Fabbricazione ed etichettatura di microbolle con traccianti fluorescenti e radioattivi

Le microbolle sono particelle sensibili agli ultrasuoni riempite di gas con capacità uniche di imaging e terapia del cancro. Le loro utility in evoluzione possono essere strategicamente avanzate costruendo microbolle tracciabili basate su applicazioni. Il nostro obiettivo è quello di facilitare questo obiettivo sviluppando un protocollo di fabbricazione di microbolle lipidiche che consenta la generazione personalizzabile di microbolle non marcate, radiomarcate, fluorescenti e multimodali.

Ottenere una radiomarcatura efficiente e stabile delle microbolle è una sfida non banale. Le microbolle lipidiche sono fragili e quindi sottoporle a calore, tempo e fasi di purificazione negli approcci di radiomarcatura post-fabbricazione può perturbare le loro proprietà fisico-chimiche e la loro stabilità. D'altra parte, la radiomarcatura prefabbricata richiede attrezzature specializzate e una maggiore esposizione alle radiazioni.

Superiamo queste sfide sviluppando un nuovo protocollo ibrido in cui la chelazione dei radioisotopi avviene prima dell'attivazione delle microbolle, ma dopo la formazione della sospensione lipidica. Questo approccio one-pot facilita per la prima volta l'etichettatura radio a microbolle ad alta efficienza e senza purificazione che preserva le proprietà chimico-fisiche delle particelle. Un ulteriore vantaggio chiave è la versatilità dei protocolli. Può essere incorporato durante la fabbricazione di microbolle personalizzate macinate e adattato a sospensioni lipidiche di microbolle preformate come quelle disponibili in commercio. Può essere applicato con successo su diverse composizioni lipidiche e chelanti a microbolle e può generare di conseguenza microbolle radioattive, fluorescenti o tribolanti su misura.

Insieme, queste proprietà consentono il tracciamento rappresentativo multimodale dei gusci lipidici delle microbolle che possono far progredire le intuizioni meccanicistiche e supportare il progresso delle terapie a ultrasuoni focalizzate sulle microbolle in molti settori, tra cui lo studio farmacocinetico delle microbolle, l'imaging multimodale, la pianificazione del trattamento e l'abilitazione di terapie sinergiche.

[Narratore] Per iniziare a utilizzare una micropipetta, aggiungere un millilitro di soluzione AA-PGG lungo i bordi del film lipidico a microbolle scelto in una fiala, evitando la formazione di bolle. Coprire parzialmente l'apertura del flaconcino con il tappo, lasciando spazio sufficiente per inserire la linea di perfluoropentano o PFP. Far scorrere PFP nello spazio di testa del flaconcino per 20 secondi sopra il liquido e tappare il flaconcino. Immergere la metà inferiore del flaconcino in un bagno d'acqua a 70-80 gradi Celsius per un minuto. Quindi sonicare la fiala per 30 secondi in bagni di sonicatore a 69 gradi Celsius. Dopo la sonicazione, pulire la fiala e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Riempire lo spazio di testa del flaconcino con gas PFP. Quindi tappare la fiala e sigillare i bordi con Parafilm. Per preparare un bagnomaria a 60 gradi Celsius in un piatto di cristallizzazione, posizionare un'ancoretta magnetica nel piatto e posizionarla su una piastra di agitazione calda a temperatura controllata. Inserire una sonda termica nell'acqua per monitorare la temperatura e regolare la velocità di agitazione per creare un imbuto debole ma visibile. Utilizzando una pinza, trasferire una fiala sigillata contenente rame 64 sotto forma di cloruro cuperico in acido cloridrico normale 0,1 in un calibratore di dosaggio. Registrare l'attività del rame 64 e l'ora. Utilizzando una pinza, rimuovere il flaconcino dal calibratore di dose e metterlo in un contenitore con piombo. Per calcolare il valore in megabecquerel per millilitro, dividere l'attività annotata sul calibratore di dose per il volume di rame 64. Stappare la sospensione lipidica e fissarla in un portafiala. Quindi stappare la fiala di rame 64, maneggiando la fiala con una pinza. Utilizzando una micropipetta, trasferire un volume di soluzione di rame 64 corrispondente a 40-250 megabecquerel di attività nella sospensione lipidica. Utilizzando una pinza piatta con punta in gomma, ruotare la sospensione lipidica radioattiva su e giù almeno cinque volte per mescolare il rame 64 nella sospensione. Mentre il flaconcino è rivolto verso l'alto, muovere delicatamente il tappo mentre si stabilizza il flaconcino. Con cautela, aprire parzialmente il flaconcino e inserire una linea PFP dotata di ago. Riempire lo spazio di testa della fiala con PFP per 20 secondi. Quindi tappare e sigillare il flaconcino con parafilm. Misurare l'attività del flaconcino utilizzando un calibratore di dose e registrare il tempo. Quindi, posizionare la fiala in un supporto per fiala di schiuma in modo che la metà inferiore della fiala sia esposta al calore. Immergere il supporto nel bagnomaria a 60 gradi Celsius e scaldare per un'ora. Nel frattempo, per preparare le strisce iTLC, tagliare la carta per cromatografia in microfibra di vetro in strisce. Scaldare le strisce in un forno di essiccazione del vetro a 80 gradi Celsius per attivarle. Dopo un'ora, togliere la fiala dal bagnomaria e pulirne i bordi con carta velina. Ruotare la fiala su e giù utilizzando una pinza con punta in gomma. Mentre il flaconcino è in posizione verticale, muovere il tappo mentre si stabilizza il flaconcino. Rimuovere il parafilm e strofinare intorno al tappo per rimuovere l'acqua intrappolata. Individuare uno o due microlitri della sospensione lipidica a un centimetro dal centro inferiore di una striscia iTLC attivata. Lascia asciugare la macchia. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 200 microlitri di eluente iTLC sul fondo di una provetta da 10 millilitri. Alloggiare il tubo in un contenitore di piombo. Aggiungere la striscia iTLC maculata al tubo e lasciarla sviluppare fino a quando l'eluente raggiunge circa un centimetro dalla parte superiore della striscia. Quindi, usando una pinza, rimuovere la striscia sviluppata e tenerla in verticale. Tagliare la striscia in terzi su tubi di plastica da cinque millilitri compatibili con il contatore gamma. Inserire i tappi a pressione nelle provette. Misurare la striscia contenente tubi e un tubo di controllo vuoto utilizzando un contatore gamma per rilevare l'attività del rame 64. Registrare i conteggi al minuto e sottrarre l'attività del tubo di controllo dalle altre letture per correggere la radiazione di fondo. Quindi calcolare la purezza radiochimica in base ai conteggi corretti al minuto. Quindi, stappare il flaconcino di sospensione lipidica radiomarcato e aggiungere 8,89 microlitri di un normale idrossido di sodio nella sospensione. Dopo aver tappato e ruotato il flaconcino, picchiettare delicatamente il flaconcino per rimuovere la sospensione intrappolata nello spazio del tappo e riempire lo spazio della testina con gas PFP. Posizionare la fiala su un agitatore meccanico e attivarla per 45 secondi a 4.530 giri/min per generare una sospensione di microbolle lattiginose. Dopo il raffreddamento passivo a temperatura ambiente, capovolgere delicatamente la fiala per risospendere la sospensione di microbolle. Posizionare la fiala su una superficie piana e attendere due minuti. Nel frattempo, equipaggiare una siringa di plastica da un millilitro con un ago calibro 18 e sfiatare la siringa aspirando e immergendo l'aria dentro e fuori. Dopo due minuti, stappare rapidamente il flaconcino e aspirare da 400 a 550 microlitri di sospensione dal fondo del flaconcino. Pulire accuratamente i bordi dell'ago e trasferire la sospensione di microbolle in una provetta da microcentrifuga. Dopo aver tappato la provetta, misurare l'attività del prodotto finale a microbolle su un calibratore di dose e annotare il tempo. Dividere il valore dell'attività per il volume decantato per ottenere l'attività in megabecquerel per millilitro. Per iniziare, aggiungere da 10 a 200 microlitri di sospensione di microbolle a un'unità filtrante da centrifuga da 0,5 millilitri e 30.000 peso molecolare in una provetta da microcentrifuga compatibile. Centrifugare la sospensione a 12.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, usa le forbici per tagliare il collegamento tra la provetta della microcentrifuga e il suo tappo. Posizionare il tappo in una fiala di scintillazione da 20 millilitri etichettata CAPS. Trasferire l'unità filtro in una nuova provetta per microcentrifuga etichettata TUBE 2. Posizionare la prima provetta per microcentrifuga contenente infranatante in una fiala a scintillazione da 20 millilitri etichettata TUBO 1. Aggiungere 200 microlitri di acqua bidistillata nell'unità filtrante del TUBO 2. Centrifugare nuovamente l'unità filtro a 12.000 G per 10 minuti. Dopo l'ultimo trasferimento dell'unità filtrante, aggiungere 200 microlitri di acqua distillata all'unità filtrante nella PROVETTA 3 e centrifugare. Dopo la centrifugazione, tagliare il tappo della provetta, aggiungendolo alla fiala di scintillazione del tappo, e trasferire l'unità filtrante in una nuova fiala di scintillazione da 20 millilitri etichettata UNIT. Posizionare la PROVETTA 3 in una nuova fiala di vetro scintillante da 20 millilitri. Tappare le cinque fiale di scintillazione e preparare una fiala di scintillazione vuota e tappata come controllo in bianco. Misurare le sei fiale di scintillazione su un contatore gamma per rilevare l'attività del rame 64. Sottrarre il controllo del bianco dalle altre misurazioni della fiala. Calcola l'efficienza della marcatura radio o della chelazione.