Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo
July 5th, 2022
Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.
In questo metodo, la forza viene applicata direttamente al nucleo. Questo disaccoppia l'effetto di trasmissione della forza dalla membrana plasmatica cellulare e dal citoscheletro, rivelando i meccanismi molecolari del meccanorilevamento nucleare. La forza viene applicata all'interno delle cellule viventi in modo non invasivo.
Rispetto alle pinzette ottiche, il campo magnetico e la forza magnetica non influenzano le funzioni della cella e hanno un throughput più elevato. Iniziare a coltivare le cellule con microsfere magnetiche pesando 0,2 grammi di microsfere di ferro carbonile con sette micrometri di diametro medio. Sospendete le microsfere in un terreno di coltura RPMI 1640 da un millilitro utilizzando una pipetta.
Quindi portare la capsula di Petri con cellule B2B nell'armadio di biosicurezza e aggiungere rapidamente 200 microlitri del mezzo contenente microsfere nella capsula di Petri. Metti la capsula di Petri in un'incubatrice fino a quando le microsfere non vengono interiorizzate dalle cellule. Aprire il microscopio invertito e utilizzando l'imaging a fluorescenza confocale, determinare il momento ottimale per l'internalizzazione delle linee cellulari ogni sei ore visualizzando il confine della microsfera, del nucleare e della cellula.
Le microsfere internalizzate saranno presenti all'interno del confine cellulare. Per l'applicazione di piccole forze e l'imaging di cellule vive, aprire l'applicazione software Elements. Per definire la configurazione del rilevamento magnetico, fare clic sul pulsante uno su due per impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni due secondi.
Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,2 unità Airy. Controllare solo il canale FITC e impostare PMT HV su 70, offset come zero, intensità laser su 10. Per definire il nucleo YAP magnetico di configurazione, impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni quattro secondi facendo clic sul pulsante uno su quattro.
Quindi fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit per impostare la dimensione del foro stenopeico su 1.2 Airy unit e controllare il canale FITC. Impostare PMT HV come 70, offset come zero, intensità laser come 10. Per l'imaging del confine del nucleo e dell'intensità della colorazione nucleare, controllare il canale cianina 5.
Non fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit e impostare PMT HV su 70, offset a zero e intensità laser a 10. La dimensione del foro stenopeico sarà ottimizzata per l'imaging tridimensionale delle proteine associate a YES. Quindi, attiva la DIA tramite Elements.
Aprire la vista di rotazione, utilizzare un campo luminoso e regolare la messa a fuoco dell'oggetto per ottenere un'immagine chiara delle celle. Usa un obiettivo 10X per trovare più celle singole appropriate in tre condizioni, ad esempio una cella con una singola microsfere all'interno, con più microsfere all'interno e senza alcuna microsfere all'interno. Quindi passare all'obiettivo 40X e nominare questa posizione con il numero di posizione appropriato.
Apri Elementi, fai clic su Trova magnetico, rimuovi interblocco, quindi scansiona le schede, quindi seleziona i pulsanti superiore e inferiore per regolare la posizione Z del piano focale per impostare il limite inferiore e superiore per la pila Z delle celle selezionate. Interrompere la scansione facendo nuovamente clic su Scansione. Passare alla configurazione del nucleo YAP magnetico e impostare il nome del file come before_small_force.nd2.
Fare clic sul pulsante Esegui con lo stack Z registrato. Passare al percorso della luce corretto e attivare DIA. Apri la vista di rotazione e fai clic sul pulsante di registrazione.
Spostare il magnete a 46 millimetri sopra il fondo della capsula di Petri ruotando la manopola del dispositivo di movimento del magnete. Salva e controlla il video per confermare lo spostamento delle microsfere indotto dalla forza magnetica. Ripetere la procedura di scansione impostando il nome del file come after_small_force.nd2.
Quindi, passare al percorso della luce destro, attivare DIA e aprire la vista di rotazione prima di fare clic sul pulsante di registrazione. Ruotare la manopola del dispositivo mobile magnetico fino a 120 millimetri sopra il fondo della piastra di Petri e salvare una sequenza di immagini o video a campo chiaro. Ripetere i passaggi per la scansione impostando il nome del file su before_large_force.nd2.
Le microsfere non possono emettere fluorescenza sotto eccitazione laser nel canale FITC o cianina 5. Pertanto, le microsfere internalizzate sono state identificate dalla cavità scura situata nell'imaging confocale della fluorescenza della proteina e del nucleo associati a YES. La circolarità nucleare non ha mostrato differenze significative tra le cellule di controllo e le cellule con internalizzazione delle microsfere.
Anche il rapporto nucleo-citoplasma delle cellule proteiche associate a YES-cellule di controllo co-coltivate con microsfere ma senza internalizzazione e cellule con internalizzazione di microsfere non ha mostrato differenze significative. La deformazione del nucleo e la depolimerizzazione dell'actina sono state causate dalla forza di compressione applicata dalle microsfere nelle cellule contenenti citoscheletro. La curva di calibrazione dell'analisi quantitativa dell'imaging fornita dalla relazione quantitativa di spostamento della forza AFM.
Sulla base di questa relazione, è stata stimata la forza applicata alle perline. La deformazione del nucleo e la traslocazione proteica associata a YES sono state osservate all'applicazione o al rilascio della forza magnetica. I cambiamenti di intensità nella proteina associata a YES nel canale verde e nessun cambiamento nella colorazione del nucleo nel canale rosso hanno confermato che la deformazione nucleare indotta dalla forza magnetica innescata dalla traslocazione della proteina associata a YES.
La quantificazione della variazione netta del rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES-all'interno di due gruppi ha confermato che la forza magnetica applicata alle microsfere all'interno del citoplasma ha indotto la traslocazione proteica associata a YES-e ha modificato il rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES. Prima di applicare la forza e l'imaging, assicurarsi che le cellule abbiano interiorizzato le microsfere magnetiche e che le perle siano all'interno del confine cellulare.
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Panoramica
Questo studio esplora un nuovo protocollo per applicare forza meccanica direttamente al nucleo cellulare utilizzando microsfere magnetiche all'interno di cellule viventi, consentendo al contempo l'imaging fluorescente di cellule vive. Questa tecnica rivela informazioni sui meccanismi di meccanosensing nucleare, funzionando senza disturbare i processi cellulari.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Biologia cellulare
- Meccanobiologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Comprendere il meccanosensing nucleare è cruciale per la funzione cellulare.
- Le tecniche esistenti come le pinzette ottiche sono invasive e meno efficienti.
- Le microsfere magnetiche offrono un metodo non invasivo per studiare questi meccanismi.
Metodi utilizzati
- Applicazione di forza meccanica utilizzando microsfere magnetiche.
- Imaging di cellule vive con microscopia confocale a fluorescenza.
- Analisi quantitativa dell'imaging per misurare la deformazione nucleare indotta dalla forza.
Principali risultati
- L'applicazione di forza dalle microsfere ha portato alla deformazione nucleare e alla traslocazione della proteina associata a YES.
- Nessuna differenza significativa nella circularità nucleare tra cellule di controllo e quelle con internalizzazione di microsfere.
- Lo studio conferma che la forza magnetica influenza i percorsi di meccanotrasduzione nucleare.
Conclusioni
- Questo protocollo fa progredire la comprensione del meccanosensing nucleare.
- Offre un approccio non invasivo per investigare la meccanica cellulare e le vie di segnalazione.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Direct mechanical interrogation of the cell nucleus using 3D magnetic force actuators and live-cell fluorescence imaging enables precise, non-invasive analysis of nuclear mechanotransduction. This approach addresses a critical gap in understanding how nuclear mechanics influence cellular signaling, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The method's quantitative outputs and real-time readouts position it as a strategic asset for mechanistic de-risking and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of nuclear mechanosensing hypotheses independent of membrane and cytoskeletal confounders.
- Supports functional validation of mechanotransduction pathways by quantifying YES-associated protein (YAP) dynamics in response to controlled nuclear deformation.
- Provides mechanistic de-risking by isolating nuclear contributions to cellular signaling, informing target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, live-cell systems for downstream mechanobiology assays.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for YAP translocation and nuclear deformation metrics.
- Enables standardization of force application and imaging parameters, supporting assay scalability and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanobiology by modeling nuclear responses to mechanical stress in engineered cell lines.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing quantitative biomarkers of nuclear mechanotransduction.
- Reduces translational risk by clarifying the role of nuclear mechanics in cell function and pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct, quantitative assessment of nuclear mechanotransduction, supporting both hypothesis-driven research and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nuclear mechanosensing and pathway clarification by decoupling nuclear and cytoplasmic effects.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of mechanosensitive responses.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of nuclear deformation and YAP translocation for robust statistical analysis.
- Translational Research: Offers mechanistic insights relevant to disease models where nuclear mechanics are implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanobiology studies across diverse cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating nuclear mechanotransduction mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through quantitative, real-time readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanosensitive targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, magnetic force application, and quantitative image analysis.
- Needs access to confocal fluorescence microscopy and magnetic actuator instrumentation.
- Demands cross-team standardization of force calibration and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or mechanosensitive pathways.
- Throughput and force range are limited by microbead internalization efficiency and imaging speed.
