Preparazione del campione per l'analisi rapida dei lipidi nel cervello della Drosophila utilizzando la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice

La spettrometria Maldi MS è uno strumento consolidato e utile per identificare e visualizzare l'abbondanza e la distribuzione dei lipidi, senza eccessive modifiche del campione. Il vantaggio principale dell'imaging Maldi è la sua capacità di rilevare i lipidi in situ senza etichettatura e analizzare contemporaneamente un'ampia popolazione di campioni. La pratica rende perfetti.

Assicurati di esercitarti bene prima di elaborare i campioni sperimentali reali. Ridurre al minimo il tempo di preparazione del campione ed evitare la contaminazione durante tutta la procedura. Per iniziare, aggiungere la temperatura di taglio ottimale o OCT in un criomold di plastica a metà della profondità dello stampo criogenico evitando la formazione di bolle.

Lasciare lo stampo su una superficie piana per alcuni minuti e poi trasferirlo su ghiaccio secco. Mantenere il criomold piatto sul ghiaccio secco e lasciare che l'OCT formi una superficie piatta e uniforme. Attendere che lo Strumento di personalizzazione di Office sia completamente solidificato nello stampo.

Utilizzare immediatamente gli stadi OCT congelati o conservarli a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver anestetizzato le mosche adulte Usando anidride carbonica, preparare una capsula di Petri contenente un pezzo di salvietta da laboratorio. Utilizzare acqua per inumidire parte della salvietta per ridurre l'elettricità statica.

Tenere la salvietta mezza bagnata e metà asciutta. Dopo aver tagliato la testa della mosca sotto un cannocchiale da dissezione, raccogliere da quattro a cinque teste e metterle sull'area asciutta della salvietta da laboratorio. Prendi lo stadio OCT dal ghiaccio secco al microscopio due.

Trasferire immediatamente le testine nella fase OCT e disporle rapidamente, il che richiede circa 30-60 secondi per evitare la fusione dell'OCT. Lasciare circa un millimetro di spazio vuoto attorno a ciascun cervello di mosca per garantire un supporto adeguato dall'OCT e da quattro a cinque millimetri di spazio vuoto dal bordo del blocco per fornire spazio adeguato per gestire la sezione. Rimetti lo stadio OCT sul ghiaccio secco e lascialo riposare per circa tre minuti per assicurarti che lo stadio OCT rimanga congelato e solido.

Dopo che tutte le teste di mosca sono allineate, lasciare riposare lo stadio OCT sul ghiaccio secco per altri cinque o 10 minuti. Trasferire lo stadio OCT dal ghiaccio secco a una superficie piana e quindi aggiungere rapidamente una grande quantità di composto OCT per coprire tutti i campioni e riempire l'intero criostampo, che richiede circa tre secondi. Trasferire immediatamente il criomold nel ghiaccio secco e congelare l'intero blocco OCT contenente i tessuti incorporati.

Lasciare riposare lo stadio OCT sul ghiaccio secco per altri cinque o 10 minuti. Etichettare i campioni sul margine del criomold e conservare i campioni congelati a meno 80 gradi Celsius fino al momento della sezionazione. Confermare il lato codificato ITO testando la conduttività delle guide ITO utilizzando un voltmetro impostato su resistenza.

Contrassegnare il lato con una misurazione della resistenza come lato a cui aderire il tessuto. Etichettarlo e impostare sempre una salvietta da laboratorio sul fondo del vetrino per evitare la contaminazione del vetrino. Quindi, lasciare che i tessuti si equilibrino nella camera del criostato per 30-45 minuti.

Pulire il criostato, preferibilmente con etanolo al 70%. Pulire la piastra del rotolo nello stage e rimuovere le lame utilizzate. Utilizzare salviette pulite aggiuntive per assicurarsi che l'etanolo sia evaporato e che tutte le superfici siano asciutte prima dell'inizio del sezionamento.

Quindi, regolare la temperatura della testa del campione di sabbia della camera del criostato in base al tipo di tessuto. Montare il tessuto sul portacampioni utilizzando OCT. Fare attenzione a utilizzare abbastanza OCT per coprire la base del blocco OCT e montare il blocco il più piatto possibile.

Posiziona una lama pulita sul palco e bloccala. Posizionare la testa del provino verso il palcoscenico secondo necessità per ottenere l'angolo di taglio desiderato. Quindi iniziare il taglio in sezioni spesse fino a trovare la regione di interesse.

Spazzola costantemente i pezzi extra con un pennello d'artista pre-raffreddato per mantenere pulito il palco. Regolare leggermente la temperatura della camera secondo necessità e modificare lo spessore delle sezioni da 10 a 12 micrometri una volta raggiunta la regione desiderata. Raccogli con cura la sezione desiderata.

Prendi una diapositiva ITO a temperatura ambiente e posizionala sopra la sezione. Avvicinati delicatamente alla sezione e aderisci al vetrino senza lasciare tracce sullo stadio del criostato. Mettere da parte il vetrino in un rack o pulire da laboratorio al di fuori del criostato tra le raccolte di più sezioni.

Se si desidera il confronto tra diversi campioni della stessa coorte, posizionare le sezioni di più campioni su un singolo vetrino in modo che possano essere analizzati simultaneamente per ridurre al minimo la variazione. Se necessario, separare due vetrini, poiché il supporto del bersaglio Maldi può ospitare due vetrini in una singola corsa. Trasportare i vetrini in una scatola sottovuoto in un essiccato con essiccato come strato inferiore.

Guidare i vetrini sotto vuoto per 30-60 minuti, quindi procedere alla deposizione della matrice. Utilizzare due cinque acido diidrossibenzoico, o DHB, in acqua di metanolo come matrice. Posizionare i vetrini in un trasportatore di vetrini e sigillare saldamente l'apertura con la pellicola di cera.

Sigillare con la borsa con zip. Metterlo in un altro sacchetto con cerniera contenente essiccante. Etichettare l'esterno e spedire il campione alle strutture principali di Maldi con un'adeguata secchezza oculare.

Per la deposizione della matrice, utilizzare 40 milligrammi per millilitro di acqua DHB e metanolo come matrice e spruzzarla utilizzando uno spruzzatore automatico a matrice HTX M5. Utilizzare la pressione del gas azoto di 10 PSI. Utilizzare un tempo di volo Maldi, uno strumento MS e una modalità ionica positiva per acquisire uno spettro di massa.

Calibrare lo strumento individuando 0,5 microlitri di emulsione di fosforo rosso in aceto Nitro sui vetrini ITO. Usa gli spettri per calibrare lo strumento nell'intervallo di massa da 100 a 1000 MZ applicando una curva di calibrazione quadratica. Impostare i diametri dello spot laser su medio in quanto è il profilo del fascio modulato per una larghezza raster di 40 micrometri e raccogliere i dati di imaging sommando 500 scatti a una frequenza di ripetizione laser di 1000 hertz per posizione dell'array.

Quindi registrare i dati spettrali. Eseguire l'analisi dei dati di imaging utilizzando la normalizzazione quadratica media delle radici per generare immagini ioniche con una larghezza di banda di più meno 0,10 Dalton. Allineare gli spettri sia dell'OCT che del tessuto cerebrale dallo stesso esperimento utilizzando il software per valutare i picchi sovrapposti nell'interferenza di soppressione ionica dell'OCT.

Infine, elaborare i vetrini MALDI contenenti i campioni di tessuto mediante ematossilina ed eosina, o colorazione H ed E. Le immagini dell'analisi della SM di Maldi hanno rivelato una diminuzione generale del contenuto lipidico nel cervello mutante knockout LPR1. Le sezioni rappresentative del cervello del moscerino adulto colorato H ed E sono mostrate qui.

In questa immagine sono indicate anche le specie lipidiche, i rispettivi valori MZ e le scale della mappa di calore. La piega media della riduzione nel mutante knockout LPR1 rispetto ai controlli di almeno quattro repliche biologiche, sono mostrati come numeri accanto alle frecce. Lo spettro di massa della regione OCT vuota selezionata nella regione del tessuto cerebrale sia dai moscerini di controllo che da quelli mutanti è mostrato nell'intervallo da MZ1 a 1000 e da MZ520 a 900.

L'interferenza dell'OCT è associata sia a fenomeni di soppressione ionica che a problemi di segnale sovrapposti. Per mantenere la fedeltà dei dati lipidomici, la preparazione appropriata del campione, la dissezione e la criosezione sono cruciali. Dopo aver eseguito l'esperimento Maldi, le identità dei lipidi possono essere verificate attraverso LCMS, noto anche come cromatografia liquida, lipodomica basata sulla spettrometria di massa.

Questa tecnica ottiene approfondimenti molecolari sull'omeostasi dei lipidi cerebrali utilizzando il sistema modello potente e morbido che apre la strada alla comprensione dei cambiamenti metabolici correlati alla malattia umana nel cervello.