Name: Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Scopri come applicare forza meccanica al nucleo cellulare usando microsfere magnetiche e imaging a fluorescenza in cellule viventi. Questo metodo non invasivo rivela i meccanismi di meccanosensing nucleare e il traslocamento della proteina YES-associated.

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Questo progetto è finanziato da UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. e Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) e UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Apprezziamo sinceramente le discussioni intellettuali e il supporto tecnico del Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgia), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), e il team di supporto di Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Siamo profondamente grati per l'efficace supporto di tutti i membri dei laboratori di ricerca di Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann e Guan e di tutti i membri del personale del Dipartimento UF MAE.

1. Mantenimento di cellule B2B ingegnerizzate con CRISPR / Cas9
<ol><li>Coltura di cellule B2B in un pallone T25 con RPMI-1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Mantenere le celle B2B in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Sottocoltura delle cellule B2B quando la confluenza raggiunge il 70% all'80%.</li>
	<li>Conservare la linea cellulare B2B in terreno di coltura RPMI-1640 con DMSO al 10% (v/v) in un congelatore a -80 °C.</li>
	<li>Usa le celle B2B con un numero di passaggio inferiore a 10 negli esperimenti.</li>
</ol>2. Coltura cellulare
<ol><li>Seminare le cellule su una capsula di Petri con fondo di vetro.<ol><li>Spostare il pallone che contiene le cellule B2B all'interno dall'incubatore all'armadio di biosicurezza.</li>
		<li>Rimuovere il terreno di coltura nel pallone utilizzando una pipetta di aspirazione con una pompa per vuoto collegata.</li>
		<li>Lavare il matraccio con 2 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).</li>
		<li>Rimuovere PBS utilizzando la pipetta di aspirazione.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione di tripsina allo 0,05% per staccare le cellule dal fondo del substrato del pallone.</li>
		<li>Mettere il pallone nell'incubatrice per 5 minuti.</li>
		<li>Spostare il pallone nell'armadio di biosicurezza. Aggiungere 5 mL di nuovo terreno di coltura nel matraccio e pipettare la soluzione su e giù.</li>
		<li>Depositare 50 μL del mezzo con celle (300 cellule/μL) sulla capsula di Petri con fondo di vetro. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura nella capsula di Petri.</li>
		<li>Posizionare la capsula di Petri nell'incubatrice. Attendere 12 ore affinché le celle si attacchino.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltiva le cellule con microsfere magnetiche.<ol><li>Pesare 0,2 g di microsfere di ferro carbonile di diametro medio di 7 μm (di seguito denominate microsfere da 7 μm, vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Utilizzare una pipetta per sospendere le microsfere in 1 mL di terreno di coltura RPMI-1640.</li>
		<li>Porta la capsula di Petri con cellule B2B nell'armadio di biosicurezza.</li>
		<li>Aggiungere 200 μL del mezzo contenente microsfere nella capsula di Petri. NOTA: Aggiungere rapidamente il mezzo per evitare la precipitazione delle microsfere.</li>
		<li>Rimetti la capsula di Petri nell'incubatore fino a quando le microsfere non vengono internalizzate dalle cellule. Controllare l'internalizzazione ogni 6 ore per determinare il momento ottimale per l'internalizzazione per diverse linee cellulari.</li>
		<li>Per verificare l'internalizzazione, eseguire l'imaging a fluorescenza confocale per visualizzare il confine della microsfera, del nucleare e della cellula. Se la microsfere è internalizzata dalla cellula, sarà all'interno del confine cellulare.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualizzazione del nucleo
<ol><li>Riscaldare 1,5 ml del terreno di coltura nell'incubatore per 15 minuti.</li>
	<li>Spegnere la luce dell'armadio di biosicurezza. Prendi la capsula di Petri che contiene la cellula, il terreno di coltura riscaldato, la colorazione nucleare e Verapamil HCl nell'armadio di biosicurezza. NOTA: I componenti di colorazione nucleare sono sensibili alla luce. Evitare l'esposizione alla luce durante il funzionamento.</li>
	<li>Diluire la colorazione nucleare 1000x di DMSO a 100x.</li>
	<li>Diluire 100 mM Verapamil HCl mediante DMSO a 10 mM.</li>
	<li>Aggiungere 15 μL di colorante nucleare 100x e 15 μL di 10 mM Verapamil HCl a 1,5 mL di terreno di coltura. Mescolare bene pipettando su e giù.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalla capsula di Petri. Aggiungere il terreno di coltura contenente la colorazione nucleare nella capsula di Petri.</li>
	<li>Rimettere le cellule nell'incubatore per oltre 2 ore.</li>
</ol>4. Preparazione dell'hardware di applicazione della forza magnetica
<ol><li>Stampare in 3D tutte le parti utilizzando acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) e assemblarle seguendo il design CAD (Figura 1A). Il progetto CAD è incluso nella tabella dei materiali.</li>
	<li>Utilizzare del nastro biadesivo per fissare il magnete al dispositivo di spostamento del magnete (Figura 1A).</li>
	<li>Posizionare il dispositivo di spostamento magnetico accanto al palco del microscopio. Utilizzare le tre manopole per regolare la posizione spaziale del magnete fino a quando non può spostarsi sopra la piastra di Petri tra 13 mm e 120 mm. NOTA: Assicurarsi che il limite superiore della distanza tra il magnete e la capsula di Petri sia il più grande possibile per evitare l'applicazione di forza indesiderata sulle microsfere magnetiche. 120 mm è il valore massimo in questa configurazione sperimentale. Assicurarsi che il magnete non interferisca con le parti del microscopio, compresi gli obiettivi e gli stadi motorizzati.</li>
	<li>Impostare il magnete sulla posizione z più alta (a 120 mm).</li>
</ol>5. Applicazione forzata e imaging di cellule vive
<ol><li>Allestimento della camera ambientale per l'imaging a lungo termine<ol><li>Applicare una soluzione di etanolo al 75% per sterilizzare e pulire accuratamente la camera dell'ambiente.</li>
		<li>Posizionare la camera ambientale sul palco motorizzato del microscopio invertito.</li>
		<li>Aprire il serbatoio di CO 2 e impostare la velocità di afflusso di CO2 su 160 ml/min.</li>
		<li>Regolare la temperatura della camera a 44 °C (superiore), 42 °C (bagno) e 40 °C (stadio).</li>
		<li>Aggiungere 20 ml di acqua purificata nel bagno della camera dell'ambiente per mantenere il 90% di umidità.</li>
		<li>Estrarre la capsula di Petri con fondo di vetro che contiene cellule bersaglio dall'incubatore di coltura tissutale e posizionarla nella camera.</li>
		<li>Applicare il morsetto metallico della camera ambiente per fissare la posizione della capsula di Petri. NOTA: La capsula di Petri deve essere serrata saldamente nella camera perché la forza magnetica può spostare la capsula se non viene bloccata.</li>
		<li>Chiudere il coperchio della camera.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottimizzazione dei parametri di imaging<ol><li>Ottimizzare la dimensione del foro stenopeico: il foro stenopeico blocca i fotoni fuori fuoco. Una dimensione stenopeica più grande produce più fotoni fuori fuoco ma un'immagine più luminosa. Una dimensione stenopeica più piccola produce un'immagine più focalizzata e più fioca. Assicurati di ottimizzare le dimensioni del foro stenopeico per ottenere immagini confocali a fuoco con il rapporto segnale-rumore appropriato.</li>
		<li>Ottimizzare l'intensità del laser: l'intensità del laser determina l'intensità dell'eccitazione e quindi l'emissione luminosa. La bassa intensità laser offre un basso rapporto segnale-rumore. Un'intensità laser troppo elevata causerà il fotosbiancamento. Regolare l'intensità del laser di conseguenza.</li>
		<li>Ottimizza le dimensioni e i passaggi dei passi: i passaggi e le dimensioni dei passi determinano quante immagini occuperanno in uno stack Z. Dimensioni dei passi più piccole e più passaggi aumenteranno la risoluzione Z-stack ma aumenteranno anche il fotosbiancamento. In questo esperimento, è stata utilizzata una dimensione del passo di 1 μm per le cellule con ~ 15 μm di altezza della cella.</li>
		<li>Ottimizzare il tempo di esposizione: il tempo di esposizione determina per quanto tempo la cellula sarà esposta al laser di eccitazione. Un tempo di esposizione basso ridurrà il rapporto segnale-rumore. Un tempo di esposizione elevato causerà il fotosbiancamento. In questo esperimento è stato utilizzato un tempo di esposizione di 1 fotogramma per 4 s.</li>
		<li>Ottimizzazione dei parametri di imaging: modificare uno dei quattro parametri in modo iterativo e mantenere coerenti gli altri parametri. Ogni volta, misurare il rapporto YAP N/C di ciascuna immagine e confrontare la variazione del rapporto YAP N/C per determinare il livello di photobleaching. Ripetere il processo di ottimizzazione fino a raggiungere un equilibrio tra il rapporto segnale/rumore, la velocità di imaging e il fotosbiancamento.</li>
		<li>Definire le configurazioni di imaging utilizzando i parametri di imaging ottimizzati per impostazioni di imaging più rapide durante gli esperimenti. NOTA: Le configurazioni utilizzate in questo studio sono descritte nel paragrafo 5.3 dei parametri di imaging. Per ottimizzare i parametri di imaging delle configurazioni nella sezione 5.3, usare lo stesso metodo del punto 5.2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicazione di piccole forze e imaging confocale NOTA: Il microscopio Nikon Ti2-E è stato utilizzato per l'imaging in questo studio e i passaggi dettagliati per l'acquisizione delle immagini sono riportati di seguito.<ol><li>Aprire il microscopio invertito. Aprire l'applicazione software Elements.</li>
		<li>Definire magnetic_find di configurazione. Controlla solo il canale FITC. Impostare PMT HV = 70, Offset = 0, Intensità laser = 10. Impostare la velocità di scansione su 1 fotogramma per 2 secondi facendo clic sul pulsante 1/2 . Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,2 UA facendo clic sul pulsante 1,2 U.A. Questa configurazione verrà utilizzata nel passaggio 5.3.5.</li>
		<li>Definire magnetic_YAP_Nucleus di configurazione. Controlla il canale FITC. Impostare PMT HV = 70, Offset = 0, Intensità laser = 10. Impostare la velocità di scansione su 1 fotogramma per 4 secondi facendo clic sul pulsante 1/2 . Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,2 UA facendo clic sul pulsante 1,2 U.A. Per visualizzare il confine del nucleo e l'intensità della macchia nucleare, controllare il canale Cy5. Impostare PMT HV = 70, Offset = 0, Intensità laser = 10. La dimensione del foro stenopeico è ottimizzata per l'imaging 3D YAP. Non fare nuovamente clic sul pulsante 1.2 A.U . dopo aver controllato il canale Cy5. Questa configurazione verrà utilizzata nel passaggio 5.3.7.</li>
		<li>Se necessario, attiva DIA tramite Elements . Aprite SpinView, usate un campo luminoso e regolate la messa a fuoco dell'oggetto per ottenere un'immagine chiara delle celle. Usa un obiettivo 10x per trovare più celle singole appropriate in tre condizioni: con una singola microsfere all'interno, con più microsfere all'interno e senza alcuna microsfere all'interno. Passa all'obiettivo 40x. Assegnare un nome a questa posizione con il numero di posizione appropriato.</li>
		<li>Elementi aperti. Clicca su magnetic_find. Fare clic sul pulsante Rimuovi interblocco.</li>
		<li>Fare clic su Scansione e regolare la posizione Z del piano focale. Fare clic sui pulsanti Superiore e Inferiore per impostare il limite inferiore e superiore per lo stack Z delle celle selezionate. Interrompere la scansione facendo nuovamente clic su Scansione .</li>
		<li>Passare alla configurazione magnetic_YAP_Nucleus . Impostare il nome del file come before_small_force.nd2. Fare clic sul pulsante Esegui con lo stack Z registrato.</li>
		<li>Passa al percorso della luce a destra e attiva DIA. Apri SpinView e fai clic sul pulsante Registrazione . Nel frattempo, ruotare la manopola del dispositivo di movimento magnetico per spostare il magnete fino a 46 mm sopra il fondo della capsula di Petri. Salva una sequenza di immagini o video in campo chiaro. Controlla il video per confermare che le microsfere mostrano lo spostamento indotto dalla forza magnetica.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 5.3.5-5.3.7; Impostare il nome del file su after_small_force.nd2.</li>
		<li>Passa al percorso della luce a destra e attiva DIA. Quindi, apri SpinView e fai clic sul pulsante Registrazione . Nel frattempo, ruotare la manopola del dispositivo di movimento magnetico per spostare il magnete fino a 120 mm sopra il fondo della capsula di Petri. Salva una sequenza di immagini o video in campo chiaro.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 5.3.5-5.3.7 e impostare il nome del file su before_large_force.nd2.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicazione di grandi forze e imaging confocale<ol><li>Rimuovere il coperchio della camera ambiente per consentire al magnete di raggiungere 13 mm sopra il fondo della piastra di Petri.</li>
		<li>Passa al percorso della luce a destra e attiva DIA. Apri SpinView e fai clic sul pulsante Registrazione . Nel frattempo, ruotare la manopola del dispositivo di movimento magnetico per spostare il magnete fino a 13 mm sopra il fondo della capsula di Petri. Salva una sequenza di immagini o video in campo chiaro. Controlla il video per confermare che le microsfere mostrano lo spostamento indotto dalla forza magnetica.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 5.3.5-5.3.7 e impostare il nome del file su after_large_force.nd2.</li>
		<li>Passa al percorso della luce a destra e attiva DIA. Quindi, apri SpinView e fai clic sul pulsante Registrazione . Nel frattempo, ruotare la manopola del dispositivo di movimento magnetico per spostare il magnete fino a 120 mm sopra il fondo della capsula di Petri. Salva una sequenza di immagini o video in campo chiaro.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 5.3.5-5.3.7; Impostare il nome del file su retract_large_force.nd2.</li>
		<li>Chiudere il coperchio della camera dell'ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.2 e 5.3 per più campi visivi per ottenere più dati, se necessario.</li>
</ol>6. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati
<ol><li>Quantificazione del rapporto YAP N/C<ol><li>Apri Fiji ImageJ. Aprire le immagini .nd2 scattate nel passaggio 5.</li>
		<li>Fare clic su Analizza > Imposta misurazioni. Area di controllo, densità integrata, valore medio di grigio e descrittori di forma.</li>
		<li>Utilizzare il canale Cy5 per identificare il nucleo. Fare clic su Selezioni a mano libera per utilizzare lo strumento di selezione libera per delineare il nucleo. Inoltre, controllare la macro maschera nucleare automatica in ImageJ (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Fare clic su Analizza > misura nel canale FITC. Il valore misurato della media è l'intensità YAP nucleare media DN.</li>
		<li>Utilizzare il canale Cy5 per identificare il nucleo. Utilizzare il canale FITC per identificare la cella. Fare clic su Selezioni a mano libera per utilizzare lo strumento di selezione libera per selezionare una regione di interesse all'interno del citoplasma ed evitare la microsfera magnetica. Questa regione di interesse non deve includere il nucleo.</li>
		<li>Fare clic su Analizza > misura nel canale FITC. Il valore misurato della media è l'intensità media YAP citoplasmatica DC.</li>
		<li>Calcola il rapporto YAP N/C = D N / DC.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione della forma nucleare e dell'intensità normalizzata della colorazione nucleare<ol><li>Apri Fiji ImageJ. Aprire le immagini .nd2 scattate nel passaggio 5.</li>
		<li>Fare clic su Analizza > Imposta misurazioni. Area di controllo, densità integrata, valore medio di grigio e descrittori di forma.</li>
		<li>Utilizzare il canale Cy5 per identificare il nucleo. Fare clic su Selezioni a mano libera per utilizzare lo strumento di selezione libera per delineare il nucleo.</li>
		<li>Fare clic su Analizza > misura nel canale Cy5. Il valore misurato della media è l'intensità della macchia nucleare. Il valore misurato di Circ. è la circolarità nucleare.</li>
		<li>Per confrontare l'intensità della macchia nucleare a diversi stati di forza, tutta l'intensità della macchia nucleare è divisa per l'intensità della macchia nucleare in "before_small_force.nd2" per generare l'intensità della macchia nucleare normalizzata.</li>
	</ol></li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

L'internalizzazione delle microsfere magnetiche (sezione 2.2) è fondamentale perché le microsfere extracellulari non possono applicare forza direttamente al nucleo. L'applicazione della forza e l'imaging (sezione 5.3) sono passaggi critici in questo esperimento e la forza necessaria per deformare il nucleo e indurre conseguenze biologiche significative potrebbe dipendere dal campione. La grandezza della forza in questo esperimento (0,8 nN e 1,4 nN) può essere ulteriormente aumentata per innescare il rilevamento meccano-m...

Questo studio mira a sviluppare e applicare una nuova tecnica per chiarire la meccanobiologia del nucleo combinando gli attuatori magnetici che applicano la forza meccanica direttamente sul nucleo cellulare e la microscopia a fluorescenza confocale che visualizza simultaneamente i cambiamenti subcellulari strutturali e funzionali. Le cellule rilevano segnali biofisici extracellulari tra cui rigidità tissutale 1,2,3,4, pressione del liquido interstiziale e sforzo di taglio 5,6,7, topologia / geometria di superficie8,9,10,11,12 e tensione / sforzo di compressione 13,14, 15,16. I segnali biofisici vengono convertiti in segnali biochimici e innescano potenziali cambiamenti a valle dell'espressione genica e dei comportamenti cellulari, un processo noto come meccanotrasduzione 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Per studiare i processi di meccanotrasduzione, sono state sviluppate una miriade di tecniche per applicare la forza meccanica sulle cellule, come la microscopia a forza atomica28, il dispositivo di allungamento cellulare29, il sensore di forza bio-MEMS (sistemi micro-elettromeccanici) 15,30,31, la reologia di taglio 32 e il sistema di visione stereoscopica 33 . Una recente revisione riassume gli approcci per applicare segnali meccanici extracellulari e interferire con il meccanorilevamento34. Ad oggi, la maggior parte di questi metodi applica forza sulla membrana plasmatica cellulare e le cellule ricevono direttamente questi segnali biofisici extracellulari attraverso recettori di membrana come integrina, caderina, canali ionici e recettori accoppiati a proteine G. Successivamente, trasmettono il segnale al citoscheletro intracellulare e al nucleo. Ad esempio, utilizzando la traslocazione di proteine associate sì (YAP) come indicatore di meccano-rilevamento, le cellule hanno dimostrato di percepire i segnali meccanici di rigidità del substrato e tensione extracellulare dalla membrana cellulare e trasmetterli attraverso il citoscheletro nel nucleo per indurre la traslocazione da citoplasma YAP a nucleo28,35.
Prove recenti suggeriscono che il nucleo cellulare stesso è un meccano-sensore indipendente 8,36,37. Ciò è dimostrato da esperimenti condotti sul nucleo isolato raccolto dalle cellule, dove è stato rivelato che i nuclei cambiano in modo adattivo la loro rigidità in risposta alla forza meccanica applicata direttamente su di essi36. Durante molte condizioni fisiologiche, i nuclei sia nelle cellule tumorali che in quelle sane percepiscono segnali biofisici extracellulari e cambiano le loro proprietà meccaniche e gli assemblaggi38,39,40. Ad esempio, dopo lo stravaso, la rigidità nucleare delle cellule tumorali diminuisce e mantiene la morbidezza per oltre 24 ore38. Durante la migrazione attraverso lo spazio interstiziale confinato, i nuclei delle cellule tumorali spesso perdono e recuperano la loro integrità strutturale39. Tuttavia, il modo in cui il nucleo percepisce il segnale biofisico è sconosciuto, sebbene siano state trovate coinvolte diverse proteine dell'involucro nucleare e famiglie di proteine, come Lamin A / C e linker del complesso nucleoscheletro e citoscheletro (LINC)38,41. Quindi, nuovi metodi non invasivi che possono applicare direttamente la forza al nucleo disaccoppiano l'effetto della trasmissione della forza dalla membrana cellulare-plasma e dal citoscheletro e aiuteranno a chiarire i meccanismi molecolari precedentemente inaccessibili del meccano-rilevamento nucleare.
La ricerca che ha impiegato pinzette ottiche per manipolare organelli42 e microsfere iniettate nelle cellule43 ha mostrato la capacità tecnologica di applicare direttamente la forza sul nucleo. Tuttavia, la tecnica delle pinzette ottiche ha diverse limitazioni: (1) le pinzette ottiche a bassa produttività spesso manipolano solo una cellula o microbead alla volta; e (2) il potenziale fotodanneggiamento e la deformazione dell'artefatto di temperatura del nucleare richiedono decine di pN36 e la corrispondente potenza laser necessaria è di circa 10 mW per pN44,45. Tale intensità laser è sufficiente per innescare il fotodanneggiamento nelle cellule e perturbare le funzioni delle cellule durante l'esperimento46.
La forza magnetica applicata attraverso microsfere all'interno delle cellule viventi mostra il potenziale per applicare direttamente la forza sul nucleo e supera i limiti delle pinzette ottiche. Una volta che le microsfere vengono consegnate nel citoplasma, un campo magnetico può esercitare una forza magnetica su più microsfere contemporaneamente in modo ad alto rendimento. Il campo magnetico non influenza le funzioni cellulari47, ma genera forza da pN a nN, che è sufficiente per indurre la deformazione nucleare 36,48,49. Ad oggi, la manipolazione delle microsfere magnetiche è stata applicata sulla membrana plasmatica cellulare48, all'interno del citoplasma50, sulla F-actina51, all'interno del nucleo47 e sul nucleo isolato36. Tuttavia, la manipolazione magnetica delle microsfere non è mai stata utilizzata per applicare una forza meccanica diretta sull'involucro nucleare per studiare la meccanotrasduzione nel nucleo.
In questo articolo, viene sviluppata una semplice tecnica per fornire in modo non invasivo microsfere magnetiche nel citoplasma e utilizzare queste microsfere per applicare forza meccanica sul nucleo (Figura 1). Qui, le normali linee cellulari B2B umane ingegnerizzate da CRISPR / Cas9 che esprimono endogenamente mNeonGreen21-10/11-tagged YAP vengono utilizzate per convalidare il metodo. YAP è una proteina meccano-sensibile e la traslocazione di YAP è regolata dal meccano-rilevamento nucleare14,28. L'approccio knock-in regolato da CRISPR / Cas9 è stato scelto per etichettare YAP endogeno con una proteina fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Sebbene l'editing CRISPR sia noto per avere un'efficienza incompleta e un effetto fuori bersaglio, i protocolli nelle pubblicazioni precedenti hanno integrato l'ordinamento a fluorescenza per selezionare il corretto inserimento del frame di lettura aperto52,53,54. Con questo ulteriore livello di selezione, non è stato osservato alcun evento di tagging off-target in 20+ linee cellulari precedentemente generate52,53,54,55. Questo è un costrutto proteico fluorescente diviso, ma in linea di principio, qualsiasi tag fluorescente esprimibile potrebbe essere utilizzabile. Questo approccio di etichettatura è superiore ai metodi transgenici o anticorpali. In primo luogo, a differenza dell'espressione transgenica, la proteina marcata mantiene il dosaggio genico a copia singola ed si esprime nel contesto fisiologico della rete di regolazione genica nativa, limitando le deviazioni nella concentrazione, localizzazione e interazione della proteina. Il metodo di tagging utilizzato in questo studio raggiunge un throughput e un'efficienza superiori di oltre un ordine di grandezza rispetto all'etichettatura FP completa. Evita anche le sfide associate all'immunofluorescenza a causa degli artefatti di fissazione e della limitata disponibilità di anticorpi di alta qualità e ad alta specificità. In secondo luogo, l'approccio utilizzato in questo articolo riduce al minimo le perturbazioni della fisiologia cellulare e consente la rivelazione in tempo reale di tutti gli YAP endogeni in modo autentico. Al contrario, altri metodi transgenici comuni spesso portano alla sovraespressione di YAP. La distribuzione artificiale risultante può potenzialmente causare citotossicità e influenzare il meccano-rilevamento delle cellule56,57,58.
Questo studio presenta un protocollo per applicare direttamente la forza sul nucleo attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti a cellule vive. In sintesi, i protocolli qui presentati dimostrano come (1) fornire microsfere magnetiche nella cellula mentre si trova all'esterno del nucleo, (2) manipolare le microsfere per applicare forza magnetica sul nucleo, (3) eseguire l'imaging fluorescente confocale delle cellule durante la manipolazione e (4) analizzare quantitativamente il rapporto YAP nucleare/citoplasma (N/C) durante tutto il processo di applicazione della forza. I risultati suggeriscono che (1) attraverso l'endocitosi, le microsfere magnetiche possono essere erogate in modo non invasivo nel citoplasma delle cellule B2B entro 7 ore (Figura 2 e Figura 3); e (2) la forza magnetica quantificata applicata direttamente sul nucleo (Figura 4, Figura 5 e Figura 6) da sola può innescare diversi cambiamenti del rapporto YAP N/C nelle cellule B2B ingegnerizzate da CRISPR / Cas9 (Figura 7 e Figura 8).

<table><tbody><tr><td>0,05 % Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 pallone</td><td>Corning</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>7-&micro; m diametro medio microsfere di ferro carbonilico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema confocale A1R</td><td>Polvere</td> di ferro carbonilico Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>CM</td><td>BASF</td><td>30042253</td><td>Microsfere magnetiche</td></tr><tr><td>Terreno di coltura (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Computer desktop</td><td>Dell</td><td></td><td>con sistema operativo Windows 10</td></tr><tr><td>Camera climatica TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>National Institutes of Health e il Laboratorio per la strumentazione</td><td></td><td></td>ottica e computazionale</tr><tr><td>Piastra di Petri con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Magnete</td><td>K & J Magnetics, Inc.</td><td>D99-N52</td><td></td></tr><tr><td>Monocromatico&nbsp; Telecamera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma software NIS-Elements</td><td>Piattaforma software</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr>Maschera nucleo <td>Maschera https://github.com/KOLIUG/Nuclear</td><td>macro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ NucSpot Live 650</td><td>Biotium</td><td>#40082</td><td>Colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponato soluzione salina (PBS)</td>Microscopio invertito <td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ mover (file CAD)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td></tr></tbody></table>

combinazione di attuatore di forza magnetica 3d e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Una questione fondamentale in meccanobiologia è come le cellule viventi percepiscono gli stimoli meccanici extracellulari nel contesto della fisiologia e della patologia cellulare. Si ritiene che la meccano-sensazione cellulare degli stimoli meccanici extracellulari sia attraverso i recettori di membrana, il complesso proteico associato e il citoscheletro. I recenti progressi nella meccanobiologia dimostrano che il nucleo cellulare nel citoplasma stesso può percepire indipendentemente gli stimoli meccanici contemporaneamente. Tuttavia, manca una comprensione meccanicistica di come il nucleo cellulare percepisce, trasduce e risponde agli stimoli meccanici, principalmente a causa delle sfide tecniche nell'accesso e nella quantificazione della meccanica del nucleo con strumenti convenzionali. Questo documento descrive la progettazione, la fabbricazione e l'implementazione di un nuovo attuatore di forza magnetica che applica stimoli meccanici 3D precisi e non invasivi per deformare direttamente il nucleo cellulare. Utilizzando cellule ingegnerizzate con CRISPR / Cas9, questo studio dimostra che questo strumento, combinato con l'imaging fluorescente confocale ad alta risoluzione, consente la rivelazione della dinamica in tempo reale di una proteina associata al sì meccano-sensibile (YAP) in singole cellule in funzione della deformazione del nucleo. Questo semplice metodo ha il potenziale per colmare l'attuale divario tecnologico nella comunità meccanobiologica e fornire risposte al divario di conoscenze che esiste nella relazione tra meccanotrasduzione del nucleo e funzione cellulare.

Progettazione di un dispositivo di movimento magnetico e applicazione della forza magnetica Per applicare forza sul nucleo attraverso le microsfere magnetiche, è stato progettato e costruito un dispositivo di movimento magnetico per controllare la posizione spaziale del magnete. Il dispositivo di spostamento del magnete contiene un telaio centrale, tre manopole e guide per spostare il magnete collegato nelle direzioni x, y e z indipendentemente alla risoluzione spaziale di 1,59 mm per ciclo (<strong c...

Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.

Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

In questo metodo, la forza viene applicata direttamente al nucleo. Questo disaccoppia l'effetto di trasmissione della forza dalla membrana plasmatica cellulare e dal citoscheletro, rivelando i meccanismi molecolari del meccanorilevamento nucleare. La forza viene applicata all'interno delle cellule viventi in modo non invasivo.Rispetto alle pinzette ottiche, il campo magnetico e la forza magnetica non influenzano le funzioni della cella e hanno un throughput più elevato. Iniziare a coltivare le cellule con microsfere magnetiche pesando 0,2 grammi di microsfere di ferro carbonile con sette micrometri di diametro medio. Sospendete le microsfere in un terreno di coltura RPMI 1640 da un millilitro utilizzando una pipetta.Quindi portare la capsula di Petri con cellule B2B nell'armadio di biosicurezza e aggiungere rapidamente 200 microlitri del mezzo contenente microsfere nella capsula di Petri. Metti la capsula di Petri in un'incubatrice fino a quando le microsfere non vengono interiorizzate dalle cellule. Aprire il microscopio invertito e utilizzando l'imaging a fluorescenza confocale, determinare il momento ottimale per l'internalizzazione delle linee cellulari ogni sei ore visualizzando il confine della microsfera, del nucleare e della cellula.Le microsfere internalizzate saranno presenti all'interno del confine cellulare. Per l'applicazione di piccole forze e l'imaging di cellule vive, aprire l'applicazione software Elements. Per definire la configurazione del rilevamento magnetico, fare clic sul pulsante uno su due per impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni due secondi.Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,2 unità Airy. Controllare solo il canale FITC e impostare PMT HV su 70, offset come zero, intensità laser su 10. Per definire il nucleo YAP magnetico di configurazione, impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni quattro secondi facendo clic sul pulsante uno su quattro.Quindi fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit per impostare la dimensione del foro stenopeico su 1.2 Airy unit e controllare il canale FITC. Impostare PMT HV come 70, offset come zero, intensità laser come 10. Per l'imaging del confine del nucleo e dell'intensità della colorazione nucleare, controllare il canale cianina 5.Non fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit e impostare PMT HV su 70, offset a zero e intensità laser a 10. La dimensione del foro stenopeico sarà ottimizzata per l'imaging tridimensionale delle proteine associate a YES. Quindi, attiva la DIA tramite Elements.Aprire la vista di rotazione, utilizzare un campo luminoso e regolare la messa a fuoco dell'oggetto per ottenere un'immagine chiara delle celle. Usa un obiettivo 10X per trovare più celle singole appropriate in tre condizioni, ad esempio una cella con una singola microsfere all'interno, con più microsfere all'interno e senza alcuna microsfere all'interno. Quindi passare all'obiettivo 40X e nominare questa posizione con il numero di posizione appropriato.Apri Elementi, fai clic su Trova magnetico, rimuovi interblocco, quindi scansiona le schede, quindi seleziona i pulsanti superiore e inferiore per regolare la posizione Z del piano focale per impostare il limite inferiore e superiore per la pila Z delle celle selezionate. Interrompere la scansione facendo nuovamente clic su Scansione. Passare alla configurazione del nucleo YAP magnetico e impostare il nome del file come before_small_force.nd2.Fare clic sul pulsante Esegui con lo stack Z registrato. Passare al percorso della luce corretto e attivare DIA. Apri la vista di rotazione e fai clic sul pulsante di registrazione.Spostare il magnete a 46 millimetri sopra il fondo della capsula di Petri ruotando la manopola del dispositivo di movimento del magnete. Salva e controlla il video per confermare lo spostamento delle microsfere indotto dalla forza magnetica. Ripetere la procedura di scansione impostando il nome del file come after_small_force.nd2.Quindi, passare al percorso della luce destro, attivare DIA e aprire la vista di rotazione prima di fare clic sul pulsante di registrazione. Ruotare la manopola del dispositivo mobile magnetico fino a 120 millimetri sopra il fondo della piastra di Petri e salvare una sequenza di immagini o video a campo chiaro. Ripetere i passaggi per la scansione impostando il nome del file su before_large_force.nd2.Le microsfere non possono emettere fluorescenza sotto eccitazione laser nel canale FITC o cianina 5. Pertanto, le microsfere internalizzate sono state identificate dalla cavità scura situata nell'imaging confocale della fluorescenza della proteina e del nucleo associati a YES. La circolarità nucleare non ha mostrato differenze significative tra le cellule di controllo e le cellule con internalizzazione delle microsfere.Anche il rapporto nucleo-citoplasma delle cellule proteiche associate a YES-cellule di controllo co-coltivate con microsfere ma senza internalizzazione e cellule con internalizzazione di microsfere non ha mostrato differenze significative. La deformazione del nucleo e la depolimerizzazione dell'actina sono state causate dalla forza di compressione applicata dalle microsfere nelle cellule contenenti citoscheletro. La curva di calibrazione dell'analisi quantitativa dell'imaging fornita dalla relazione quantitativa di spostamento della forza AFM.Sulla base di questa relazione, è stata stimata la forza applicata alle perline. La deformazione del nucleo e la traslocazione proteica associata a YES sono state osservate all'applicazione o al rilascio della forza magnetica. I cambiamenti di intensità nella proteina associata a YES nel canale verde e nessun cambiamento nella colorazione del nucleo nel canale rosso hanno confermato che la deformazione nucleare indotta dalla forza magnetica innescata dalla traslocazione della proteina associata a YES.La quantificazione della variazione netta del rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES-all'interno di due gruppi ha confermato che la forza magnetica applicata alle microsfere all'interno del citoplasma ha indotto la traslocazione proteica associata a YES-e ha modificato il rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES. Prima di applicare la forza e l'imaging, assicurarsi che le cellule abbiano interiorizzato le microsfere magnetiche e che le perle siano all'interno del confine cellulare.

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Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

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