Name: Applicazione dellinterferenza dellRNA nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Scopri il metodo di RNAi per lo studio della funzione genica nel nematode Bursaphelenchus xylophilus. Questa tecnica di immersione in dsRNA permette di osservare cambiamenti fenotipici e supporta la ricerca sul controllo biologico.

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Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) e finanziata congiuntamente dal Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).

Lo studio è stato approvato dal consiglio per la sperimentazione animale della Zhejiang Agricultural & Forestry University. L'isolato di B. xylophilus NXY61 è stato originariamente estratto da un Pinus massoniana malato nell'area di Ningbo della provincia di Zhejiang, Cina11.
1. Clonazione genica
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sui primer utilizzati in questo protocollo.
<ol><li>Raccogli i nematodi.<ol><li>Coltura del ceppo di B. xylophilus sul micelio di Botrytis cinerea su piastre di destrosio di patate (PDA) a 25 °C per 3-5 giorni.</li>
		<li>Raccogliere i nematodi utilizzando il metodo dell'imbuto di Bellman14.<ol><li>Posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e posizionare due strati di carta da filtro nella bocca dell'imbuto. Trasferire le colture fungine nell'imbuto e aggiungere acqua per immergere il tappeto fungino. Attendere 2 ore, quindi raccogliere i nematodi.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Estrarre l'RNA totale dai nematodi utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA totale (vedere la Tabella dei materiali)11 secondo i seguenti passaggi.<ol><li>Aggiungere 500 μL di reagente di estrazione e 100 μL di sfere magnetiche in una provetta da centrifuga da 2 ml. Aspirare 20 μL dei nematodi e trasferire il campione in una smerigliatrice per macinare a 9.000 × g per 30 s. Incubare per 5 minuti e quindi centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g e 4 °C.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 100 μL di cloroformio, tappare il tubo e mescolare capovolgendo il tubo più volte. Incubare per 3 minuti e quindi centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 250 μL di alcool isopropilico e vortice vigorosamente. Centrifugare a 12.000 × g per 10 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante. Aggiungere 500 μL di etanolo al 75% per lavare l'RNA e quindi vortice il campione. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 × g e 4 °C.</li>
		<li>Asciugare all'aria il pellet di RNA per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 30 μL di acqua priva di RNasi.</li>
		<li>Calcolare la concentrazione di RNA usando la formula: A260 × diluizione × 40 = μg RNA/mL. Calcolare il rapporto A260/A280. NOTA: un rapporto di ~ 2 è considerato puro.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la trascrizione inversa di RNA di buona qualità per ottenere il modello di cDNA.<ol><li>Progettare e utilizzare una coppia di primer specifici, ppm-1-F/R (vedere la Tabella dei Materiali), per amplificare la sequenza codificante parziale del gene Bx-ppm-1 in B. xylophilus (GenBank accession number QTZ96795). </li>
		<li>Clonare le sequenze geniche ppm-1 nel vettore pGEM-Teasy contenente il promotore T7 seguendo un protocollo di clonazione standard11.<ol><li>Impostare le reazioni PCR come segue: 2 μL di cDNA, 25 μL di 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL di ciascun primer (10 pmol/l) e acqua distillata sterile fino a un volume finale di 50 μL.</li>
			<li>Eseguire la procedura di amplificazione come segue: 5 min a 94 °C; seguiti da 35 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C; e una fase di estensione finale a 72 °C per 5 min.</li>
			<li>Clonare i prodotti amplificati in un vettore pGEM-T Easy per il sequenziamento.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Sintesi di dsRNA
<ol><li>Preparare il modello di DNA per la sintesi di dsRNA utilizzando PCR con primer progettati per aggiungere siti di promotori T7 ad entrambe le estremità. Aggiungere la sequenza del promotore T7 all'estremità 5' dei primer.</li>
	<li>Utilizzare il plasmide contenente il frammento del gene ppm-1 (894 bp) come modello per la PCR e recuperare il frammento contenente il promotore T711. Utilizzare la procedura e il sistema PCR descritti sopra.</li>
	<li>Utilizzare un kit di trascrizione in vitro per sintetizzare dsRNA11.<ol><li>Scongelare i reagenti congelati sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 2 μL di tampone di reazione 10x, 2 μL di miscela enzimatica e 1 μg di DNA in una provetta da centrifuga. Aggiungere acqua priva di nucleasi per produrre una reazione standard di 4 μL. Quindi, mescolare volumi uguali delle quattro soluzioni di ribonucleotide (ATP, CTP, GTP e UTP) insieme e aggiungere 8 μL della miscela al tubo. Mescolare accuratamente e incubare a 37 °C per 4 ore.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL di DNasi, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Interrompere la reazione e aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi e 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl per precipitare l'RNA. Mescolare accuratamente. Incubare a -20 °C durante la notte.</li>
		<li>Centrifugare per 15 minuti a 12.000 × g e 4 °C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 ml di etanolo al 75% per lavare l'RNA. Vortice il campione e centrifugarlo per 10 minuti a 12.000 × g e 4 °C.</li>
		<li>Asciugare all'aria il pellet di RNA per 3 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 30 μL di acqua priva di RNasi.</li>
		<li>Analizzare la qualità del dsRNA utilizzando uno spettrofotometro. Pipettare 1 μL del campione di dsRNA sul piedistallo di misurazione e impostare la lunghezza d'onda su 340 nm. Visualizza i prodotti su un gel di agarosio all'1,0%.</li>
	</ol></li>
</ol>3. RNAi mediante ammollo
<ol><li>Mescolare 4 μL di tampone di ammollo 5x (0,05% gelatina, 5,5 mM KH 2 PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4 Cl, 3 mM spermidina) con dsRNA eddH2O per produrre un volume totale di 20 μLe una concentrazione finale di RNA di 0,8 μg/ml.</li>
	<li>Acquisire larve J2.<ol><li>Raccogliere i nematodi dalle colture fungine e trasferirli in una capsula di Petri di vetro di 6 cm di diametro. Aggiungere 10 ml di acqua al piatto per assicurarsi che i nematodi possano nuotare liberamente. Tenere i nematodi nel piatto per 30 minuti e attendere che le uova aderiscano al fondo.</li>
		<li>Rimuovere con cura l'acqua e i nematodi, facendo attenzione a non disturbare le uova. Ripeti i passaggi fino a quando tutte le larve e gli adulti vengono rimossi, lasciando solo le uova nel piatto.</li>
		<li>Covare le uova raccolte per 24 ore al buio a 25 °C per ottenere larve J2. Raccogliere le larve J2, metterle in un tubo e lavarle tre volte con ddH2O per l'esperimento RNAi15.</li>
		<li>Trasferire le larve J2 nel tubo da 2 mL contenente la soluzione di dsRNA e aggiungere la soluzione di resorcinolo (avvolta in carta stagnola e sciolta in acqua) per produrre una concentrazione finale dell'1,0%. Incubare le larve con centrifugazione a 15 × g su tavola vibrante per 24 ore a 25 °C per garantire che le larve assorbano efficacemente il dsRNA.</li>
		<li>Immergere la stessa quantità di nematodi nel tampone di ammollo senza la sonda dsRNA o con una sonda dsRNA GFP come controllo. Utilizzare il gene GFP (gfp, M62653.1) come controllo non endogeno e sintetizzare il dsRNA di gfp usando primer gene-specifici T7-GFP-F/R.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Rilevamento qPCR
<ol><li>Pulire le larve J2 con ddH2O, comprese quelle con interferenza genica bersaglio, interferenza genica GFP e gruppo di controllo indisturbato. Estrarre gli RNA totali da ciascun gruppo utilizzando il metodo sopra descritto.</li>
	<li>Avviare la qPCR.<ol><li>Progettare i primer q-ppm-1-F/R utilizzando il software desiderato (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Impostare la reazione qPCR in 12 μL contenenti 1 μL di cDNA, 6 μL di premiscela fluorescente, 0,4 μL di ciascun primer (10 pmol/l) e acqua distillata sterile.</li>
		<li>Eseguire la qPCR come segue: 2 min a 95 °C; seguiti da 40 cicli di 10 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C.</li>
		<li>Utilizzare il gene actb (GenBank accession number EU100952) e il gene tbb-2 (GenBank accession number MT769316), o altri geni, come geni di riferimento interni per valutare i cambiamenti nel livello di espressione genica dopo RNAi15.</li>
	</ol></li>
	<li>In base al valore della soglia del ciclo (Ct) e alla curva di dissoluzione, utilizzare il metodo 2-ΔΔCt per stimare il livello di espressione relativa del gene bersaglio e verificare l'efficienza di interferenza.<ol><li>Sottrarre il valore Ct del gene di riferimento interno di ciascun campione dal valore Ct del gene bersaglio per ottenere il valore ΔCt. Quindi, sottrarre il valore ΔCt del gruppo di interferenza dal valore ΔCt del gruppo di controllo per ottenere il valore ΔΔCt. NOTA: un valore ΔΔCt maggiore di 0 indica che l'interferenza è efficace.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Valutare la lunghezza corporea degli adulti nematodi dopo RNAi
<ol><li>Dopo RNAi, coltivare le larve J2 fino all'età adulta su prati di B. cinerea in piastre PDA per 60 ore a 25 °C15.</li>
	<li>Raccogliere gli adulti usando il metodo dell'imbuto di Bellman (vedi passo 1.1.2.1)14.</li>
	<li>Acquisire immagini dei nematodi adulti al microscopio e utilizzare il software ImageJ (o altro software di misurazione) per misurare le lunghezze corporee.<ol><li>Misurare la lunghezza utilizzando ImageJ selezionando Analizza | Imposta scala. Se la distanza è nota, immettere il valore di lunghezza della linea retta disegnata. Immettere l'unità di lunghezza.</li>
		<li>Selezionare la casella di controllo Globale (utilizzare questo standard per tutte le immagini) e fare clic su OK per selezionare la lunghezza da misurare con una linea retta sull'immagine da misurare.</li>
		<li>Utilizzare il comando Ctrl+M (misurazione) per visualizzare i risultati e registrarli nella finestra dei risultati .</li>
	</ol></li>
	<li>Effettuare misurazioni di 50 nematodi maschi e 50 femmine per analisi statistiche12.</li>
	<li>Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Confronta le medie dei campioni dei diversi gruppi usando il t-test dello studente.</li>
</ol>

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<li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+gene+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li>
<li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li>
<li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+insect-resistant+plants%3A+RNAi-mediated+crop+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li>
</ol>

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Sebbene la storia della vita e l'ambiente parassitario di B. xylophilus siano diversi da quelli di altri nematodi, c'è stata una ricerca limitata sulla patogenesi molecolare di questo patogeno vegetale. Nonostante i grandi progressi compiuti nell'applicazione della tecnologia di modifica del genoma CRISPR / Cas9 in C. elegans e altri nematodi, solo la tecnologia RNAi applicata a B. xylophilus è stata pubblicata fino ad oggi17. RNAi è uno degli strumenti più potenti dispo...

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Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

I nematodi parassiti delle piante (PPN) sono una minaccia continua per la sicurezza alimentare e gli ecosistemi forestali. Causano circa 100 miliardi di dollari di perdite economiche ogni anno1, i più problematici dei quali sono principalmente i nematodi a nodo radicale, i nematodi a cisti e i nematodi di pino. Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è un nematode endoparassitario migratore, che è l'agente patogeno causale della malattia dell'avvizzimento del pino2. Ha causato gravi danni alle foreste di pini in tutto il mondo3. Usando la terminologia di Van Megen et al.4, B. xylophilus è un membro dei Parasitaphelenchidae e appartiene al clade 10, mentre la maggior parte degli altri principali parassiti delle piante appartengono al clade 12.
Come parassita vegetale indipendente e recentemente evoluto, B. xylophilus è un modello attraente per studi comparativi. Ad oggi, ci sono state ricerche sostanziali sui nematodi a nodo radicale e sui nematodi a cisti appartenenti al clade 12, che sono endoparassiti sedentari obbligati e sono alcuni dei nematodi più intensamente studiati. Tuttavia, condurre ulteriori ricerche in questo importante settore comporta una grande sfida: la funzione dei geni del parassitismo è un collo di bottiglia della ricerca. Gli studi funzionali generalmente includono esperimenti di espressione ectopica e knockdown / out, ma si basano su protocolli di trasformazione genetica efficaci per il nematode. Di conseguenza, la genetica inversa nei PPN si basa quasi esclusivamente sul silenziamento genico da parte dell'RNAi.
L'RNAi, un meccanismo ampiamente presente nelle cellule eucariotiche, silenzia l'espressione genica introducendo RNA a doppio filamento (dsRNA)5. Ad oggi, il meccanismo di silenziamento genico posttrascrizionale indotto dal dsRNA è stato trovato in tutti gli eucarioti studiati e la tecnologia RNAi, come strumento di ricerca sulla genomica funzionale e altre applicazioni, si è sviluppata rapidamente in molti organismi. Dalla scoperta del meccanismo RNAi in Caenorhabditis elegans nel 19986, le tecniche RNAi sono diventate metodi efficaci per identificare la funzione genica dei nematodi e sono proposte come un nuovo modo per controllare efficacemente i nematodi patogeni7.
L'RNAi è tecnicamente facile: può essere sufficiente immergere i giovani nel dsRNA; Tuttavia, l'efficacia e la riproducibilità di questo approccio variano ampiamente con le specie di nematodi e il gene bersaglio8. Il silenziamento di 20 geni coinvolti nelle vie RNAi del nematode nodo radicale, Meloidogyne incognita, è stato studiato utilizzando lunghi dsRNA come trigger, con conseguente risposte diverse, tra cui un aumento e nessun cambiamento nell'espressione di alcuni geni9. Questi risultati mostrano che i geni bersaglio possono rispondere al knockdown dell'RNAi in modo diverso, rendendo necessaria una valutazione esaustiva della loro idoneità come bersagli per il controllo dei nematodi tramite RNAi. Tuttavia, c'è attualmente una scarsità di ricerca sulla biologia dello sviluppo e della riproduzione di B. xylophilus.
Come continuazione del precedente lavoro10,11,12,13, descriviamo qui un protocollo per applicare RNAi per studiare la funzione del gene ppm-1 di B. xylophilus, compresa la sintesi di dsRNA, l'ammollo neurostimolante sintetico e il rilevamento della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Le conoscenze acquisite da questo approccio sperimentale contribuiranno probabilmente notevolmente alla comprensione dei sistemi biologici di base e alla prevenzione della malattia dell'avvizzimento del pino.

<table><tbody><tr><td>Imbuto Baermann</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>per isolare i nematodi</td></tr><tr><td>Beacon Designer 7.9</td><td>Shanghai Kangyusheng Information Technology Co.</td><td>n/a</td><td>per progettare primer qPCR</td></tr><tr><td>Botrytis cinerea</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>come alimento per i nematodi</td></tr><tr><td>Bursaphelenchus xylophilus</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>il suo numero era NXY61 ed era stato originariamente estratto da Pinus massoniana malato a Ningbo, provincia di Zhejiang, Cina.</td></tr><tr><td>Incubatore a temperatura costante</td><td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.</td><td>H1703544</td><td>A Cultur Nematodi</td></tr><tr><td>Apparecchiature di elettroforesi</td><td>Laboratori Bio-Rad</td><td>1704466</td><td>per ottenere l'analisi elettroforetica</td></tr><tr><td>Etanolo, 75%</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>80176961</td><td>estrarre l'RNA</td></tr><tr><td>Premix Ex Taq Polimerasi</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR030A</td><td>per PCR</td></tr><tr><td>Premix Ex Taq Polimerasi</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR390A</td><td>per PCR</td></tr><tr><td>Imager gel</td><td>LongGene Scientific Instruments Co.</td><td>LG2020</td><td>rendere visibili le bande degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Prism</td><td>n/a</td><td>analizzare i dati e fare i dati</td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Hangzhou Allsheng Instruments Co.</td><td>AS0813000</td><td>centrifuga</td></tr><tr><td>Molatore di tessuto ad alto flusso</td><td>Bertin</td><td></td><td>estrarre l'RNA</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Istituti Nazionali di Salute</td><td>n/a</td><td>per misurare le lunghezze del corpo</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.</td><td>L1909022</td><td>estrarre l'RNA</td></tr><tr><td>Microscopio Leica DM4B</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td>per osservare i nematodi</td></tr><tr><td>Perle magnetiche</td><td>Aoran Science Technology Co.</td><td>150010C</td><td>estrarre l'RNA</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione ad alta resa MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>AM1333</td><td>per sintetizzare dsRNA in vitro</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop ND-2000</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>NanoDrop 2000/2000C</td><td>analizzare la qualità del dsRNA</td></tr><tr><td>Amplificatore PCR</td><td>Bio-Rad Life Medical Products Co.</td><td>1851148</td><td>per amplificare la sequenza degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>A Cultur Nematodi</td></tr><tr><td>Vettore facile pGEM-T</td><td>Promega Corporation</td><td>A1360</td><td>per la clonazione</td></tr><tr><td>Patata Destrosio Agar (Medio)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>to cultur Botrytis cinerea</td></tr><tr><td>Kit reagente Prime Script RT con gomma gDNA</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR047B</td><td>a cDNA sintetico</td></tr><tr><td>Primer Premier 5.0</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>n/a</td><td>progettare primer per PCR</td></tr><tr><td>Primer: PPM-1-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ATTATTCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>Thermal cycler in tempo reale&nbsp; qTOWER 2.2</td><td>Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.</td><td></td><td>per la qPCR</td></tr><tr><td>Tavolo che scuote</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co.</td><td></td><td>per immergere i nematodi</td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Chongqing Optec Instrument Co.</td><td>1814120</td><td>per osservare i nematodi</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Promotore T7</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>TAATACGACTCACTATAGGG</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA in gel di agarosio Takara MiniBEST</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>9762</td><td>per recuperare il DNA</td></tr><tr><td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR820A</td><td>per la qPCR</td></tr><tr><td>tricloroetano</td><td>Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.</td><td></td><td>estrarre l'RNA</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>15596026</td><td>reagente totale di estrazione di RNA, per estrarre RNA</td></tr></tbody></table>

applicazione dell'interferenza dell'rna nel nematode del pino, bursaphelenchus xylophilus

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è una delle specie invasive più distruttive in tutto il mondo, causando l'avvizzimento e la morte finale dei pini. Nonostante il riconoscimento della loro importanza economica e ambientale, è stato finora impossibile studiare le funzioni genetiche dettagliate dei nematodi parassiti delle piante (PPN) utilizzando la genetica convenzionale e i metodi transgenici. Tuttavia, come tecnologia di genetica inversa, l'interferenza dell'RNA (RNAi) facilita lo studio dei geni funzionali dei nematodi, incluso B. xylophilus. 
Questo articolo delinea un nuovo protocollo per l'RNAi del gene ppm-1 in B. xylophilus, che è stato segnalato per svolgere ruoli cruciali nello sviluppo e nella riproduzione di altri nematodi patogeni. Per l'RNAi, il promotore T7 è stato collegato al 5′-terminale del frammento bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'RNA a doppio filamento (dsRNA) è stato sintetizzato mediante trascrizione in vitro . Successivamente, la consegna del dsRNA è stata realizzata immergendo i nematodi in una soluzione di dsRNA mescolata con neurostimolanti sintetici. I giovani sincronizzati di B. xylophilus (circa 20.000 individui) sono stati lavati e immersi in dsRNA (0,8 μg/ml) nel tampone di ammollo per 24 ore al buio a 25 °C.
La stessa quantità di nematodi è stata posta in un tampone di ammollo senza dsRNA come controllo. Nel frattempo, un'altra quantità identica di nematodi è stata posta in un tampone di ammollo con il gene della proteina fluorescente verde (gfp) dsRNA come controllo. Dopo l'immersione, il livello di espressione delle trascrizioni target è stato determinato utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale. Gli effetti dell'RNAi sono stati poi confermati utilizzando l'osservazione microscopica dei fenotipi e un confronto delle dimensioni corporee degli adulti tra i gruppi. L'attuale protocollo può aiutare a far progredire la ricerca per comprendere meglio le funzioni dei geni di B. xylophilus e di altri nematodi parassiti verso lo sviluppo di strategie di controllo attraverso l'ingegneria genetica.

Analisi dell'espressione ppm-1 di B. xylophilus dopo RNAi Il livello di espressione relativa del gene ppm-1 di B. xylophilus imbevuto di dsRNA GFP e di quello imbevuto di dsRNA del gene bersaglio era rispettivamente 0,92 e 0,52 (il livello di espressione genica ppm-1 del gruppo di controllo trattato con ddH2O era impostato su 1) (Figura 1). Pertanto,...

Qui, introduciamo un metodo dettagliato di ammollo dell'interferenza dell'RNA in Bursaphelenchus xylophilus per facilitare lo studio delle funzioni geniche.

Applicazione dell'interferenza dell'RNA nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

L'RNAi è diventato un metodo efficace per identificare la funzione dei geni nei nematodi e viene proposto come un nuovo modo per controllare efficacemente i nematodi patogeni. RNAi sta immergendo i nematodi in dsRNA può essere sufficiente per la procedura. Per iniziare, raccogli i nematodi con il metodo dell'imbuto Baermann.Per questo, posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e posizionare due strati di carta da filtro nella bocca dell'imbuto. Trasferire le colture fungine di Botrytis cinerea nell'imbuto e aggiungere acqua per immergere il tappeto fungino. Quando vengono raccolti i nematodi, aggiungere 500 microlitri di reagente di estrazione e 100 microlitri di sfere magnetiche in una provetta da centrifuga da due millilitri.Aspirare 20 microlitri di nematodi e macinare i campioni a 9.000 x g per 30 secondi. Incubare per cinque minuti e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca.Aggiungere 100 microlitri di cloroformio e mescolare capovolgendo più volte il tubo. Incubare per tre minuti e quindi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Anche in questo caso, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca.Aggiungere 250 microlitri di alcool isopropilico e vortice vigorosamente. Centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti e vortice. Scartare il surnatante e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% per lavare l'RNA.Vortice il campione seguito da centrifugazione a 12.000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Asciugare all'aria il pellet di RNA per cinque minuti e risospenderlo in 30 microlitri di acqua priva di RNasi. Calcolare la concentrazione di RNA utilizzando questa formula e calcolare il rapporto tra A260 e A280.Quindi, utilizzare una coppia di primer per amplificare la sequenza codificante parziale del gene BX ppm-1 dal B.xylophilus. Quindi clonare le sequenze di gene ppm-1 in un vettore pGEM-T Easy contenente il promotore T7. Recuperare il frammento di gene ppm-1 lungo 894 coppie di basi utilizzando il plasmide clonato come modello per la pcr.Quindi, utilizzare un kit di trascrizione in vitro per sintetizzare il dsRNA. Analizzare la qualità del dsRNA utilizzando uno spettrofotometro e visualizzare i prodotti su un gel di agarosio all'1%. Aggiungere quattro microlitri di tampone di ammollo 5X e portare il volume a 20 microlitri con acqua distillata doppia per ottenere una concentrazione finale di RNA di 0,8 microgrammi per millilitro.Quindi posizionare i nematodi nel piatto per 30 minuti e attendere che le uova aderiscano al fondo. Rimuovere con attenzione l'acqua e i nematodi senza disturbare le uova fino a quando solo le uova rimangono nel piatto. Schiudere le uova raccolte al buio a 25 gradi Celsius per 24 ore per ottenere larve J2.Raccogliere le larve in un tubo e lavarle tre volte con acqua distillata doppia. Quindi, trasferire le larve nel tubo contenente la soluzione di dsRNA. A questo, aggiungere la soluzione di resorcinolo per ottenere una soluzione all'1%.Posizionare le larve su un tavolo vibrante per garantire un sufficiente assorbimento di dsRNA nelle larve. Per i controlli, immergere la stessa quantità di nematodi nel tampone di ammollo senza la sonda dsRNA o con una sonda dsRNA GFP. Eseguire una qPCR utilizzando i geni actB e tbb-2 come riferimenti interni per valutare i cambiamenti nel livello di espressione genica.Utilizzare il metodo delta delta Ct per stimare il livello di espressione genica relativa dalla curva di dissoluzione e dal valore Ct. Dopo RNAi, coltura delle larve J2 fino all'età adulta su prati di Botrytis cinerea su piastre PDA. Raccogliere gli adulti utilizzando il metodo dell'imbuto Baermann come mostrato nella prima sezione.Acquisire immagini dei nematodi adulti al microscopio e utilizzare il software ImageJ per misurare la lunghezza corporea di 50 nematodi maschi e 50 femmine. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Applicare il test Student t per confrontare le medie dei campioni dei diversi gruppi.L'analisi dell'espressione genica relativa dopo RNAi ha indicato che il dsRNA ppm-1 può inibire efficacemente l'espressione del gene ppm-1 di B.Xylophilus. Mentre il dsRNA esogeno GFP non ha avuto alcun effetto sull'espressione di ppm-1. Dopo RNAi, le dimensioni degli adulti sono diminuite notevolmente nonostante il raggiungimento della maturità sessuale, con conseguente fenotipo mutante di piccole dimensioni corporee.La lunghezza corporea media delle femmine e dei maschi mutanti era di 544 e 526 micrometri rispetto ai 971 e 912 micrometri del gruppo di controllo La cosa più importante è trasferire i nematodi nella soluzione di RNA a doppio filamento e aggiungere un altro reagente per stimolare i nematodi a nutrirsi. Questo metodo è adatto per lo screening genetico su larga scala ed è comunemente usato nella ricerca cellulare. Lo studio della funzione genica di B.Xylophilus con questo metodo ha un valore guida per il controllo biologico di B.Xylophilus.

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