Name: Fabbricazione ed etichettatura di microbolle con traccianti fluorescenti e radioattivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri la fabbricazione di microbolle lipidiche con marcatura radioattiva e fluorescente per imaging oncologico. Questo metodo one-pot garantisce efficienza superiore al 95% senza purificazione.

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Le microbolle sono agenti teranostici supramolecolari di dimensioni micron con un nucleo gassoso stabilizzato da una proteina, un polimero o, nella maggior parte dei casi, un guscio lipidico (Figura 1A). Quando iniettate nel flusso sanguigno, le microbolle mantengono interfacce gas/liquido rilevabili dagli ultrasuoni per periodi di tempo di pochi minuti prima della dissoluzione dei loro nuclei di gas 1,2. Di conseguenza, il primo uso clinico delle microbolle è stato come agenti di contrasto per l'imaging a ultrasuoni in tempo reale3. L'invenzione degli ultrasuoni focalizzati terapeutici (FUS) ha ampliato le utilità cliniche delle microbolle. Quando stimolate da FUS a bassa frequenza, le microbolle oscillano e generano forze meccaniche mirate e regolabili che vanno dalla permeabilizzazione vascolare transitoria all'ablazione del tessuto focale 4,5. Di conseguenza, negli ultimi 20 anni, la microbolla-FUS è stata esplorata per l'apertura della barriera emato-encefalica (BBB), la somministrazione di farmaci per tumori (ad es. cancro metastatico al pancreas, al cervello e al fegato) e la somministrazione di sonde di imaging, la terapia delle malattie neurodegenerative e l'ablazione del cancro 6,7,8,9,10,11.
L'arsenale teranostico delle microbolle continua ad avanzare in nuove ed entusiasmanti direzioni. Le applicazioni convenzionali di somministrazione di microbolle-FUS si basano sulla co-somministrazione di carichi terapeutici o di imaging insieme a microbolle commerciali. C'è un crescente interesse nel migliorare le capacità di erogazione di microbolle-FUS comprendendo le interazioni tra guscio di microbolle e biologiche, esplorando formulazioni di microbolle non commerciali su misura e generando microbolle teranostiche all-in-one con carico caricato direttamente sul guscio di microbolle 12,13,14. Infatti, circa il 40% degli studi sulla somministrazione di farmaci con microbolle lipidiche fa uso di tali microbolle caricate con guscio15. Oltre all'imaging e alla somministrazione di farmaci, la microbolla-FUS si è dimostrata promettente anche nel migliorare la radioterapia del cancro16 e nell'attivare gli effetti antineoplastici di agenti altrimenti benigni caricati con guscio attraverso la terapia sonodinamica17,18.
Queste direzioni convenzionali ed estese nelle applicazioni del cancro con microbolle possono essere avanzate in modo più strategico etichettando i gusci delle microbolle con traccianti radioattivi. Nell'ambito delle microbolle all-in-one caricate con carico, tale radiomarcatura 1) facilita la valutazione quantitativa gold standard della biodistribuzione on e off-target di questi gusci di microbolle caricati, 2) ricava relazioni farmacocinetiche struttura-attività che informano la selezione ottimale delle composizioni delle microbolle per massimizzare la consegna on-target e 3) guida l'applicazione strategica e appropriata guidata da immagini e la pianificazione del trattamento (ad esempio, tipi di bersagli tissutali, Dosimetria, selezione dei farmaci per mitigare i problemi di sicurezza fuori bersaglio, utilità rispetto ai paradigmi di co-trattamento convenzionali) di sistemi all-in-one caricati con carico15,19. In una fase preclinica, una tale comprensione del destino della conchiglia delle microbolle può anche illuminare meccanismi d'azione più ampi delle microbolle-FUS. Ad esempio, è stato dimostrato che il trasferimento di lipidi dai gusci delle microbolle alle cellule bersaglio influenza la sonoporazione abilitata da FUS12,20. La comprensione e l'ottimizzazione di tale trasferimento possono quindi informare le terapie precliniche e cliniche con microbolle-FUS in cui è implicata la sonoporazione (trasfezione in vitro, somministrazione di farmaci, ablazione tumorale, sensibilizzazione alle radiazioni e terapia sonodinamica 20,21,22,23,24,25). Le doppie strutture a ultrasuoni e radioimmagini consentirebbero inoltre l'apertura dei vasi FUS e il monitoraggio del trattamento (ad esempio, la cinetica di apertura della BEE) da un singolo agente piuttosto che dai tradizionali progetti a doppio agente26. Allo stesso modo, la radiomarcatura con microbolle lipidiche potrebbe fungere da alternativa all-in-one all-in-one a microbolle-FUS/radioterapia a microbolle-FUS + piattaforme di co-somministrazione radiofarmaceutica27.
La fragilità delle microbolle è una sfida non banale per tale etichettatura. Tutte le strategie di radiomarcatura esistenti sono limitate da metodologie di purificazione note per perturbare la stabilità e le dimensioni delle microbolle, mentre alcune presentano anche una radiomarcatura inefficace e instabile 28,29,30,31,32. I requisiti di purificazione portano anche a protocolli più lunghi. In combinazione con l'uso di radioisotopi a vita breve (ad esempio, 18F t1/2 1.8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31), ciò crea inefficienze legate al decadimento dei radioisotopi e limita i tempi di radioimaging e pianificazione del trattamento. Collettivamente, queste limitazioni rischiano l'acquisizione di radioimmagini abbreviate e non rappresentative, dati farmacocinetici imprecisi e un'inefficiente somministrazione di radioisotopi tumorali.  
In questo rapporto, queste limitazioni vengono superate sfruttando le capacità di chelazione dei metalli forti e stabili della porfirina. Le porfirine sono macromolecole organiche eterocicliche con un anello planare altamente coniugato e un sito di coordinazione centrale che può ospitare una varietà di metalli. Ciò include radioisotopi a vita più lunga come il rame-64 (t1/2 12,7 h), un radiofarmaco con tomografia a emissione di positroni (PET) e la fattibilità del conteggio dei γ33. Quando coniugate a una spina dorsale lipidica, le porfirine possono essere facilmente incorporate in strutture supramolecolari e successivamente marcate con rame-64 con velocità, alta efficienza chelante e stabilità sierica, mantenendo le proprietà delle particelle madri non marcate 33,34. Inoltre, le porfirine sono fluorescenti attive con auto-estinzione modulare in nano e microparticelle che viene ripristinata dopo la rottura delle particelle; una lettura complementare alla PET e al conteggio dei γ che facilita l'analisi del destino sia della massa che del microscopico del guscio (Figura 1A)15.
Utilizzando il lipide porfirina come chelante, queste proprietà sono state sfruttate per generare una nuova metodologia di radiomarcatura a microbolle one-pot, priva di purificazione (Figura 1B, C) che supera i limiti associati ai metodi di radiomarcatura a microbolle esistenti. Questo protocollo raggiunge un'efficienza di chelazione del rame-64 del &gt;95%, non richiede la purificazione post-marcatura e preserva le proprietà fisico-chimiche delle microbolle. Può essere facilmente integrato nella fabbricazione "da zero" di microbolle lipidiche prima della loro attivazione (Figura 1B). È versatile e può essere applicato con successo in formulazioni di microbolle personalizzate e commerciali con diverse lunghezze della catena lipidica acilica (da C16 a C22), carica (neutra e anionica) e composizioni di porfirina-lipidi (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%), generando microbolle con attività sia radio che di fluorescenza. La sua adattabilità può estendersi anche oltre la porfirina. Il protocollo one-pot può essere modificato per utilizzare chelanti alternativi disponibili in commercio (ad esempio, dietilentriammina pentaacetato (DTPA)-lipidi) e fluorofori (ad esempio, DiI). Può anche essere modificato per etichettare formulazioni di microbolle preconfezionate attraverso un approccio "spiking". Di conseguenza, questo metodo consente la produzione di microbolle su misura, tracciabili (radio, fluorescenti o dual radio/fluorescent active) utili per far progredire le applicazioni meccanicistiche, di imaging e terapeutiche di microbolle-FUS. Il protocollo seguente delinea la fabbricazione di microbolle lipidiche, l'applicazione del protocollo di radiomarcatura one-pot, la radiomarcatura richiesta e la caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche e le potenziali modifiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg"> 
Figura 1: Fabbricazione di microbolle e protocollo di radiomarcatura. (A) Il porfirina-lipide, sotto forma di pirofeoforbide-a-lipide, funge da chelante multimodale all'interno di questo protocollo. Come monomero chelato a rame-64 (i), ha capacità di PET e di imaging. La sua fluorescenza viene spenta sotto forma di particelle (microbolle (ii) e la loro nanoprogenie post-dissoluzione (iii)) e non spenta con disgregazione particellare (iv). (B) protocollo di idratazione/attivazione del film lipidico descritto in questo rapporto per generare microbolle lipidiche dal basso e (C) integrazione della radiomarcatura one-pot tra la formazione di sospensioni lipidiche e l'attivazione di microbolle. Questa figura è stata adattata con il permesso di Rajora et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of Radiology</td><td>N/A Ordine</td><td>in piccolo volume (< 10 &micro; L) disciolto in 0,1 N HCl</td></tr><tr><td>Acido acetico&nbsp;</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>&ge; Purezza del 95%</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Purezza: &ge; 98%</td></tr><tr><td>Bilancia - analitica</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>In grado di misurare fino a 0,1 mg</td></tr><tr><td>Sonicatore da bagno</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Può essere riscaldato a 69 oC</td></tr><tr><td>Apertura CC - 30 micron</td><td>Beckman Coulter</td><td>A36391</td><td>Gamma di diametri delle particelle: 0,6-18 um</td></tr><tr><td>CC elettrolita</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td>diluente Isoton II</td></tr><tr><td>CC Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti per centrifuga (0,5 mL 30.000 MWCO) con provette per microcentrifuga compatibili</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0,5 mL</td></tr><tr><td>Provette per centrifuga - 15 mL con tappi</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Purezza: &ge; 99,8%&nbsp;</td></tr><tr><td>Contatore di coltri</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e Contatore di coulter Vetrini</td></tr><tr><td>di copertura</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td>VWR micro vetro</td></tr><tr><td>di copertura CuCl2</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Garantire che non sia ossidato</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette - quarti, 1 cm di lunghezza del percorso</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette - 10 mL di plastica per misurazioni CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A35471</td><td>Coulter Counter Accuvette ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Può essere ottenuto attraverso un sistema di purificazione dell'acqua ultrapura</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-Diottadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindocarbocianina Perclorato)</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Forma in polvere</td></tr><tr><td>Calibratore di dose</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>In grado di leggere il rame-64</td></tr><tr><td>DPPA (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (sale sodico))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>Polvere DPPC</td></tr><tr><td>(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-5000] (sale di ammonio))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>DTPA-lipidi (acido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-dietilentriamminapentaacetico (sale di ammonio))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>Polvere sotto forma</td>di</tr><tr><td>EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore gamma</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>In grado di leggere</td></tr><tr><td>i tappi a pressione della provetta per conteggio gamma</td> rame-64 <td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>Flangiato tappi per provette da 12 mm</td></tr><tr><td>Provette per conteggio gamma</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>Becher in vetro - 250 mL</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>In grado di resistere a temperature fino a 100 oC</td></tr><tr><td>Forno di essiccazione del vetro</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Può essere riscaldato a 80 oC</td></tr><tr><td>Siringhe da microlitri in vetro - 25, 50, 100, 1000 &micro; L</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Compatibile con solventi organici Fiale</td></tr> di <tr><td>vetro a scintillazione - 20 mL</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg; Fiale a scintillazione, vetro borosilicato, con tappo a vite, con rivestimento in lamina di polpa</td></tr><tr><td>Fiale in vetro - 0,5 dram</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>VWR Fiala 1/2 dram, con tappo a vite fenolico nero e rivestimento in polpa con rivestimento in polivinile</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td>Purezza:&nbsp; &ge; 99.0%&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetta/pistola graduata</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td> calda/agitazione <td>Dotata di sensore di temperatura per il controllo automatico della temperatura</td></tr><tr><td>Acido cloridrico - 0,1 N</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre iTLC</td><td>Agilent</td><td>A120B12</td><td>&nbsp; Carta per cromatografia iTLC-SA</td></tr><tr><td>Tessuti da laboratorio</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione a vuoto Media</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Dimensione dei pori di 0,22 micron, membrana in PES, capacità dell'imbuto di 500 mL</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Purezza:&nbsp; &ge; 99,8%, grado HPLC, soddisfa le specifiche ACS</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga non sterili - 1,5 mL</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga sterili - 1,5 mL</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipete - p1000, p200, p20, p10</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Assicurarsi che siano calibrati</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Vetrini per microscopio Superfrost Plus Aghi prepuliti</td></tr><tr><td>- 18 G</td><td></td><td></td><td>Parafilm sterile</td></tr><tr><td></td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS, modificato, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>Purezza:&nbsp; &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Linea PFP Qualsiasi</td><td>azienda</td><td></td><td>Tubo flessibile in plastica da 1/4 di pollice di diametro tagliato circa 50 cm di lunghezza</td></tr><tr><td>Regolatore PFP</td><td>Swagelok</td><td>SS-1RF4 e SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard di pH 4 e 7</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette per p1000, p200, p10 - non sterili</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette per p1000, p200, p10 - sterili</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa in plastica - 1 mL</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Sterile Glicole</td></tr> <tr><td></td><td>propilenicoBioShop</td><td>PRO888.500</td><td>Purezza:&nbsp; &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Piro-lipidico</td><td>N/A</td><td></td><td>Prodotto internamente</td></tr><tr><td>Pinze con punta in gomma</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Si consiglia un mix di bordi a punta fine e piatti/quadrati</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio - 1 N</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio - 10 N</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>In grado di erogare un'eccitazione di 410 nm e un'emissione di 600-850 nm</td></tr><tr><td>Software per spettrofluorimetria</td><td>Spettrometro Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa - 1 mL</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Monouso, plastica, sterile</td></tr><tr><td>Filtri per siringa - 0,2 micron di dimensione dei pori</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Materiale della membrana: PES o altro compatibile con acetato di ammonio/acido acetico e provetta PBS</td></tr><tr><td>- 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore a vuoto/vuoto</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>Indicato nel protocollo come agitatore meccanico per fiale</td></tr><tr><td>Pesare carta</td><td>Qualsiasi azienda</td><td></td><td>Per evitare di perdere il prodotto, si consiglia di tagliare la carta pesata in quadrati di 3x3 cm</td></tr></tbody></table>

fabbricazione ed etichettatura di microbolle con traccianti fluorescenti e radioattivi

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

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Fabbricazione ed etichettatura di microbolle con traccianti fluorescenti e radioattivi

Microbubbles are lipid-shelled, gas-filled particles that have evolved from vascular ultrasound contrast agents into revolutionary cancer therapy ...

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