempio Fare clic con il pulsante destro del mouse su | Esporta | Scegli FL4 e Tempo nei parametri | Selezionare la directory per il salvataggio di | Seleziona il formato CSV | Esportazione.</li>
		<li>Apri il file CSV in qualsiasi software statistico (vedi la Tabella dei materiali). Calcola una semplice media mobile di fluorescenza e tempo per ogni 1.000 eventi.</li>
		<li>Approssimare un grafico della dipendenza della fluorescenza della media mobile semplice nel tempo sotto l'ipotesi della dipendenza esponenziale (Analysis &gt; Fitting &gt;Nonlinear Curve Fit) e usarlo per calcolare la costante di associazione cinetica usando Eq (5). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq05v2.jpg">(5) Dove [XB] è la concentrazione del fattore legato in ogni momento del tempo (unità definite dall'utente) secondo la media mobile semplice dal passo 5.3.3; [X] è la concentrazione del fattore aggiunto; [X]max è la concentrazione massima del fattore limite; k è la costante di associazione; t è il tempo.</li>
		<li>Ripetere lo stesso insieme di azioni (5.3.1-5.3.4) per calcolare la costante di dissociazione cinetica usando Eq (6). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq06v2.jpg">(6) Dove [XB] è la concentrazione del fattore legato in ogni momento del tempo; [X]0 è la concentrazione del fattore legato al momento iniziale del tempo; k è la costante di dissociazione; t è il tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saggio di legame di equilibrio<ol>
<li>Determinare la fluorescenza media di fX-fd nella regione delle vescicole per ogni concentrazione selezionata di fX-fd.</li>
		<li>Approssimare la dipendenza della fluorescenza del fattore legato dalla concentrazione del fattore aggiunto nell'assunzione di un semplice legame a sito singolo. Calcola i parametri di legame medi utilizzando Eq (7) da almeno tre ripetizioni indipendenti. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq07v2.jpg">(7) Dove [XB] è la concentrazione del fattore legato; [X] è la concentrazione del fattore aggiunto; nx è il numero apparente di siti di legame per vescicola; Kd è la costante di dissociazione apparente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Conversione dell'intensità di fluorescenza nel numero medio di siti di legame
<ol><li>Preparare perline calibrate.<ol>
<li>Incubare piastrine filtrate in gel (vedere fase 3.3) con A23187 (10 μM) in presenza di CaCl2 (2,5 mM) per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere alle piastrine attivate le varie concentrazioni di fX-fd (da 0 a 1.000 nM). Aggiungere il 2% di formaldeide v/v e incubare per 1 ora. Interrompere la reazione incubando le piastrine con glicina 3 M e BSA al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Purificare la miscela dal colorante non reagito. Centrifugare le piastrine per 5 minuti a 400 × g, rimuovere il surnatante e risospese il pellet nel tampone di Tyrode (contenente lo 0,5% di BSA). NOTA: ripetere il passaggio 6.1.3 tre volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare il livello di fluorescenza delle perle di taratura in ciascun campione prima utilizzando uno spettrofluorometro (per colorante fluorescente dalla Tavola dei Materiali, eccitazione 633 nm, emissione 670 nm) e poi utilizzando il citometro a flusso (nel canale FL4: eccitazione 633 nm, filtro di emissione 660/20). Utilizzando un contatore di celle, determinare il numero di perline in ciascun campione.</li>
	<li>Convertire l'intensità di fluorescenza di ciascun rispettivo campione di perline nella concentrazione di colorante fluorescente solubile utilizzando uno spettrofluorometro. Ricalcolare la concentrazione di colorante fluorescente per il numero di molecole fluorofore utilizzando Eq (8). <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq08.jpg">(8) Dove Nx è il numero di molecole fluorofore; C è la concentrazione di colorante fluorescente; NA è la costante di Avogadro; NA = 6,02214076×1023 mol -1.</li>
	<li>Creare un grafico di dipendenza della fluorescenza media delle perline in un citometro a flusso (passo 6.2) sul numero di molecole di fluoroforo (vedi passo 6.3) per ciascun campione utilizzando qualsiasi software statistico (vedi la Tabella dei materiali). Approssimare questa dipendenza in base alla proporzionalità di linea (Analisi | Raccordo | Adatta lineare). Dall'approssimazione in Eq (9), calcolare il fattore di conversione della fluorescenza media ai siti di legame. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq09.jpg">(9) Dove MF è la fluorescenza media delle perline mediante citometria a flusso; Nx è il numero di molecole di fluoroforo per tallone; CF rappresenta il fattore di conversione della fluorescenza media in siti di legame. CF e b sono ottenuti dai risultati del montaggio del grafico per proporzionalità lineare.</li>
	<li>Calcolare il numero apparente di siti di legame per vescicola di interesse utilizzando Eq (10). <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq10.jpg">(10) dove nx è il numero apparente di siti di legame per vescicola di interesse; MF è la fluorescenza media delle vescicole di interesse mediante citometria a flusso; CF e b sono fattori di conversione dell'Eq (8).</li>
</ol>

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<li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry%3A+roles+of+geometry%2C+flow+and+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Il metodo proposto può essere adattato per una caratterizzazione approssimativa dell'interazione delle proteine con membrane fosfolipidiche provenienti da varie fonti e composizioni. La citometria quantitativa a flusso qui descritta concede alla risonanza plasmonica di superficie (SPR) in diversi parametri. In particolare, ha una sensibilità e una risoluzione temporale inferiori e richiede l'etichettatura fluorescente delle proteine. L'etichettatura fluorescente può portare a un cambiamento nella conformazione e alla per...

Le biomembrane separano il contenuto interno delle cellule animali e lo spazio extracellulare. Si noti che le membrane circondano anche le microvescicole formate durante il ciclo di vita della cellula e gli organelli. La membrana cellulare è prevalentemente composta da lipidi e proteine. Le proteine di membrana svolgono funzioni di segnalazione, strutturali, di trasporto e adesive. Tuttavia, il doppio strato lipidico è anche essenziale per l'interrelazione della cellula animale con lo spazio extracellulare. Questo documento propone un metodo per studiare l'interazione periferica delle proteine esterne con la membrana lipidica.
L'esempio più eclatante di reazioni che si verificano sullo strato esterno della membrana di una cellula animale è la reazione di coagulazione del sangue. Una caratteristica importante della coagulazione del sangue è che tutte le principali reazioni procedono sulle membrane fosfolipidiche delle cellule e delle microvescicole derivanti da queste cellule e non nel plasma 1,2,3. Le reazioni dipendenti dalla membrana includono il processo di coagulazione iniziale (sulle membrane cellulari del subendotelio, dell'endotelio infiammato o delle cellule immunitarie attivate, con la partecipazione di un fattore tissutale), tutte le reazioni della principale attivazione a cascata dei fattori IX, X, protrombina; attivazione del fattore XI da parte della trombina (sulle membrane di piastrine attivate, eritrociti, lipoproteine e microvescicole); reazioni della via della proteina C; inattivazione degli enzimi della coagulazione (sulle membrane delle cellule endoteliali con la partecipazione di cofattori di trombomodulina, recettore C della proteina endoteliale, eparan solfato); e reazioni alle vie di contatto (su membrane di piastrine e alcune microvescicole con la partecipazione di cofattori sconosciuti). Pertanto, è impossibile indagare sulla coagulazione del sangue senza studiare l'interazione di varie proteine plasmatiche con la membrana delle cellule del sangue.
Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per caratterizzare l'interazione delle proteine con le membrane lipidiche delle cellule o delle microvescicole. Questo approccio è stato inizialmente proposto per studiare l'interazione del plasma sanguigno con piastrine e vescicole fosfolipidiche artificiali. Inoltre, la maggior parte delle proteine studiate interagisce direttamente con i fosfolipidi di membrana caricati negativamente, in particolare con la fosfatidilserina 4,5. Inoltre, ci sono proteine la cui interazione con la membrana è mediata da speciali recettori6.
Un'importante capacità della citometria a flusso è la discriminazione tra ligandi liberi e legati senza separazione aggiuntiva. Questa caratteristica della citometria consente lo studio del legame di equilibrio del ligando all'endpoint e aiuta a eseguire misurazioni cinetiche continue. La tecnica non è sofisticata e non richiede una preparazione complessa del campione. La citometria a flusso viene utilizzata attivamente per studiare quantitativamente la dinamica di interazione tra peptidi fluorescenti, recettori e proteine G in neutrofili intatti e permeabili ai detergenti7. Questo approccio è applicabile anche per esplorare le interazioni proteina-DNA e la cinetica dell'attività dell'endonucleasi in tempo reale8. Nel corso del tempo, questo metodo è stato utilizzato per studiare quantitativamente le interazioni proteina-proteina ad alta affinità con le vescicole lipidiche purificate9 o, più in generale, con le proteine di membrana espresse in un sistema di espressione cellulare Sf9 altamente efficiente10. Sono stati descritti anche metodi quantitativi per caratterizzare le interazioni proteina-liposoma utilizzando la citometria a flusso per le proteine transmembrana11.
Questa tecnica utilizza perline di calibrazione autoprodotte per evitare l'uso di perline7 disponibili in commercio. Le perle di calibrazione utilizzate in precedenza7 erano destinate a funzionare con la fluoresceina, che limitava sostanzialmente l'assortimento di ligandi fluorescenti accessibili sulle proteine. Inoltre, questo documento offre un nuovo modo per acquisire e analizzare i dati cinetici per una risoluzione temporale ragionevole. Sebbene questo metodo sia descritto per le vescicole fosfolipidiche artificiali, non ci sono limitazioni evidenti per la sua adattabilità a cellule, vescicole naturali o vescicole fosfolipidiche artificiali con una diversa composizione lipidica. Il metodo qui descritto consente la stima dei parametri di interazione (kon, koff) ed equilibrio (Kd) e facilita la caratterizzazione quantitativa del numero di siti di legame proteico sulla membrana. Si noti che questa tecnica fornisce una stima approssimativa del numero di siti di associazione. I vantaggi del metodo sono la sua relativa semplicità, accessibilità e adattabilità alle cellule native e alle microvescicole naturali e artificiali.

<table><tbody><tr><td>A23187</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37573</td><td>colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Apirasi da patate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2230</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCantoII</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>Am-O332-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio, anidro, polvere, &ge; 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro a fluorescenza Cary Eclipse</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DiIC16(3) (1,1'-Dioxadecyl-3,3,3',3',3'-Tetramethylindocarbocianine Perchlorate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D384</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Sale disodico EDTA</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>Am-O105B-0.1</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>software di acquisizione dati per citometria</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Software</td> citometro a stella <td></td><td>per l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fattore umano X</td><td>Ricerca enzimatica</td><td>HFX 1010</td><td></td></tr><tr><td>Idrossilammina cloridrato</td><td>Panreac</td><td>141914.1209</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina (cervello, suino)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840053P</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilserina (cervello, suino) (sale sodico)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840032P</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini-estrusore</td><td>Avanti Lipidi polari</td><td>610020-1EA</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>Software statistico</td></tr><tr><td>Soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS) compresse, grado biotecnologico</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandina E1</td><td>Cayman Chemical</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0033-01</td><td>mezzo di filtrazione su gel per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Sepharose CL-2B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL2B300-500ML</td><td>mezzo di filtrazione su gel per la purificazione delle piastrine</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Corning</td><td>61-065-RO</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3139-250G</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di filatura con membrana 0,2 & micro; m</td><td>Sartorius</td><td>VS0171</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Nel corpo umano, la maggior parte delle principali reazioni fisiologiche coinvolte nella risposta immunitaria e nella coagulazione del sangue procedono sulle membrane delle cellule. Un primo passo importante in qualsiasi reazione dipendente dalla membrana è il legame delle proteine sulla membrana fosfolipidica. Un approccio allo studio dell'interazione proteica con le membrane lipidiche è stato sviluppato utilizzando proteine marcate fluorescentemente e citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio delle interazioni proteina-membrana utilizzando cellule vive e vescicole fosfolipidiche naturali o artificiali. Il vantaggio di questo metodo è la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. In questo metodo, le proteine sono etichettate utilizzando coloranti fluorescenti. Tuttavia, possono essere utilizzate sia proteine autoprodotte che disponibili in commercio, etichettate in modo fluorescente. Dopo la coniugazione con un colorante fluorescente, le proteine vengono incubate con una fonte della membrana fosfolipidica (microvescicole o cellule) e i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso. I dati ottenuti possono essere utilizzati per calcolare le costanti cinetiche e l'equilibrio Kd. Inoltre, è possibile stimare il numero approssimativo di siti di legame proteico sulla membrana fosfolipidica utilizzando speciali perle di calibrazione.

Il metodo di citometria a flusso qui descritto viene utilizzato per caratterizzare il legame delle proteine della coagulazione plasmatica alle piastrine attivate. Inoltre, le vescicole di fosfolipidi PS:PC 20:80 sono state applicate come sistema modello. Questo documento si concentra principalmente sulle vescicole fosfolipidiche artificiali come esempio. I parametri del citometro, in particolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) e la compensazione devono essere selezionati per ogni dispositivo specifico, l'og...

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Utilizzando questo metodo di citometria a flusso quantitativo, i ricercatori possono calcolare le abitudini cinetiche e di equilibrio dell'interazione di membrana introdotta e stimare il numero di proteine introdotte dai siti sulla membrana PPH. I vantaggi di questo metodo sono la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. Questo metodo è esclusivamente per la ricerca di base.Il protocollo è stato sviluppato per studiare le interazioni lipidiche proteiche nel calcolo del sangue e può essere utilizzato in altre aree per caratterizzare l'interazione delle proteine con varie membrane lipidiche. Il metodo può essere utilizzato per la valutazione quantitativa delle dinamiche di legame del ligando sulle varie cellule e tipi di ligando. Inizia gli esperimenti di legame cinetico diluendo le vescicole fosfolipidiche nel tampone di Tyrode a una concentrazione di un micromolare e un volume totale di 250 microlitri.Quindi mescolare il fattore X della coagulazione marcato fluorescente o FX FD e una concentrazione di 500 nanomolari con le vescicole fosfolipidiche in un rapporto uno a uno per ottenere un volume totale di 500 microlitri. Iniettare immediatamente 500 microlitri della sospensione mista nel citometro a flusso. Ad una portata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e un filtro di emissione di 585 nanometri; con una larghezza di 42 per il canale FL due.Successivamente misurare la fluorescenza media nel canale FL quattro con eccitazione a 633 nanometri e filtro di emissione a 660 nanometri con una larghezza di 20. Quando si raggiunge la saturazione del legame, diluire rapidamente il campione di 20 volte con il tampone di Tyrode e monitorare la dissociazione fino a raggiungere una fluorescenza basale o un plateau. Per esperimenti di legame all'equilibrio incubare cinque vescicole artificiali di fosfolipidi artificiali micromolari con concentrazioni variabili di FX FD da zero a 1000 nanomolari nel tampone di Tyrode per 20 minuti.Dopo l'incubazione diluire ogni campione di 20 volte a un volume finale di 200 microlitri con il tampone di Tyrode, quindi analizzare il campione diluito mediante citometria a flusso entro 30 secondi. Per analizzare i dati, esportare gli esperimenti in formato FSC dal software di acquisizione dati di citometria al software di citometro per l'analisi dei dati. Scegliendo il file e quindi facendo clic sulle schede Esporta e File FSC.una volta fatto aprire i file FCS nel software cytometer selezionando i file sul computer e trascinando i file nell'area di lavoro del programma. Per gating le microvescicole, identificare la regione delle microvescicole mediante fluorescenza del colorante lipofilo, DIC 16 tre. Quindi utilizzare il pulsante di stampa nel foglio di lavoro per creare un SSC dot plot da FL due D I C 16 in coordinate di registro.Quindi scegli il pulsante del cancello rettangolare per disegnare una regione di gating. Per analizzare gli esperimenti cinetici creare un dot plot utilizzando le coordinate di fluorescenza nel tempo per la regione delle vescicole. Successivamente, esporta i dati sulla variazione della fluorescenza nel tempo nel formato CSV; andando a scegliere il campione e facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda di esportazione, seguito dalla scelta di FL quattro volte nei parametri, seleziona la directory per il salvataggio prima di fare clic su seleziona formato CSV e premere la scheda di esportazione.Dopo il trasferimento, aprire il file CSV nel software statistico per calcolare la semplice fluorescenza della media mobile e il tempo per ogni 1000 eventi approssimare un grafico della dipendenza della singola fluorescenza della media mobile sul tempo sotto l'ipotesi della dipendenza esponenziale e utilizzare il valore per calcolare la costante di associazione cinetica utilizzando un'equazione. Quindi calcolare la costante di dissociazione cinetica utilizzando l'equazione come descritto in precedenza. Per analizzare la data del test di legame di equilibrio, determinare la fluorescenza media di FX FD nella regione delle vescicole per ogni concentrazione selezionata di FX FD e quindi approssimare la dipendenza della fluorescenza del fattore legato dalla concentrazione del fattore aggiunto nell'ipotesi del legame a sito singolo.Calcola i parametri di legame medi utilizzando un'equazione da tre ripetizioni indipendenti come minimo. Procedere alla preparazione di perline calibrate incubando piastrine filtrate in gel con calcio IANA 4A ventitré, centottantasette in presenza di cloruro di calcio millimolare 2,5 millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente. Le piastrine attivate aggiungono le varie concentrazioni di FX FD e incubano le piastrine con il due percento di formaldeide in volume.Dopo un'ora, interrompere la reazione incubando le piastrine con tre glicina molare e 5% BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi purificare la miscela dal colorante non reagito con centrifugazione a 400 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernato prima di riutilizzare il pellet nel tampone di Tyrode contenente lo 0,5% di BSA.Quindi, misurare il livello di fluorescenza delle perle di calibrazione in ciascun campione utilizzando uno spettrofluorometro e quindi utilizzando il citometro a flusso. Determinare il numero di perline in ciascun campione con l'aiuto di un contatore di celle. Convertire l'intensità di fluorescenza di ciascun rispettivo campione di perline nella concentrazione di colorante fluorescente solubile utilizzando uno spettrofluorometro e ricalcolare la concentrazione di colorante fluorescente per il numero di molecole dello spettrofluorometro.Creare un grafico di dipendenza della fluorescenza media delle perline in un citometro a flusso sul numero di molecole di fluroforo per ciascun campione. Quindi approssimare la dipendenza in base alla proporzionalità della linea utilizzando il raccordo di analisi e adattare le linguette lineari in ordine. Dall'approssimazione nell'equazione, calcolare il fattore di conversione della fluorescenza media ai siti di legame.Successivamente calcolare il numero apparente dei siti di legame per vescicola di interesse. L'analisi rappresentativa mostra il gating delle vescicole lipidiche artificiali al fosforo che hanno una dimensione di un micrometro con il colorante fluorescente lipofilo incorporato, colorante I C 16, il gate è stato impostato sulla base di un campione contenente vescicole lipidiche artificiali della stessa dimensione senza il colorante fluorescente. La cinetica del legame proteico alle vescicole è stata analizzata nella prima fase raccogliendo il campione in modo continuo.I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando la citometria a flusso. Le misurazioni citometriche a flusso dovrebbero iniziare il prima possibile dopo aver miscelato le soluzioni e diluito con il tampone di Tyrode. Il metodo proposto potrebbe essere integrato con la risonanza plasmatica di superficie per lo studio delle interazioni di membrana che è altamente sensibile con una buona risoluzione temporanea e non richiede la consegna portata Il principale vantaggio di questo metodo è la sua accessibilità e semplicità.

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Questo video discute il test di perdita di fluorescenza per studiare le interazioni dei peptidi che penetrano nelle cellule con le membrane cellulari utilizzando imitatori della membrana cellulare: grandi vescicole unilamellari, o LUV, incapsulate con un colorante fluorescente e un quencher.

Saggio di perdita di fluorescenza per studiare l'interazione del peptide che penetra nelle cellule con la membrana

In questo video, dimostriamo l'interazione tra proteine e vescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa. Il legame delle proteine marcate con fluorescenza alle vescicole fosfolipidiche marcate con fluorescenza aumenta l'intensità media della fluorescenza, e questo aumento viene rilevato da un citometro a flusso.

Citometria a flusso quantitativa per studiare le interazioni tra vescicole proteina e fosfolipidi marcate

In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l'utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l'antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l'analisi di citometria a flusso a valle.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Scopri la citometria a flusso quantitativa per caratterizzare le interazioni proteina-membrana lipidica. Questo metodo semplice calcola le costanti cinetiche ed equilibrio per la ricerca di base in biochimica.

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Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

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