Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo
5 luglio 2022
Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.
In questo metodo, la forza viene applicata direttamente al nucleo. Questo disaccoppia l'effetto di trasmissione della forza dalla membrana plasmatica cellulare e dal citoscheletro, rivelando i meccanismi molecolari del meccanorilevamento nucleare. La forza viene applicata all'interno delle cellule viventi in modo non invasivo.
Rispetto alle pinzette ottiche, il campo magnetico e la forza magnetica non influenzano le funzioni della cella e hanno un throughput più elevato. Iniziare a coltivare le cellule con microsfere magnetiche pesando 0,2 grammi di microsfere di ferro carbonile con sette micrometri di diametro medio. Sospendete le microsfere in un terreno di coltura RPMI 1640 da un millilitro utilizzando una pipetta.
Quindi portare la capsula di Petri con cellule B2B nell'armadio di biosicurezza e aggiungere rapidamente 200 microlitri del mezzo contenente microsfere nella capsula di Petri. Metti la capsula di Petri in un'incubatrice fino a quando le microsfere non vengono interiorizzate dalle cellule. Aprire il microscopio invertito e utilizzando l'imaging a fluorescenza confocale, determinare il momento ottimale per l'internalizzazione delle linee cellulari ogni sei ore visualizzando il confine della microsfera, del nucleare e della cellula.
Le microsfere internalizzate saranno presenti all'interno del confine cellulare. Per l'applicazione di piccole forze e l'imaging di cellule vive, aprire l'applicazione software Elements. Per definire la configurazione del rilevamento magnetico, fare clic sul pulsante uno su due per impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni due secondi.
Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,2 unità Airy. Controllare solo il canale FITC e impostare PMT HV su 70, offset come zero, intensità laser su 10. Per definire il nucleo YAP magnetico di configurazione, impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni quattro secondi facendo clic sul pulsante uno su quattro.
Quindi fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit per impostare la dimensione del foro stenopeico su 1.2 Airy unit e controllare il canale FITC. Impostare PMT HV come 70, offset come zero, intensità laser come 10. Per l'imaging del confine del nucleo e dell'intensità della colorazione nucleare, controllare il canale cianina 5.
Non fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit e impostare PMT HV su 70, offset a zero e intensità laser a 10. La dimensione del foro stenopeico sarà ottimizzata per l'imaging tridimensionale delle proteine associate a YES. Quindi, attiva la DIA tramite Elements.
Aprire la vista di rotazione, utilizzare un campo luminoso e regolare la messa a fuoco dell'oggetto per ottenere un'immagine chiara delle celle. Usa un obiettivo 10X per trovare più celle singole appropriate in tre condizioni, ad esempio una cella con una singola microsfere all'interno, con più microsfere all'interno e senza alcuna microsfere all'interno. Quindi passare all'obiettivo 40X e nominare questa posizione con il numero di posizione appropriato.
Apri Elementi, fai clic su Trova magnetico, rimuovi interblocco, quindi scansiona le schede, quindi seleziona i pulsanti superiore e inferiore per regolare la posizione Z del piano focale per impostare il limite inferiore e superiore per la pila Z delle celle selezionate. Interrompere la scansione facendo nuovamente clic su Scansione. Passare alla configurazione del nucleo YAP magnetico e impostare il nome del file come before_small_force.nd2.
Fare clic sul pulsante Esegui con lo stack Z registrato. Passare al percorso della luce corretto e attivare DIA. Apri la vista di rotazione e fai clic sul pulsante di registrazione.
Spostare il magnete a 46 millimetri sopra il fondo della capsula di Petri ruotando la manopola del dispositivo di movimento del magnete. Salva e controlla il video per confermare lo spostamento delle microsfere indotto dalla forza magnetica. Ripetere la procedura di scansione impostando il nome del file come after_small_force.nd2.
Quindi, passare al percorso della luce destro, attivare DIA e aprire la vista di rotazione prima di fare clic sul pulsante di registrazione. Ruotare la manopola del dispositivo mobile magnetico fino a 120 millimetri sopra il fondo della piastra di Petri e salvare una sequenza di immagini o video a campo chiaro. Ripetere i passaggi per la scansione impostando il nome del file su before_large_force.nd2.
Le microsfere non possono emettere fluorescenza sotto eccitazione laser nel canale FITC o cianina 5. Pertanto, le microsfere internalizzate sono state identificate dalla cavità scura situata nell'imaging confocale della fluorescenza della proteina e del nucleo associati a YES. La circolarità nucleare non ha mostrato differenze significative tra le cellule di controllo e le cellule con internalizzazione delle microsfere.
Anche il rapporto nucleo-citoplasma delle cellule proteiche associate a YES-cellule di controllo co-coltivate con microsfere ma senza internalizzazione e cellule con internalizzazione di microsfere non ha mostrato differenze significative. La deformazione del nucleo e la depolimerizzazione dell'actina sono state causate dalla forza di compressione applicata dalle microsfere nelle cellule contenenti citoscheletro. La curva di calibrazione dell'analisi quantitativa dell'imaging fornita dalla relazione quantitativa di spostamento della forza AFM.
Sulla base di questa relazione, è stata stimata la forza applicata alle perline. La deformazione del nucleo e la traslocazione proteica associata a YES sono state osservate all'applicazione o al rilascio della forza magnetica. I cambiamenti di intensità nella proteina associata a YES nel canale verde e nessun cambiamento nella colorazione del nucleo nel canale rosso hanno confermato che la deformazione nucleare indotta dalla forza magnetica innescata dalla traslocazione della proteina associata a YES.
La quantificazione della variazione netta del rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES-all'interno di due gruppi ha confermato che la forza magnetica applicata alle microsfere all'interno del citoplasma ha indotto la traslocazione proteica associata a YES-e ha modificato il rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES. Prima di applicare la forza e l'imaging, assicurarsi che le cellule abbiano interiorizzato le microsfere magnetiche e che le perle siano all'interno del confine cellulare.
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Panoramica
Questo studio esplora un nuovo protocollo per applicare una forza meccanica direttamente al nucleo cellulare utilizzando microsfere magnetiche all'interno di cellule vive, consentendo al contempo l'analisi fluorescente in tempo reale. Questa tecnica fornisce informazioni sui meccanismi di meccanosensibilità nucleare, funzionando senza alterare i processi cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Mecanobiologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Comprendere la meccanosensibilità nucleare è fondamentale per la funzione cellulare.
- Le tecniche esistenti, come le pinzette ottiche, sono invasive e meno efficienti.
- Le microsfere magnetiche offrono un metodo non invasivo per studiare questi meccanismi.
Metodi Utilizzati
- Applicazione di forza meccanica mediante microsferette magnetiche.
- Acquisizione di immagini in tempo reale mediante microscopia a fluorescenza confocale.
- Analisi quantitativa delle immagini per misurare la deformazione nucleare indotta dalla forza.
Risultati principali
- L'applicazione di forza da parte di microsfere ha provocato una deformazione del nucleo e la traslocazione della proteina associata a YES.
- Non sono state osservate differenze significative nella circolarità nucleare tra le cellule di controllo e quelle con internalizzazione delle microsfere.
- Lo studio conferma che la forza magnetica influenza le vie di meccanotrasduzione nucleare.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora la comprensione del meccanosensing nucleare.
- Offre un approccio non invasivo per lo studio della meccanica cellulare e dei percorsi di segnalazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'interrogazione meccanica diretta del nucleo cellulare mediante attuatori magnetici 3D e imaging a fluorescenza in tempo reale consente un'analisi precisa e non invasiva della meccanotrasduzione nucleare. Questo approccio colma un'importante lacuna nella comprensione di come la meccanica nucleare influenzi la segnalazione cellulare, offrendo una maggiore affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta e nella validazione degli obiettivi. Gli output quantitativi e i rilevamenti in tempo reale del metodo ne fanno un asset strategico per la riduzione del rischio meccanicistico e la selezione dei progetti nella ricerca e sviluppo del settore biotecnologico e farmaceutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette di verificare direttamente le ipotesi relative alla meccanosensibilità nucleare, indipendentemente da fattori confondenti legati alla membrana e al citoscheletro.
- Consente la validazione funzionale delle vie di meccanotrasduzione quantificando la dinamica della proteina associata a YES (YAP) in risposta a deformazioni nucleari controllate.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica isolando il contributo nucleare alla segnalazione cellulare, fornendo indicazioni utili per la selezione e la priorizzazione degli obiettivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Facilita la preparazione di sistemi con cellule vive validati per saggi successivi di meccanobiologia.
- Fornisce output quantitativi riproducibili per l'imaging della traslocazione di YAP e delle metriche di deformazione nucleare.
- Consente la standardizzazione dei parametri di applicazione della forza e di acquisizione delle immagini, favorendo la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla meccanobiologia rilevante per le malattie modellando le risposte nucleari allo stress meccanico in linee cellulari ingegnerizzate.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo biomarcatori quantitativi della meccanotrasduzione nucleare.
- Riduce il rischio di traduzione clinica chiarificando il ruolo della meccanica nucleare nella funzione cellulare e nella patologia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica consentendo una valutazione diretta e quantitativa della meccanotrasduzione nucleare, sostenendo sia la ricerca basata su ipotesi sia lo sviluppo di saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul meccanosensing nucleare e la chiarificazione dei percorsi mediante la separazione degli effetti nucleari e citoplasmatici.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per l'analisi comparativa delle risposte meccanosensitive.
- Analisi: Offre misurazioni quantitative della deformazione nucleare e della traslocazione di YAP per analisi statistiche solide.
- Ricerca traslazionale: Offre informazioni meccanicistiche rilevanti per modelli di malattia in cui sono coinvolti i meccanismi nucleari.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi di meccanobiologia su diversi tipi cellulari e condizioni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi isolando i meccanismi di meccanotrasduzione nucleare.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi di meccanobiologia.
- Valore strategico: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione e riduce il rischio biologico in fasi avanzate attraverso letture quantitative e in tempo reale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di obiettivi meccanosensibili corretti in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagineologia di cellule vive, nell'applicazione di forze magnetiche e nell'analisi quantitativa delle immagini.
- Necessita di accesso a microscopia a fluorescenza confocale e a strumentazione per attuatori magnetici.
- Richiede standardizzazione congiunta tra i gruppi di lavoro per la calibrazione delle forze e i protocolli di acquisizione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi cellulari o vie di meccanosensibilità.
- La velocità di analisi e l'intervallo di forze applicabili sono limitati dall'efficienza di internalizzazione dei microsfera e dalla velocità di acquisizione.
