Name: Progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri come costruire un microscopio a foglio luminoso monoobiettivo per visualizzare reti di citoscheletri in campioni biologici tridimensionali. Questo metodo riduce il fotobleaching e migliora la sezione ottica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) a J.S. Siamo grati per la guida fornita dal Dr. Bin Yang e dal Dr. Manish Kumar durante il processo di allineamento. Ringraziamo la Dott.ssa Jenny Ross e la K. Alice Lindsay per le istruzioni di preparazione dei motori della chinesina.

Microscopio a fluorescenza personalizzabile per visualizzare le reti di citoscheletro

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
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 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Tutte le ricerche sono state condotte in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potessero essere interpretate come un conflitto di interessi.

Due dettagli importanti relativi a questo protocollo sono il costo complessivo del sistema e il tempo previsto di costruzione e allineamento. Sebbene il costo esatto sia variabile, possiamo tranquillamente stimare che il costo in toto di questo SOLS o di un sistema fai-da-te simile si aggirerebbe intorno agli 85.000 dollari. Notiamo che questa stima considera il prezzo al dettaglio di tutti i componenti, quindi questo prezzo complessivo può essere notevolmente ridotto acquistando componenti usati. In termini di tempo di costruzione, sarebbe ragionevole aspettarsi che un utente con poca esperienza ottica costruisca e allinei l'intero sistema SOLS entro 1-2 mesi, a condizione che tutti i componenti siano disponibili e pronti. Nonostante la lunghezza e la complessità del protocollo, riteniamo che la quantità di dettagli nel manoscritto scritto, abbinata al protocollo video, dovrebbe rendere questo protocollo semplice e veloce da seguire.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il posizionamento del galvo determina il posizionamento di molti obiettivi in quanto fa parte di tre coppie di lenti 4f separate. È fondamentale che il galvo sia coniugato con i piani focali posteriori di O1 e O2 e centrato correttamente per garantire una scansione invariante dell'inclinazione. In secondo luogo, la qualità dell'immagine è estremamente sensibile all'allineamento di O2 e O3 l'uno rispetto all'altro. In questo caso, è necessario prestare attenzione per garantire che, in primo luogo, l'angolo di allineamento da O3 a O2 corrisponda all'inclinazione del foglio luminoso di eccitazione, fornendo così un'illuminazione il più possibile piatta attraverso il FoV inclinato in modo simile. In secondo luogo, l'O3 deve essere posizionato alla distanza assiale corretta per mantenere un FoV piatto con un'area il più ampia possibile. In terzo luogo, l'O3 deve essere posizionato alla corretta distanza laterale dall'O2 per massimizzare il segnale che passa attraverso l'interfaccia O2-O3.

In termini di FoV utilizzabile, questo sistema ha ottenuto un campo piatto e affidabile con un'illuminazione costante su un'area di 80 μm x 80 μm. Quest'area è più piccola del FoV massimo fornito dalla telecamera, quindi il FoV utilizzabile è indicato dal riquadro giallo nella Figura 13. In termini di potere risolutivo, questo sistema ha raggiunto una distanza minima risolvibile di 432 nm lungo l'asse x e 421 nm lungo l'asse y, che è stata misurata trovando la media sigma x e y delle funzioni di diffusione gaussiane (PSF) nel FoV buono e moltiplicando per due. Notiamo che questo sistema non è stato ottimizzato in termini di NA totale, il che significa che c'è spazio per miglioramenti significativi se gli utenti desiderano un potere risolutivo superiore a quello che questo sistema ha raggiunto. Ci sono una moltitudine di opzioni di obiettivi compatibili per questo tipo di build SOLS, molte delle quali contribuirebbero a una maggiore risoluzione del sistema ma con gli svantaggi di un costo più elevato, un FoV più piccolo o tecniche di allineamento più complicate all'interfaccia del relè 8,11,13,20. Separatamente, se gli utenti desiderano un FoV più ampio, l'incorporazione di un secondo galvo per consentire la scansione 2D raggiungerebbe questo obiettivo, ma richiederebbe l'integrazione di ottiche e meccanismi di controllo aggiuntivi nel progetto32. Abbiamo fornito maggiori dettagli sulle modifiche al sistema sulla pagina del nostro sito Web, insieme a collegamenti ad altre risorse utili relative al processo di progettazione23.

Oltre a migliorare i componenti specifici per questo particolare progetto, sarebbe molto fattibile aggiungere altre tecniche o modalità di microscopia ad alta risoluzione a questa build. Uno di questi miglioramenti sarebbe quello di incorporare l'illuminazione a più lunghezze d'onda, che comporterebbe l'allineamento di laser di eccitazione aggiuntivi al percorso di eccitazione originale8. Inoltre, poiché questo tipo di design SOLS lascia il campione accessibile, l'aggiunta di ulteriori funzioni al microscopio, tra cui, ma limitatamente, pinzette ottiche, microfluidica e reometria, è relativamente semplice 2,33.

Rispetto alla miriade di guide light-sheet che sono state pubblicate, questo protocollo fornisce istruzioni a un livello di comprensione che un utente senza una significativa esperienza ottica può trovare utile. Rendendo accessibile a un pubblico più ampio una build SOLS di facile utilizzo con le tradizionali capacità di montaggio dei vetrini campione, speriamo di consentire un'ulteriore espansione delle applicazioni della ricerca basata su SOLS in tutti i campi in cui lo strumento è stato o potrebbe essere utilizzato. Anche con le applicazioni degli strumenti SOLS in rapida crescita nel numero 2,34,35, crediamo che molti vantaggi e utilizzi degli strumenti di tipo SOLS rimangano ancora inesplorati ed esprimiamo entusiasmo per le possibilità di questo tipo di strumento in futuro.

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) rappresenta una famiglia di tecniche di imaging a fluorescenza ad alta risoluzione in cui la luce di eccitazione è modellata in un foglio 1,2, tra cui la microscopia a illuminazione piana selettiva (SPIM), l'eccitazione planare ad allineamento confocale (SCAPE) e la microscopia a piano obliquo (OPM)3,4,5,6,7. A differenza di altre modalità di microscopia come l'epifluorescenza, la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) o la microscopia confocale, la fototossicità è minima nella LSFM e i campioni possono essere sottoposti a imaging su scale temporali più lunghe perché solo il piano del campione oggetto dell'imaging attivo è illuminato 8,9,10. Pertanto, le tecniche LSFM sono estremamente utili per l'imaging di campioni 3D per periodi di tempo prolungati, in particolare anche quelli troppo spessi per le tecniche di microscopia confocale. Per questi motivi, dal suo sviluppo originale nel 2004, LSFM è diventata la tecnica di imaging preferita da molti fisiologi, biologi dello sviluppo e neuroscienziati per la visualizzazione di interi organismi come pesci zebra vivi ed embrioni di Drosophila 3,4,6,11 . In questi ultimi due decenni, i vantaggi di LSFM sono stati sfruttati per visualizzare la struttura e la dinamica su scale progressivamente più piccole, tra cui la scalatissutale 11,12, cellulare e subcellulare, sia in vivo che in vitro13,14,15,17.
Nonostante le segnalazioni di casi d'uso di successo in letteratura, l'elevato costo dei sistemi LSFM commerciali (~0,25 milioni di dollari al momento della stesura di questo articolo)18,19 impedisce l'uso diffuso della tecnica. Per rendere le build fai-da-te un'alternativa fattibile per i ricercatori, sono state pubblicate diverse guide alla compilazione 8,13,20,21, tra cui lo sforzo ad accesso aperto OpenSPIM 22. Tuttavia, ad oggi, i ricercatori con un'esperienza ottica minima possono utilizzare solo progetti LSFM precedenti, che sono incompatibili con i tradizionali campioni montati su vetrino (Figura 1A). La recente implementazione SOLS (single-goal, light-sheet) utilizza un unico obiettivo sia per l'eccitazione che per il rilevamento (Figura 1C), superando così la limitazione relativa alla compatibilità 5,6,8,13,20. Tuttavia, il costo per la versatilità del progetto SOLS è un aumento sostanziale della complessità della costruzione a causa della necessità di due obiettivi aggiuntivi per trasmettere, de-inclinare e ricreare l'immagine del piano dell'oggetto sulla fotocamera per l'imaging (Figura 1D). Per facilitare l'accesso alle complesse configurazioni in stile SOLS, questo documento presenta una guida passo passo sulla progettazione, la costruzione, il processo di allineamento e l'uso di un sistema SOLS compatibile con le diapositive, che sarebbe utile ai ricercatori con conoscenza solo di un corso di ottica entry-level.
Sebbene il protocollo stesso sia succinto, i lettori devono fare riferimento ad altre risorse durante le fasi di preparazione per saperne di più su parti particolari del progetto o considerazioni sull'hardware. Tuttavia, se un lettore intende seguire le specifiche di questo progetto, potrebbe non essere necessario capire come selezionare particolari componenti ottici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Figura 1: Caratteristiche delle diverse configurazioni LSFM. (A) La configurazione con due obiettivi ortogonali comuni nei primi progetti LSFM. In questa configurazione, per contenere il campione viene utilizzato un tubo capillare o un cilindro di gel, che non è compatibile con le tradizionali tecniche di montaggio del vetrino. (B) Uno schema di un progetto di foglio luminoso SOLS che mostri quanto segue: (C) l'unico obiettivo utilizzato sia per l'eccitazione che per la raccolta delle emissioni sul piano del campione (O1); ciò consente di montare una slitta tradizionale sulla parte superiore e (D) il sistema di obiettivi a relè nel percorso di emissione SOLS. O2 raccoglie la luce di emissione e ingrandisce l'immagine. O3 riprende l'aereo con l'angolo di inclinazione corretto sul sensore della fotocamera. Abbreviazioni: LSFM = microscopia a fluorescenza a foglio luminoso; SOLS = foglio luminoso monoobiettivo; O1-O3 = obiettivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Lente piano-concava da 1" f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Per laser di allineamento Costo stimato: $ 49,5</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 1" f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 e laser di allineamento Costo stimato: $ 342,42</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 1" f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Costo stimato: $ 114,14</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 1" f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Costo stimato: $ 114.14</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 1" f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Costo stimato: $ 114.14</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 1" f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Costo stimato: $ 114.14</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 1" f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Costo stimato: $ 114.14</td></tr><tr><td>Lente cilindrica da 1" f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Costo stimato: $ 117.62</td></tr><tr><td>Lente cilindrica da 1" f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Costo stimato: $ 111.22</td></tr><tr><td>Lente cilindrica da 1" f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Costo stimato: $ 117.62</td></tr><tr><td>1" Foro stenopeico montato, 30 &; m Diametro foro stenopeico</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Costo stimato: $ 77.08</td></tr><tr><td>Specchio d'argento da 1 "(x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, uno per allineamento Costo stimato: $ 168.78</td></tr><tr><td>Specchio ellittico da 2"</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Costo stimato: $ 179.98</td></tr><tr><td>Portapalo da 2" (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Per montaggio laser personalizzato, ruota ND, schermi di sicurezza Costo stimato: $ 98,45</td></tr><tr><td>Post da 2" (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Per supporto laser personalizzato e componenti ottici Costo stimato: $ 277,3</td></tr><tr><td>Post da 3" (x4)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR3</td><td>Per supporti M3 e altri supporti Costo stimato: $ 24.6</td></tr><tr><td>Portapalo da 3" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>Costo stimato: $ 38.48</td></tr><tr><td>Adattatore per gabbia da 30 a 60 mm&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Per montare O1 Costo stimato: $ 45,42</td></tr><tr><td>Ruota portafiltri a gabbia da 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Per montare filtri ND Costo stimato: $ 172,36</td></tr><tr><td>Piastra a gabbia da 30 mm (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Per costruire gabbia di allineamento e laser di allineamento Costo stimato: $ 114,54</td></tr><tr><td>Supporto per specchio cinematico ad angolo retto da 30 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Per montare M1 e M2 e per l'allineamento laser Costo stimato: $ 463,95</td></tr> Supporto <tr><td>per palo da 4 "(x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Costo stimato: $ 320,1</td></tr><tr><td>Laser e alimentatore da 561 nm&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Laser di eccitazione Costo stimato: $ 6000</td></tr><tr><td>Piastra a gabbia da 60 mm (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Per montare il supporto TL1 e M3 Costo stimato: $ 88,52</td></tr> Supporto <tr><td>per specchio cinematico ad angolo retto da 60 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Per montare M3 Costo stimato: $ 187,26</td></tr><tr><td>90 gradi; Flip Mount</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>Per l'allineamento laser Costo stimato: $ 95,5</td></tr><tr><td>Adattatore con filettature C-Mount esterne e filettature SM1 interne</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Per collegare il tubo dell'obiettivo alla fotocamera Costo stimato: $ 20,96</td></tr><tr><td>Adattatore con filettature SM1 esterne e filettature interne C-Mount</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Per collegare l'obiettivo del tubo all'attacco dell'obiettivo Costo stimato: $ 21,82</td></tr><tr><td>Adattatore con filettature SM1 esterne e filettature M25 interne (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Per montare O1 e O2 Costo stimato: $ 47,06</td></tr><tr><td>Adattatore con filettature SM1 esterne e filettature M26 interne</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Per montare O3 Costo stimato: $ 22.38</td></tr><tr><td>Disco di allineamento</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Costo stimato: $ 20.45</td></tr><tr><td>Laser di allineamento</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Costo stimato: $ 16,98</td></tr><tr><td>Vetrino in plastica autoluorescente, rosso</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Costo stimato: $ 20</td></tr><tr><td>Otturatore a fascio&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>Per bloccare la luce laser Costo stimato: $ 65,8</td></tr><tr><td>Supporto di rotazione della gabbia (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>Per montare CL1-3 Costo stimato: $ 282,15</td></tr><tr><td>Aste del sistema di gabbie da 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>Per montare M3 e O1 Costo stimato: $ 44.8</td></tr><tr><td>Aste del sistema a gabbia 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>Per montare O3 Costo stimato: $ 14,28</td></tr><tr><td>Aste del sistema di gabbie 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Per montare slit Costo stimato: $ 30,76</td></tr><tr><td>Aste per sistema a gabbia 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>Per l'allineamento delle lenti del tubo Costo stimato: $ 25,3</td></tr><tr><td>Aste del sistema di gabbie 12" (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Per l'allineamento della gabbia Costo stimato: $ 145,36</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Costo stimato: ~ $ 14,000</td></tr><tr><td>Forca di serraggio (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Per bloccare i supporti dei Costo stimato: $ 338,8</td></tr><tr><td>Vetro di copertura, 22 x 22 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Per campioni di diapositive Costo stimato: $ 265</td></tr><tr><td>Dicroico&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>Per dividere i percorsi di escissione/emissione Costo stimato: $ 965</td></tr><tr><td>Stadio di traslazione a coda di rondine</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>Per traslare il foro stenopeico Costo stimato: $ 90,55</td></tr><tr><td>Filtro emissioni</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Costo stimato: $ 140,99</td></tr><tr><td>Disco di allineamento in vetro smerigliato (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Per gabbia di allineamento e piano intermedio Costo stimato: $ 75,14</td></tr><tr><td>Generatore di funzioni</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>Per controllare il galvo Costo stimato: $ 900</td></tr><tr><td>Galvanometro - Sistema 1D di grande diametro del fascio</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Costo stimato: $ 1715,78</td></tr><tr><td>Alimentatore galvanometro</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>Costo stimato: $ 300</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Gomma di gellano per campione di perline 3D Costo stimato: $ 68,25</td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td>Download open source</td><td></td><td>da https://imagej.net/software/fiji/downloads Costo stimato:</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante/agitatore</td> gratuito <td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Per la preparazione di soluzioni campione Costo stimato: $ 550</td></tr><tr><td>K-Cube Controller per motori a spazzole</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Aziona Z825B Costo stimato: $ 757,51</td></tr><tr><td>Supporto cinematico</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Per montare dicroico Costo stimato: $ 92,01</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>Scarica da https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Costo stimato:</td></tr><tr><td>blocco della luce laser gratuito&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LB1</td><td>Per riflessioni del filtro ND Costo stimato: $ 57,65</td></tr><tr><td>Supporto laser</td><td>su</td><td></td> misura <td>stampato in 3D Costo stimato: Schermo</td></tr><tr><td>di sicurezza laser N/A (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>per bloccare la luce laser parassita Costo stimato: $ 92.02</td></tr><tr><td>Lente per tubo di scansione laser</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Costo stimato: $ 1491</td></tr><tr><td>Attacco obiettivo (x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Per montare tutte le lenti e lo specchio di allineamento extra. Costo stimato: $ 164,7</td></tr><tr><td>Righello magnetico</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Per controllare l'allineamento Costo stimato: $ 52,74</td></tr><tr><td>Software Micro-Manager&nbsp;</td><td>Download open source</td><td></td><td>da https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Costo stimato:</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td> gratuiti <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12550400</td><td>Per i campioni di vetrini Costo stimato: $ 123,9</td></tr><tr><td>Tavolino per microscopio&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 con parti personalizzate</td><td>Per tradurre con precisione i campioni Costo stimato: ~ $ 16.000</td></tr><tr><td>Mini miscelatore a vortice&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Per la preparazione del campione Costo stimato: $ 152,64</td></tr><tr><td>Attuatore motorizzato</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Per traslare con precisione M1 Costo stimato: $ 729,07</td></tr><tr><td>Montato su iride standard (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Almeno 2 per l'allineamento Costo stimato: $ 118,02</td></tr><tr><td>Set di filtri ND&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>Per ridurre l'intensità di eccitazione Costo stimato: $ 726,73</td></tr><tr><td>Obiettivo 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Costo stimato: ~$ 15.000</td></tr><tr><td>Obiettivo 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>Costo stimato O2 : ~$6.000</td></tr><tr><td>Obiettivo 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 Costo stimato: ~$ 6.800</td></tr><tr><td>Software OPM Deskewing</td><td>Open-source</td><td></td><td>Per l'elaborazione delle immagini. Scarica da https://github.com/QI2lab/OPM Costo stimato:</td></tr><tr><td>Sensore di potenza a fotodiodo</td> gratuito <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>Per misurare l'intensità del laser Costo stimato: $ 379,68</td></tr><tr><td>Obiettivo di distorsione della griglia positiva</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Allineamento in campo chiaro Costo stimato: $ 267,87</td></tr><tr><td>Power Meter Digital Console</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>Per misurare l'intensità del laser Costo stimato: $ 1245,48</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>Per campione di vetrini con rivestimento fluorescente Costo stimato: $ 27.7</td></tr><tr><td>Morsetto ad angolo retto per pali</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>Per supporto M3 e specchio ribaltabile Costo stimato: $ 32.46</td></tr><tr><td>Piastra gabbia filettata RMS (x2)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>CP42</td><td>Per l'allineamento laser Costo stimato: $ 70,56</td></tr><tr><td>Piastra di taglio 2,5-5,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>Costo stimato: $ 182,85</td></tr><tr><td>Piastra di taglio 5,0-10,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Costo stimato: $ 201,47</td></tr><tr><td>Piastra di taglio 10,0-25,4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Costo stimato: $ 236,42</td></tr><tr><td>Schermo di visualizzazione della piastra di taglio</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>Costo stimato: $ 337,74</td></tr><tr><td>Interferometro di taglio con piastra da 1-3 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>Per il controllo della collimazione Costo stimato: $ 465,85</td></tr><tr><td>Collare Slip-On (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>Per mantenere l'altezza del palo Costo stimato: $ 208,25</td></tr><tr><td>Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>Costo stimato: $ 294,64</td></tr><tr><td>Tubo per lenti a fessura, 3 "</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>SM1L30C <td>Per l'allineamento laser Costo stimato: $ 77,45</td><td></td></tr> <tr><td>Specchio quadrato, 1 x 1"</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& HVRand=1336734911900437 4691& hvpone=& HVPTWO=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 Costo stimato: $ 14,76</td></tr><tr><td>Tubo obiettivo impilabile 1/2" (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>Per montare CL1-3 Costo stimato: $ 40,86</td></tr><tr><td>Tubo obiettivo impilabile 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>Per montare O3 Costo stimato: $ 15,41</td></tr><tr><td>Tubo obiettivo impilabile 2" (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Per il percorso della fotocamera Costo stimato: $ 35.7</td></tr><tr><td>Adattatore base piedistallo borchiato (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>Per fissare i supporti per palo al tavolo Costo stimato: $ 400,71</td></tr><tr><td>Supporto per obiettivo di traslazione (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>Per traslare con precisione il foro stenopeico, O2 e O3 Costo stimato: $ 441</td></tr><tr><td>Stadio di traslazione con micrometro standard (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Costo stimato: $ 647,54</td></tr><tr><td>Stadio di traduzione manuale da viaggio</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>Supporto di traslazione a gabbia O3 Costo stimato: $ 497.3</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>tubolare Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 Costo stimato: $ 359</td></tr><tr>Thorlabs<td>LED montato in bianco</td><td>&nbsp;</td>Sorgente luminosa a campo chiaro <td>MNWHL4</td><td> Costo stimato: $ 171,28</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>COSTO TOTALE STIMATO: $ 84.858,98</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Gli autori notano che molte parti sono state acquistate usate. Qui, abbiamo cercato di riflettere il prezzo al dettaglio di tutti gli articoli, in modo che il costo totale possa essere notevolmente ridotto acquistando particolari articoli usati, specialmente quelli più costosi.</td></tr><tr><td>COMPONENTI OPZIONALI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Per controlli diagnostici durante l'allineamento. La fotocamera Acquisiton può essere utilizzata al suo posto, ma richiede un successivo riallineamento. Costo stimato: $ 1089</td></tr></tbody></table>

progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

I compositi del citoscheletro ricostituito sono emersi come un valido sistema modello per lo studio della materia soffice di non equilibrio. L'acquisizione fedele della dinamica di queste reti 3D e dense richiede il sezionamento ottico, che è spesso associato ai microscopi confocali a fluorescenza. Tuttavia, i recenti sviluppi della microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) l'hanno resa un'alternativa economica e, a volte, superiore. Per rendere LSFM accessibile ai ricercatori di citoscheletri che hanno meno familiarità con l'ottica, presentiamo una guida passo passo per principianti alla costruzione di un microscopio a fluorescenza versatile a foglio luminoso da componenti standard. Per consentire il montaggio del campione con i tradizionali campioni di vetrini, questo LSFM segue il design SOLS (single-objective light-sheet), che utilizza un unico obiettivo sia per l'eccitazione che per la raccolta delle emissioni. Descriviamo la funzione di ogni componente del SOLS in modo sufficientemente dettagliato da consentire ai lettori di modificare la strumentazione e progettarla in base alle loro esigenze specifiche. Infine, dimostriamo l'uso di questo strumento SOLS personalizzato visualizzando gli astri in reti di microtubuli guidate dalla chinesina.

Sono state eseguite scansioni volumetriche di perle da 1 μm incorporate nella gomma di gellano. La Figura 14 mostra le proiezioni di intensità massima delle scansioni volumetriche raddrizzate lungo le direzioni x, y e z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Figura 14: Imaging volumetrico di microsfere fluorescenti da 1 μm in gomma di gellano. Vengono mostrate le proiezioni di massima intensità delle scansioni volumetriche raddrizzate. Barre di scala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Abbiamo dimostrato l'uso del microscopio a foglio di luce monoobiettivo per caratterizzare reti di citoscheletri ricostituiti eseguendo scansioni volumetriche di campioni di astri microtubuli. In breve, i microtubuli marcati con rodamina e stabilizzati con taxolo sono stati polimerizzati da dimeri ricostituiti mediante GTP; quindi, dopo la polimerizzazione, i cluster motori della chinesina a base di streptavidina sono stati miscelati in campioni insieme all'ATP per concentrazioni finali di microtubuli da 6 μM, dimeri di chinesina da 0,5 μM e ATP da 10 mM. Protocolli e guide approfonditi per la preparazione di microtubuli stabilizzati con taxolo e cluster motori di chinesina sono disponibili sui siti web del Mitchson Lab e del Dogic Lab25,26. I campioni sono stati pipettati delicatamente in vetrini da microscopio, sigillati e lasciati riposare per 8 ore prima dell'imaging per consentire la cessazione dell'attività motoria in modo che i campioni raggiungessero uno stato strutturale stabile che assomigliava agli astri.
Gli studi sui sistemi di citoscheletro ricostituito impiegano più frequentemente la microscopia confocale o a epifluorescenza per l'immagine di filamenti marcati. Tuttavia, entrambe queste tecniche sono limitate nella loro capacità di visualizzare campioni 3D densi27. Mentre sono stati fatti molti progressi nella ricerca sulla materia attiva basata sul citoscheletro in vitro vincolando i campioni ad essere quasi 2D28,29, le reti di citoscheletro sono intrinsecamente 3D e molti sforzi attuali risiedono nella comprensione degli effetti che possono verificarsi solo nei campioni 3D29,30, creando così la necessità di imaging 3D ad alta risoluzione.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Figura 15: Facilitazione della visualizzazione 3D di campioni di citoscheletro ricostituiti mediante microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo. (A) Immagini di astri di microtubuli fluorescenti acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica DMi8. Le immagini mostrano piani diversi da uno z-scan. Barra della scala = 30 μm. (B) Immagini raddrizzate deconvolute da una scansione volumetrica eseguita sulla configurazione del foglio luminoso a obiettivo singolo dello stesso campione. Barra della scala = 30 μm. L'area dell'immagine raddrizzata qui corrisponde al FoV utilizzabile (riquadro giallo) mostrato nella Figura 13B. Mentre il confocale eccelle nell'imaging di singoli piani vicino al vetrino coprioggetto, la densità del campione fluorescente introduce complicazioni quando si esegue l'imaging su piani più alti a causa del segnale aggiuntivo proveniente da sotto il piano di imaging. Il foglio luminoso aggira questo problema illuminando solo il piano di imaging, consentendo così un'immagine uniformemente nitida su diversi piani in z. Abbreviazioni: SOLS = foglio luminoso monoobiettivo; FoV = campo visivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Nella Figura 15, mostriamo l'imaging volumetrico di una rete di microtubuli ricostituita contratta in strutture simili ad aster da cluster motori di chinesina. Come mostrato in una precedente ricerca28,31, queste strutture 3D tendono a crescere dense verso il centro, risultando in regioni luminose di fluorescenza che sono predominanti nel segnale. Nei piani di imaging vicino al vetrino coprioggetto (basso livello z), la microscopia confocale (Figura 15A) può risolvere singoli filamenti intorno alla periferia dell'astro, con uno sfondo aggiuntivo verso il centro a causa dei segnali di fluorescenza fuori fuoco dall'alto. Tuttavia, spostandosi di alcuni micron in z si riduce rapidamente la qualità delle immagini a causa delle sezioni dense fuori fuoco dell'astro che sono predominanti nel segnale nel piano di imaging. L'illuminazione su un solo piano del foglio luminoso (Figura 15B) elimina i segnali sfocati dalle parti dense dell'astro sopra e sotto il piano di imaging, consentendo così una qualità dell'immagine comparabile tra i piani. La capacità del foglio luminoso di produrre dati di scansione volumetrica affidabili e di alta qualità apre la possibilità di visualizzare e caratterizzare fenomeni 3D in sistemi di citoscheletro ricostituiti.

Questo protocollo descrive in dettaglio come costruire un microscopio a fluorescenza a singolo obiettivo e il suo utilizzo per la visualizzazione di reti di citoscheletro.

Progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Il nostro lavoro mira a far progredire le conoscenze sulla relazione tra le dinamiche di trans lavoro, la struttura locale e le proprietà meccaniche in materiali lontani dall'equilibrio. La visualizzazione di materiali lontani dall'equilibrio, come le reti di citoscheletro, richiede la capacità di visualizzare campioni densi e tridimensionali con una qualità dell'immagine comparabile in tutto il volume del campione, causando al contempo danni minimi tramite fotosbiancamento, un compito tecnicamente impegnativo per il quale la microscopia a fluorescenza è più adatta. I sistemi di microscopio a fluorescenza a foglio di luce offrono eccellenti capacità di sezionamento ottico, che consentono l'imaging di questi campioni spessi e tridimensionali per lunghe scale temporali con un fotosbiancamento minimo.In particolare, il sistema a foglio luminoso a singolo obiettivo che presenteremo è compatibile con i tradizionali campioni montati su vetrino, il che lo rende uno strumento molto versatile. La stragrande maggioranza delle guide a foglio luminoso a obiettivo singolo sono scritte per utenti con una vasta esperienza di ottica. Per rendere più accessibile la complessa configurazione in stile foglio luminoso a obiettivo singolo, questa guida dettagliata fornisce i passaggi che un utente con una conoscenza approfondita del corso di ottica entry-level può seguire.

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In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l'uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Immagini microscopiche dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina permette la caratterizzazione dei cambiamenti dinamici nelle strutture del citoscheletro. A differenza delle tecniche che utilizzano campioni fissati, questo metodo fornisce una valutazione dettagliata delle variazioni temporali del citoscheletro di actina nelle cellule stesse prima, durante e dopo vari stimoli fisici, farmacologici o infiammatoria.

Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni.

Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt; Sviluppo

Un modulo per singolo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari 3-dimensionale. Il campione si trova all'interno di un capillare rettangolare, e tramite un sistema di microfluidica coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci può essere applicato in piccole quantità.

Singolo Aereo Illuminazione Module e approccio micro-capillare per un microscopio a largo campo

Qui sono mostrati la preparazione di doppi strati lipidici planari supportati da vetro funzionalizzati con proteine, la determinazione della mobilità proteica all'interno e la misurazione delle densità proteiche. Viene delineata una tabella di marcia per la costruzione di un microscopio a riflessione interna totale a rumore ridotto, che consente di visualizzare fluorocromi residenti a doppio strato con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Un'istruzione dettagliata è descritta su come costruire un altamente propenso spazzato tile (HIST) microscopio e suo utilizzo per l'imaging di singola molecola.

Una guida per costruire un altamente propenso spazzato Tile microscopio per l'esteso campo di vista singola molecola Imaging

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è lo strumento più prezioso nella biologia dello sviluppo. Uno dei principali problemi degli studi comparativi è la varianza ambientale. Il nostro protocollo descrive un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo di più campioni e, pertanto, affronta questo problema in modo pro-attivo.

Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Scopri come costruire un microscopio a foglio luminoso monoobiettivo per visualizzare reti di citoscheletri in campioni biologici tridimensionali. Questo metodo riduce il fotobleaching e migliora la sezione ottica.

Progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri (Video) | JoVE Journal

Progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri

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