Name: Valutazione dellattività di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA utilizzando saggi reporter ad alto rendimento e quantitativi basati sulla luminescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Scopri saggi reporter luminescenti per valutare la riparazione delle rotture del doppio filamento del DNA nelle cellule. Questi metodi quantitativi supportano la scoperta di farmaci oncologici e accelerano l'identificazione di nuove terapie mirate.

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Tutto il lavoro è stato finanziato da Artios Pharma Ltd. Figure 1 e Figure 3 sono state create con Biorender.com.

Quantificazione della riparazione della rottura del doppio filamento del DNA con i saggi reporter della nanoluciferasi

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
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<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S e H.M.R.R. sono tutti dipendenti e azionisti di Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. è un azionista di AstraZeneca PLC. S.J.B. è uno scienziato fondatore e azionista di Artios Pharma Ltd. È stato depositato un brevetto su alcuni dei reporter delineati in questo studio (WO 2021/001647). Promega è la fonte della tecnologia NanoLuc® e dei polinucleotidi NanoLuc® modificati. Artios Pharma è stata autorizzata da Promega a generare i polinucleotidi NanoLuc® modificati.

Qui, abbiamo descritto i protocolli per la generazione e l'implementazione di una suite di reporter basati sulla luminescenza extracromosomica per misurare la competenza cellulare delle quattro principali vie DSBR (HR, NHEJ, MMEJ e SSA)7. I substrati reporter possono essere introdotti nelle cellule mediante trasfezione transitoria e utilizzati per valutare l'attività del DSBR utilizzando una lettura sensibile e robusta della luminescenza di NanoLuc basata su piastra, che viene ricostituita dopo l'interazione con percorsi DSBR cellulari affini.
Diverse fasi della generazione del substrato reporter, la trasfezione dei substrati in cellule e l'interpretazione dei dati sono fondamentali per il successo dell'esecuzione di questi saggi. Sebbene vengano utilizzate tecniche standard di biologia molecolare per generare i substrati reporter, la visualizzazione del processo mediante elettroforesi su gel garantisce la massima qualità e purezza dei substrati prima della trasfezione. Poiché questi saggi si basano sulla trasfezione transitoria, si applicano considerazioni comuni per questi metodi. Questi includono l'ottimizzazione della densità di semina, le condizioni di trasfezione (compresi i reagenti e le quantità di DNA) e la valutazione dell'idoneità nei formati di trasfezione diretta e inversa. Questi saggi reporter sono stati eseguiti con successo con una serie di protocolli di elettroporazione e lipofezione e le opzioni devono essere esplorate a fondo prima di eseguire questi saggi. È inoltre necessario prestare attenzione a ispezionare i segnali NanoLuc e Firefly dei componenti piuttosto che solo il segnale di riparazione composito derivato dalla normalizzazione del segnale NanoLuc (substrato reporter) al segnale Firefly (controllo). Gli artefatti possono derivare dal fatto che il rapporto è guidato da cambiamenti nel segnale Firefly. Ad esempio, la valutazione dell'inibizione in modalità dose-risposta utilizzando un composto altamente specifico dovrebbe sopprimere il segnale NanoLuc in modo titolabile senza perturbare il segnale Firefly, che dovrebbe rimanere stabile (Figura 4G, H). Tuttavia, nei casi in cui i segnali Firefly sono perturbati, gli impatti utili sulla riparazione possono ancora essere determinati identificando una finestra di dose in cui il segnale Firefly non è influenzato (Figura 5).
Rispetto ai saggi reporter DSBR più utilizzati più di frequente, questi saggi reporter basati sulla luminescenza extracromosomica presentano alcuni vantaggi distinti. Poiché le vie DSBR sono altamente conservate, anche se il macchinario cellulare varia tra i modelli cellulari, i saggi possono comunque riportare la competenza DSBR e la scelta della via. Ciò apre la valutazione del DSBR a qualsiasi modello di interesse per l'utente, a condizione che le condizioni ottimali di trasfezione transitoria siano stabilite in anticipo.
L'uso della nanoluciferasi come gene reporter offre anche vantaggi rispetto alle opzioni fluorescenti, che sono state utilizzate tradizionalmente nei saggi reporter DSBR. NanoLuc è a maturazione rapida e la luminescenza viene rilevata con elevata sensibilità utilizzando un lettore di piastre8. Accoppiato alla velocità di riparazione del substrato (poiché i substrati reporter vengono trasfettati in cellule con estremità DSB pronte per la riparazione), questo formato di saggio reporter DSBR è ideale per la rapida inversione di tendenza e la robustezza quantitativa necessarie per lo screening di piccole molecole come parte di una cascata di scoperta di farmaci industriali. Infatti, abbiamo recentemente descritto l'implementazione del saggio reporter MMEJ indipendente dalla resezione nella cascata di scoperte utilizzata per l'identificazione di inibitori di piccole molecole del dominio13 della polimerasi Polθ.
C'è anche flessibilità nell'implementazione dei saggi reporter per affrontare domande specifiche sulle perturbazioni genetiche e farmacologiche del DSBR (Figura 3). Ad esempio, prima della trasfezione dei substrati reporter, le cellule possono essere trasfettate con siRNA contro un gene di interesse per 48-72 ore. In alternativa, gli effetti della sovraespressione genica sulle vie DSBR possono essere testati eseguendo la trasfezione plasmidica 24-48 ore prima della trasfezione dei substrati reporter. Per gli studi farmacologici, il presente protocollo descrive già come l'uso di piccole molecole possa essere incorporato nel flusso di lavoro standard, ma formati alternativi possono includere alterazioni nei regimi di trattamento dei composti, come pre-incubazioni o washout.
La scalabilità della trasfezione transitoria potrebbe anche supportare approcci di screening su larga scala in cui la trasfezione batch dei substrati reporter viene eseguita prima dello screening. Inoltre, la durata del test dalla trasfezione alla lettura può anche essere variata. Sebbene la durata standard possa essere di 16-24 ore, alcuni saggi possono essere letti in appena 6 oree 7. Nel determinare la durata del test devono essere prese in considerazione anche le preoccupazioni relative alla tossicità di piccole molecole o siRNA che possono compromettere la vitalità cellulare.
In sintesi, i saggi delineati in questo studio e completamente descritti in una recente pubblicazione7 forniscono una valutazione rapida e robusta della competenza DSBR cellulare. Sono altamente sensibili e titolabili, il che li rende suscettibili di studi genetici e farmacologici. Fondamentalmente, poiché i substrati reporter possono essere introdotti nelle cellule mediante trasfezione transitoria, hanno il potenziale per essere utilizzati in qualsiasi modello di cellula trasfetabile di interesse, piuttosto che essere limitati a specifiche linee cellulari da un'integrazione stabile come nel caso dei reporter DSBR cromosomici. Tuttavia, una chiara limitazione di questi saggi extracromosomici reporter è che la mancanza di integrazione nel genoma potrebbe non ricapitolare completamente il contesto fisiologico e cromatinizzato della riparazione del DNA e i suoi segnali regolatori e orchestrazione associati15. A tal fine, i saggi reporter extracromosomici sono complementari ai metodi esistenti di valutazione DSBR e ampliano il kit di risorse adatte sia per la ricerca di base che per la scoperta di farmaci.

Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) rappresentano una classe particolarmente tossica di danno al DNA1 a causa del quale le cellule hanno sviluppato più vie di riparazione DSB (DSBR) per riparare queste lesioni. I quattro principali meccanismi DSBR sono la ricombinazione omologa (HR), l'unione di estremità non omologa (NHEJ), l'unione di estremità mediata da microomologia (MMEJ) e la ricottura a filamento singolo (SSA)2,3. Le vie DSBR contribuiscono al mantenimento dello sviluppo e della fisiologia dei tessuti sani e proteggono da malattie come il cancro. Inoltre, questi meccanismi di riparazione hanno un potenziale terapeutico per lo sviluppo di modulatori di piccole molecole nell'oncologia di precisione. Ad esempio, il targeting della DNA polimerasi θ (Polθ), un enzima cardine nella via di riparazione della MMEJ, ha suscitato interesse a causa della sua letalità sintetica con deficit di HR nel cancro4.
La comprensione del DSBR ha quindi ampie implicazioni cliniche e sono necessari saggi cellulari funzionali in grado di misurare l'attività di tutte le principali vie del DSBR5. I saggi devono essere adatti sia per l'interrogazione genetica che farmacologica e possono essere distribuiti su modelli cellulari di interesse. Per supportare gli sforzi di scoperta di farmaci a piccole molecole, i saggi devono essere altamente sensibili, titolabili, avere tempi di consegna rapidi ed essere scalabili a formati ad alto rendimento adatti allo screening dei composti.
In generale, il DSBR è stato precedentemente misurato utilizzando sistemi di analisi reporter basati sulla fluorescenza integrati stabilmente nel genoma cellulare6. Tuttavia, mentre la ricapitolazione fisiologica del DSBR cromosomico è un netto vantaggio, tali saggi sono limitati a un modello ospite in cui il reporter è integrato, utilizzano la preparazione e l'analisi del campione ad alta intensità di lavoro mediante citometria a flusso e hanno una produttività, un tempo di risposta, una robustezza e una sensibilità limitati, tutte caratteristiche essenziali necessarie per gli sforzi di scoperta farmacologica.
Qui descriviamo una serie di saggi reporter DSBR che consentono la valutazione dei quattro principali percorsi DSBR. La suite di substrati per saggi reporter è descritta nella Figura 1 e ulteriormente descritta in una recente pubblicazione7. Sono extracromosomici, consentendo la loro introduzione nelle cellule mediante semplice trasfezione transitoria, e l'incorporazione di un gene reporter8 della nanoluciferasi, che deve essere ricostituito mediante l'impegno con specifici meccanismi DSBR, genera sensibilità, robustezza e scalabilità. Le seguenti varianti di substrato reporter DSBR sono incluse nel protocollo (Figura 1):
MMEJ indipendente dalla resezione: Questo substrato lineare è composto da una regione centrale di DNA a doppio filamento (dsDNA) con sporgenze di DNA a filamento singolo (ssDNA), che imitano le estremità9 del DNA resecate. Quattro microomologie nucleotidiche ai termini delle regioni dell'ssDNA codificano il codone iniziale per il gene reporter. La riparazione di questo substrato attraverso MMEJ ripristina il gene reporter open reading frame (ORF).
MMEJ dipendente dalla resezione: L'esone del gene reporter N-terminale è interrotto da un segmento contenente un codone di stop, che è affiancato da 8 microomologie di coppie di basi (bp). La resezione terminale nucleolitica è necessaria prima della riparazione mediata da MMEJ per ripristinare il gene reporter intatto.
Schietto NHEJ: Il gene reporter è suddiviso in sezioni N- e C-terminali, di cui quest'ultima è posta a monte del promotore. Il DSB è prodotto utilizzando EcoRV e richiede la legatura diretta (senza elaborazione finale) da parte di NHEJ per il ricongiungimento di entrambe le porzioni di gene reporter e il ripristino dell'ORF reporter.
NHEJ non schietto: Il DSB si trova all'interno di un introne e avrà estremità coesive o non coese a seconda della scelta dell'enzima di restrizione. La riparazione di questo substrato mediante NHEJ richiede che la legatura sia preceduta dalla lavorazione finale.
Modello lungo HR: L'esone N-terminale del gene reporter è interrotto da un segmento di DNA contenente siti di restrizione, che sostituiscono 22 bp della sequenza genica reporter originale. Per ripristinare questa sequenza, la riparazione mediante HR utilizza il modello di omologia da 2,5 kilobasi (kb) posizionato a valle dell'esone C-terminale.
Modello breve HR: Il sito di restrizione necessario per generare il DSB sostituisce parte della sequenza genica reporter nativa e introduce un codone di stop in-frame. Come la versione modello lungo, questo substrato HR richiede il modello di omologia a valle (360 bp) per una riparazione e un ripristino accurati dell'ORF reporter.
SSA: Questo substrato contiene un codone di stop prematuro situato all'interno dell'esone N-terminale del gene reporter. La rimozione di questo codone di stop e il ripristino della sequenza genica reporter intatta richiedono la riparazione mediante SSA, che comporta una resezione bidirezionale a lungo raggio prima dell'allineamento delle omologie.
Per la generazione del DSB, alcuni dei substrati reporter possono essere digeriti con I-SceI (Figura 1). Ciò genererà un substrato lineare con estremità non coese nei reporter MMEJ dipendenti dalla resezione, NHEJ non smussato, HR e SSA long template, che hanno siti I-SceI tandem in orientamenti invertiti. Nel substrato reporter HR modello corto, la digestione del singolo sito I-SceI genererà estremità coese. I plasmidi NHEJ non smussati, MMEJ resezione dipendente, HR e SSA modello lungo possono anche essere digeriti con HindIII, che produrrà estremità coesive complementari.
Forniamo protocolli per la generazione dei substrati del saggio reporter e descriviamo come possono essere eseguiti i saggi, fornendo dettagli su come possono essere utilizzati per quantificare il DSBR, comprese le risposte titolabili a piccole molecole, la valutazione della potenza cellulare, l'attività sul bersaglio e la selettività del percorso.

<table><tbody><tr><td>10x tampone TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% TBE-acrilammide</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x tampone TAE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x colorante di caricamento in gel, viola</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Piastra bianca a 96 pozzetti (con fondo e coperchio trasparenti)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Perline Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Per la purificazione a base di perline di DNA</td></tr><tr><td>fosfatasi antartica e tampone 10X</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>Lettore di piastre</td></tr><tr><td>Contatore di celle automatizzato Countess II</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi personalizzati</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ordine personalizzato</td><td>Per substrato MMEJ indipendente dalla resezione. Vedere la tabella 2.</td></tr><tr><td>Dispenser di composti D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>a base di DMSO</td></tr><tr><td>Cassetta D300e D4+ Tecan</td><td></td><td>30097371</td><td>Cassetta ad alto volume per dispenser di composti D300e</td></tr><tr><td>Cassetta T8+</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>Cassetta a basso volume per dispenser di composti D300e</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido, grado di coltura cellulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Veicolo per composti, utilizzato nella Figura 4 e Figura 5</td></tr><tr><td>DSBR reporter source plasmidi</td><td>Artios</td><td></td><td>Disponibile per la comunità accademica su richiesta&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF e 10x tampone CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Scala del DNA a bassissima gamma</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>Scala del DNA a basso peso molecolare Celle</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Esempio di linea cellulare utilizzata nel protocollo</td></tr><tr><td>HindIII-HF e 10x tampone CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Acqua di grado di biologia molecolare</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI e 10x Tango Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>Reagente e tampone JetPRIME</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Reagente di trasfezione a base di lipidi</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Centrifuga per provette da 15 o 50 mL</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>Terreno di coltura per cellule HEK-293</td></tr><tr><td>Micropiastra agitatore</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Agitatore orbitale per micropiastre</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Centrifuga per provette da 1,5 o 2 mL</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Dispenser di reagenti a base di cellule o acqua</td></tr><tr><td>MultiDrop Cassetta standard Thermo</td><td>Fisher</td><td>24072670</td><td>Cassetta per dispenser di reagenti MultiDrop</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop & Tampone Glo e substrato</td><td>Reagente Promega</td><td>N1630 o N1650</td><td>Reporter luciferasi (NanoLuc) per estinguere la luminescenza Firefly e rilevare la luminescenza NanoLuc. Parte del kit del sistema di saggio Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter</td></tr><tr><td>ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer e substrato</td><td>Promega</td><td>N1630 o N1650</td><td>Control luciferase (Firefly) reagente per rilevare Firefly. Parte del kit del sistema di analisi Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter</td></tr><tr><td>PBS (senza calcio o magnesio)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Firefly plasmide (o simile)</td><td>Promega</td><td>E1310 (o equivalente)</td><td>Firefly control plasmid</td></tr><tr><td>pNL1.1 NanoLuc plasmide (o simile)</td><td>Promega</td><td>N1091 (o equivalente)</td><td>Plasmide di controllo NanoLuc, per la regolazione delle impostazioni dell'apparecchiatura/esperimenti di ottimizzazione</td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Scala per DNA viola a caricamento rapido da 1 kb</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>Scala per DNA ad alto peso molecolare</td></tr><tr><td>Acetato di sodio (3 M), pH 5,5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Per la regolazione del pH durante l'estrazione del gel con QIAquick Kit di estrazione su gel</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Per la visualizzazione di ssDNA e dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Per la visualizzazione di dsDNA solo</td></tr><tr><td>DNA T4 Ligasi e 10x tampone Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Tripano Colorazione blu 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Per la misurazione della vitalità durante il conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA; 0,25% tripsina e 0,53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI e 10x tampone CutSmart</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione dell'attività di riparazione della rottura del doppio filamento del dna utilizzando saggi reporter ad alto rendimento e quantitativi basati sulla luminescenza

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

La riparazione delle rotture del doppio filamento del DNA (DSB) è fondamentale per il mantenimento della stabilità del genoma e della vitalità cellulare. La riparazione del DSB (DSBR) nelle cellule è mediata attraverso diversi meccanismi: ricombinazione omologa (HR), giunzione di estremità non omologa (NHEJ), giunzione di estremità mediata da microomologia (MMEJ) e ricottura a filamento singolo (SSA). I saggi cellulari sono essenziali per misurare la competenza e la modulazione di queste vie in risposta a vari stimoli.
Qui, presentiamo una serie di saggi reporter extracromosomici che misurano ciascuno la ricostituzione di un gene reporter della nanoluciferasi da parte di una delle quattro principali vie DSBR nelle cellule. Dopo la trasfezione transitoria nelle cellule di interesse, la riparazione dei substrati reporter specifici del percorso può essere misurata in meno di 24 ore mediante la rilevazione della luminescenza della nanoluciferasi (NanoLuc).
Questi robusti saggi sono quantitativi, sensibili, titolabili e suscettibili di un formato di screening ad alto rendimento. Queste proprietà forniscono ampie applicazioni nella ricerca sulla riparazione del DNA e nella scoperta di farmaci, integrando il kit di strumenti attualmente disponibile di saggi DSBR cellulari.

La riparazione di ciascuno dei saggi reporter può essere rilevata e quantificata utilizzando la stessa procedura. La corretta riparazione di un substrato attraverso la sua via di riparazione affine nelle cellule ricostituirà un ORF intatto e funzionale che codifica per NanoLuc. Questo segnale di luminescenza può essere rilevato utilizzando un lettore di piastre.
La co-trasfezione con un plasmide intatto che codifica per la luciferasi Firefly funge da controllo della trasfezione. Questo controllo ha due scopi. In primo luogo, fornisce uno standard per normalizzare il segnale NanoLuc, in quanto non dovrebbe essere influenzato dalla modulazione del DSBR con mezzi genetici o farmacologici. In secondo luogo, può fornire un'indicazione di perturbazioni cellulari fuori bersaglio che influiscono sul segnale della luciferasi, come la modulazione del ciclo cellulare, gli effetti sulla trascrizione/traduzione o la tossicità generale.
Il rapporto tra NanoLuc e Firefly funge da lettura surrogata della riparazione. I valori di luminescenza possono essere esportati e analizzati normalizzando i due segnali della luciferasi all'interno dello stesso pozzetto. Nel caso di studi di perturbazione genetica (ad esempio, confronto tra siRNA wild-type e KO o siRNA non mirati e bersaglio), la riparazione è solitamente normalizzata al campione parentale (cellule wild-type o cellule trattate con siRNA di controllo non mirato). Nel caso della modulazione farmacologica, i valori di un campione trattato con composto sono normalizzati al valore prodotto dal trattamento con veicolo.
La convalida completa della suite di reporter descritta è stata recentemente pubblicata7. I dati che esemplificano la caratterizzazione della modulazione genetica e farmacologica del DSBR sono mostrati nella Figura 4 (adattata da 7). Polθ è il mediatore chiave del MMEJ e si prevede che la perdita o l'inibizione di questo enzima ablasse specificamente il MMEJcellulare 3,10. Utilizzando una linea cellulare in cui POLQ, il gene che codifica per Polθ, è stato eliminato11, il test reporter MMEJ indipendente dalla resezione dimostra che il MMEJ è effettivamente quasi completamente soppresso. La valutazione dei segnali di luminescenza NanoLuc e Firefly mostra che il difetto di riparazione osservato è guidato da una riduzione del segnale NanoLuc (codificato dal substrato reporter) mentre il segnale Firefly (controllo) è imperturbato (Figura 4A-C). Al contrario, la valutazione della competenza NHEJ utilizzando il reporter NHEJ con estremità smussata dimostra che il knockout POLQ non inibisce la riparazione del substrato reporter (Figura 4D-F). Insieme, questi dati genetici supportano il ruolo specifico di Polθ nella riparazione mediata da MMEJ. Queste osservazioni sono completamente riassunte farmacologicamente con ART55812,13, un inibitore altamente potente e specifico del dominio polimerasi di Polθ (Figura 4G), dove si osserva un'inibizione titolabile di MMEJ, che deriva da una diminuzione specifica del segnale di NanoLuc e non del Firefly (Figura 4H). Inoltre, e in accordo con i dati genetici, non vi è alcun effetto sull'NHEJ (Figura 4I, J). Insieme, questi dati evidenziano come questi reporter possano essere utilizzati per caratterizzare la modulazione genetica delle vie DSBR e mostrare la potenza cellulare e la specificità del bersaglio/via di piccole molecole.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Figura 4: Effetti del knockout genetico e dell'inibizione farmacologica di Polθ sui segnali reporter MMEJ e NHEJ. Le cellule eHAP1 WT e POLQ(-) sono state trasfettate con un plasmide di controllo Firefly e con (A-C) il reporter MMEJ indipendente dalla resezione o (D-F) reporter NHEJ con estremità smussata. La percentuale di riparazione MMEJ o NHEJ è il rapporto tra la luminescenza di NanoLuc e la luminescenza di Firefly, normalizzata al controllo trattato con DMSO, 24 ore dopo la trasfezione. I dati rappresentano il SEM medio ± di tre repliche biologiche, ciascuna con una media di 8 repliche tecniche. Le cellule HEK-293 sono state trasfettate con un plasmide di controllo Firefly e (G,H) il reporter MMEJ indipendente dalla resezione o il reporter NHEJ con estremità smussata (I,J) e trattate con l'inibitore della polimerasi Polθ ART558. La percentuale di riparazione è il rapporto tra la luminescenza di NanoLuc e la luminescenza di Firefly, normalizzata al controllo trattato con DMSO, 24 ore dopo la trasfezione. La percentuale di inibizione dei singoli segnali di luminescenza in (G) e (I) è stata calcolata rispetto al controllo trattato con DMSO e mostrata rispettivamente in (H) e (J). I dati rappresentano il SEM medio ± di 2 repliche biologiche, ciascuna con una media di 4 repliche tecniche. Questa figura è stata adattata da Rajendra et al.7. Abbreviazioni: NanoLuc = Nanoluciferasi; MMEJ = giunzione terminale mediata da microomologia; NHEJ = giunzione di estremità non omologa; WT = tipo selvaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Figura 5: Inibizione del segnale del reporter HR da parte dell'inibitore di RAD51 CAM833. (A) Le cellule HEK-293 sono state trasfettate con il substrato reporter HR long template, un plasmide di controllo della luciferasi Firefly, e trattate con l'inibitore di RAD51 CAM83314. La luminescenza di NanoLuc e Firefly è stata letta 16 ore dopo la trasfezione. La percentuale di riparazione HR è il rapporto tra la luminescenza NanoLuc e la luminescenza Firefly, normalizzata al controllo trattato con DMSO. Le linee tratteggiate evidenziano la percentuale di inibizione HR e la concentrazione di CAM833 alla curva EC50. I dati rappresentano il SEM medio ± di 2 repliche biologiche, ciascuna con una media di 4 repliche tecniche. (B) La percentuale di inibizione dei singoli segnali di luminescenza in (A) è stata calcolata rispetto al controllo trattato con DMSO. Le linee tratteggiate evidenziano la percentuale di inibizione di NanoLuc e Firefly a 3,33 μM CAM833 (EC50). La diminuzione del segnale Firefly a concentrazioni di CAM833 ≥ 10 μM è indicativa della tossicità del composto ad alte dosi; tuttavia, la riduzione del segnale di NanoLuc è osservata a concentrazioni in cui il segnale Firefly non è influenzato, suggerendo che CAM833 induce l'inibizione della frequenza cardiaca sul bersaglio. Questa figura è stata adattata da Rajendra et al.7. Abbreviazioni: NanoLuc = Nanoluciferasi; HR = ricombinazione omologa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Substrato reporter</td>
			<td>Plasmide sorgente (dimensione in kb, resistenza)</td>
			<td colspan="3">Generazione DSB</td>
			<td>Dimensione prevista del substrato del reporter finale (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ indipendente dalla resezione</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Code resecate di 3' attraverso la legatura dei cappucci</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ resezione dipendente</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Smussato NHEJ</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Termina con l'escissione dal plasmide mediante EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ non smussato</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Modello lungo HR</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Modello breve HR</td>
			<td>9.3, Amplificatore</td>
			<td colspan="3">I-SceI (coeso)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Plasmidi del substrato reporter. Abbreviazioni: DSB = rottura a doppio filo; MMEJ = giunzione terminale mediata da microomologia; NHEJ = giunzione di estremità non omologa; HR = ricombinazione omologa; SSA = ricottura a filo singolo; Kan = kanamicina; Amp = ampicillina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Sequenza (5'-3')</td>
			<td>Fornitore</td>
			<td>Purificazione</td>
			<td>Funzione</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGINA</td>
			<td>Cappuccio sinistro, oligonucleotide lungo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGINA</td>
			<td>Tappo sinistro, oligonucleotide corto</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGINA</td>
			<td>Tappo destro, oligonucleotide lungo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGINA</td>
			<td>Tappo destro, oligonucleotide corto</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Oligonucleotidi per cappucci per la generazione di substrato reporter MMEJ indipendente dalla resezione. Abbreviazioni: ssDNA = DNA a filamento singolo; dsDNA = DNA a doppio filamento; MMEJ = giunzione terminale mediata da microomologia; PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide. Le microomologie sono sottolineate.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Saggio reporter</td>
			<td>DNA substrato reporter NanoLuc (μg DNA/1x106 cellule)</td>
			<td>Plasmide luciferasi di controllo Firefly (μg DNA/1x106 cellule)</td>
		</tr><tr><td>MMEJ indipendente dalla resezione</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>MMEJ resezione dipendente</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Smussato NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ non smussato</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Modello lungo HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Modello breve HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Quantità di DNA per la trasfezione transitoria dei substrati reporter NanoLuc e del plasmide luciferasi di controllo Firefly (HEK-293, formato piastra a 96 pozzetti). Abbreviazioni: MMEJ = giunzione terminale mediata da microomologia; NHEJ = giunzione di estremità non omologa; HR = ricombinazione omologa; SSA = ricottura a filo singolo.

Presentiamo protocolli per la valutazione della competenza del percorso di riparazione a doppio filamento di rottura nelle cellule utilizzando una suite di substrati reporter extracromosomici basati sulla luminescenza.

Valutazione dell'attività di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA utilizzando saggi reporter ad alto rendimento e quantitativi basati sulla luminescenza

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

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Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

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Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

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Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

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