Valutazione dinamica della funzione piastrinica multiparametrica mediante un biosensore capacitivo

Stiamo progettando un test per valutare la funzione piastrinica in contesti fisiologici, per affrontare la limitazione dei test attuali attivando le piastrine in un microambiente semirigido con un sensore di capacità di membrana. Il test misura la conta piastrinica, la forza di stimolazione e le vie di attivazione. Questo strumento offre un approccio completo per lo studio dei meccanismi piastrinici durante l'emostasi.

Il nostro protocollo è in grado di valutare più parametri della piastrina nel singolo test in condizioni fisiologiche. Ci concentreremo sul miglioramento di questo protocollo e sullo sviluppo di altri sensori per la valutazione dell'emostasi. Inizia utilizzando un software di layout CAD standard per progettare il layout del chip di capacità della membrana del team, o MCC, per un substrato di wafer di silicio da quattro pollici per il processo di microfabbricazione come descritto nel manoscritto.

Per la biofunzionalizzazione, pulire l'elettrodo di rilevamento del TMCC utilizzando il plasma di ossigeno per 45 secondi a 100 watt. Aggiungere una soluzione di Do Decanale in etanolo 200 proof al pozzetto del campione sui TMCC. Mettere i TMCC in un contenitore riempito con azoto secco.

Sigillare il contenitore e avvolgerlo con parafilm per 24-48 ore. Dopo due giorni, sciacquare la superficie dorata del TMCC con acqua deionizzata ed etanolo a 200 gradi. Asciugare i TMCC con azoto gassoso a temperatura ambiente.

Aggiungere la soluzione di fibronectina umana in PBS al pozzetto del campione di TMCC e incubare a 37 gradi Celsius per due-otto ore. Per la configurazione del sensore di capacità, utilizzare un misuratore LCR con micro posizionatori e sonde ad ago per stabilire il contatto elettrico con il sensore. Utilizza dispositivi di plastica stampati in 3D per posizionare in modo sicuro TMCC e BMCC.

Assicurarsi che l'attrezzatura inferiore sia dotata di fermi sull'asse XY per allineare con precisione il TMCC sul BMCC, formando un condensatore. Applicare un segnale sinusoidale di 0,5 volt a 100 kilohertz con una frequenza di campionamento di otto hertz. Per ottenere plasma ricco di piastrine concentrato, o CPRP, centrifugare i campioni di sangue umano.

Trasferire il CPRP in un contenitore sterile ed eseguire la conta piastrinica. Per gli studi sugli inibitori, incubare il CPRP con una concentrazione predefinita di aspirina nel tampone di Tyrode. Per il test funzionale delle piastrine, assemblare TMCC e BMCC nelle fixture stampate in 3D.

Misurare la capacità di base degli MCC assemblati per cinque minuti, quindi aggiungere 45 microlitri di CPRP al pozzetto del campione nel TMCC e attendere 30 minuti per consentire alle piastrine di aderire all'elettrodo rivestito di fibronectina nel TMCC. Quindi, rimuovere 30 microlitri di CPRP dal pozzetto del campione senza disturbare le piastrine aderenti e riempire nuovamente il pozzetto con il tampone di Tyrode. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 10 microlitri della soluzione agonista alla concentrazione desiderata ed equilibrare il campione per 80 minuti.

Misurare la variazione massima della capacità dopo l'adesione di 30 minuti per determinare l'adesione delta C. Per la fase di attivazione, misurare la variazione massima della capacità, denominata attivazione del delta C. Calcolare la pendenza della curva di capacità tra 200 e 300 secondi dopo l'attivazione per determinare l'attivazione S.

Esegui analisi statistiche utilizzando l'analisi della varianza con il test post-operatorio di Tukey per confrontare i risultati tra i gruppi. Usa la bontà di adattamento di Shapiro-Wilk per testare la distribuzione normale. Una soluzione CPRP con una conta piastrinica predeterminata ha mostrato una diminuzione lineare della capacità durante l'adesione.

Una diminuzione esponenziale dello stato stazionario è stata osservata dopo l'attivazione della trombina. I valori di adesione del Delta C hanno mostrato una forte correlazione con la conta piastrinica in un intervallo di conta piastrinica, con una riduzione significativa a 1,3 millimoli di concentrazione di aspirina. Il tasso di diminuzione esponenziale della capacità in seguito alla stimolazione piastrinica è aumentato con la concentrazione cellulare.

Anche l'entità della perdita di capacità è cresciuta con concentrazioni più elevate, mostrando una chiara tendenza all'aumento dell'attivazione del delta C. Una tendenza simile è stata osservata per l'attivazione di S e la conta piastrinica. Con l'aumento del dosaggio dell'aspirina, la capacità, l'attivazione del delta C e l'attivazione di S hanno mostrato tendenze decrescenti.

È stata osservata una differenza statisticamente significativa nell'attivazione di S tra dosi alte e medie, mentre non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nell'attivazione di Delta C. I segnali di capacità per i campioni CPRP attivati con trombina hanno mostrato che la riduzione della capacità diventava più pronunciata con l'aumentare della concentrazione di trombina. Sia l'attivazione del delta C che l'attivazione del S hanno mostrato un andamento statisticamente significativo con i livelli di trombina.