Applicazione dell'interferenza dell'RNA nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

L’RNAi è diventato un metodo efficace per identificare la funzione dei geni nei nematodi e viene proposto come un nuovo modo per controllare efficacemente i nematodi patogeni. RNAi sta immergendo i nematodi in dsRNA può essere sufficiente per la procedura. Per iniziare, raccogli i nematodi con il metodo dell’imbuto Baermann.

Per questo, posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e posizionare due strati di carta da filtro nella bocca dell’imbuto. Trasferire le colture fungine di Botrytis cinerea nell’imbuto e aggiungere acqua per immergere il tappeto fungino. Quando vengono raccolti i nematodi, aggiungere 500 microlitri di reagente di estrazione e 100 microlitri di sfere magnetiche in una provetta da centrifuga da due millilitri.

Aspirare 20 microlitri di nematodi e macinare i campioni a 9.000 x g per 30 secondi. Incubare per cinque minuti e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca.

Aggiungere 100 microlitri di cloroformio e mescolare capovolgendo più volte il tubo. Incubare per tre minuti e quindi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Anche in questo caso, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca.

Aggiungere 250 microlitri di alcool isopropilico e vortice vigorosamente. Centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti e vortice. Scartare il surnatante e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% per lavare l’RNA.

Vortice il campione seguito da centrifugazione a 12.000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Asciugare all’aria il pellet di RNA per cinque minuti e risospenderlo in 30 microlitri di acqua priva di RNasi. Calcolare la concentrazione di RNA utilizzando questa formula e calcolare il rapporto tra A260 e A280.

Quindi, utilizzare una coppia di primer per amplificare la sequenza codificante parziale del gene BX ppm-1 dal B.xylophilus. Quindi clonare le sequenze di gene ppm-1 in un vettore pGEM-T Easy contenente il promotore T7. Recuperare il frammento di gene ppm-1 lungo 894 coppie di basi utilizzando il plasmide clonato come modello per la pcr.

Quindi, utilizzare un kit di trascrizione in vitro per sintetizzare il dsRNA. Analizzare la qualità del dsRNA utilizzando uno spettrofotometro e visualizzare i prodotti su un gel di agarosio all’1%. Aggiungere quattro microlitri di tampone di ammollo 5X e portare il volume a 20 microlitri con acqua distillata doppia per ottenere una concentrazione finale di RNA di 0,8 microgrammi per millilitro.

Quindi posizionare i nematodi nel piatto per 30 minuti e attendere che le uova aderiscano al fondo. Rimuovere con attenzione l’acqua e i nematodi senza disturbare le uova fino a quando solo le uova rimangono nel piatto. Schiudere le uova raccolte al buio a 25 gradi Celsius per 24 ore per ottenere larve J2.

Raccogliere le larve in un tubo e lavarle tre volte con acqua distillata doppia. Quindi, trasferire le larve nel tubo contenente la soluzione di dsRNA. A questo, aggiungere la soluzione di resorcinolo per ottenere una soluzione all’1%.

Posizionare le larve su un tavolo vibrante per garantire un sufficiente assorbimento di dsRNA nelle larve. Per i controlli, immergere la stessa quantità di nematodi nel tampone di ammollo senza la sonda dsRNA o con una sonda dsRNA GFP. Eseguire una qPCR utilizzando i geni actB e tbb-2 come riferimenti interni per valutare i cambiamenti nel livello di espressione genica.

Utilizzare il metodo delta delta Ct per stimare il livello di espressione genica relativa dalla curva di dissoluzione e dal valore Ct. Dopo RNAi, coltura delle larve J2 fino all’età adulta su prati di Botrytis cinerea su piastre PDA. Raccogliere gli adulti utilizzando il metodo dell’imbuto Baermann come mostrato nella prima sezione.

Acquisire immagini dei nematodi adulti al microscopio e utilizzare il software ImageJ per misurare la lunghezza corporea di 50 nematodi maschi e 50 femmine. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Applicare il test Student t per confrontare le medie dei campioni dei diversi gruppi.

L’analisi dell’espressione genica relativa dopo RNAi ha indicato che il dsRNA ppm-1 può inibire efficacemente l’espressione del gene ppm-1 di B.Xylophilus. Mentre il dsRNA esogeno GFP non ha avuto alcun effetto sull’espressione di ppm-1. Dopo RNAi, le dimensioni degli adulti sono diminuite notevolmente nonostante il raggiungimento della maturità sessuale, con conseguente fenotipo mutante di piccole dimensioni corporee.

La lunghezza corporea media delle femmine e dei maschi mutanti era di 544 e 526 micrometri rispetto ai 971 e 912 micrometri del gruppo di controllo La cosa più importante è trasferire i nematodi nella soluzione di RNA a doppio filamento e aggiungere un altro reagente per stimolare i nematodi a nutrirsi. Questo metodo è adatto per lo screening genetico su larga scala ed è comunemente usato nella ricerca cellulare. Lo studio della funzione genica di B.Xylophilus con questo metodo ha un valore guida per il controllo biologico di B.Xylophilus.